JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем три протокола анализа данных для флуоресцеиновой ангиографии (FA) и изображений оптической когерентной томографии (OCT) в исследовании окклюзии вен сетчатки (RVO).

Аннотация

Достижения в области инструментов офтальмологической визуализации предлагают беспрецедентный уровень доступа к исследователям, работающим с животными моделями нейрососудистых повреждений. Чтобы должным образом использовать эту большую переводимость, необходимо разработать воспроизводимые методы извлечения количественных данных из этих изображений. Оптическая когерентная томография (ОКТ) может разрешить гистологию сетчатки при микрометровом разрешении и выявить функциональные различия в сосудистом кровотоке. Здесь мы очерчиваем неинвазивные сосудистые показания, которые мы используем для характеристики патологического повреждения после сосудистого инсульта в оптимизированной мышиной модели окклюзии вен сетчатки (RVO). Эти показания включают анализ морфологии сетчатки в реальном времени, измерение дезорганизации внутренних слоев сетчатки (DRIL) капиллярной ишемии и флуоресцеиновую ангиографию отека сетчатки и плотности сосудов. Эти методы напрямую соответствуют тем, которые используются для обследования пациентов с заболеваниями сетчатки в клинике. Стандартизация этих методов позволяет проводить прямое и воспроизводимое сравнение моделей животных с клиническими фенотипами офтальмологических заболеваний, увеличивая поступательную силу моделей сосудистых повреждений.

Введение

Нейрососудистые заболевания являются основной проблемой здравоохранения, ответственной за ишемические инсульты, ведущую причину смертности и заболеваемости, а также сосудистые заболевания сетчатки, которые приводят к потере зрения 1,2. Для моделирования нейрососудистых заболеваний мы используем мышиную модель окклюзии вен сетчатки (RVO). Эта модель является неинвазивной и использует методы визуализации in vivo, аналогичные тем, которые используются для обследования людей с сосудистыми заболеваниями сетчатки в клинических условиях. Таким образом, использование этой модели увеличивает трансляционный потенциал исследований, использующих эту модель. Как и во всех моделях мыши, крайне важно максимизировать воспроизводимость модели.

Сосудистые заболевания сетчатки являются основной причиной потери зрения у людей в возрасте до 70 лет. RVO является вторым наиболее распространенным сосудистым заболеванием сетчатки после диабетической ретинопатии3. Клинические признаки, характерные для RVO, включают ишемическое повреждение, отек сетчатки и потерю зрения как следствие потери нейронов 3,4. Мышиные модели RVO с использованием лазерной фотокоагуляции крупных сосудов были разработаны и усовершенствованы для воспроизведения ключевых клинических патологий, наблюдаемых у человека RVO 5,6,7. Достижения в области офтальмологической визуализации также позволяют воспроизводить неинвазивные диагностические инструменты, используемые у людей, а именно флуоресцеиновую ангиографию (ФА) и оптическую когерентную томографию (ОКТ)6. Флуоресцеиновая ангиография позволяет наблюдать утечку из-за разрушения гемато-ретинального барьера (BRB), а также динамику кровотока в сетчатке, включая участки окклюзии, с помощью инъекции флуоресцеина, небольшого флуоресцентного красителя 8,9. OCT-визуализация позволяет получать изображения с высоким разрешением поперечного сечения сетчатки и изучать толщину и организацию слоев сетчатки10. Анализ изображений ФА исторически был в значительной степени качественным, что ограничивает потенциал для прямого и воспроизводимого сравнения между исследованиями. В последнее время был разработан ряд методов количественной оценки толщины слоя в OCT-визуализации, хотя в настоящее время не существует стандартизированного протокола анализа, а место получения изображений OCT варьируетсяна 11. Чтобы правильно использовать эти инструменты, необходима стандартизированная, количественная и воспроизводимая методология анализа данных. В этой статье мы представляем три таких сосудистых считывания, используемых для оценки патологического повреждения в мышиной модели утечки RVO-флуоресцеина, толщины слоя OCT и дезорганизации слоев сетчатки.

протокол

Этот протокол следует заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Эксперименты на грызунах были одобрены и контролировались Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Колумбийского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация была сделана на 2-месячных самцах мышей C57BL/6J, которые весили примерно 23 г.

1. Подготовка реагентов для визуализации сетчатки

  1. Приготовление инъекционного флуоресцеинового раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцеин очень светочувствительный. Защитите от света и используйте его вскоре после приготовления.
    1. Разбавляют флуоресцеин до концентрации 1% в стерильном физиологическом растворе.
  2. Препарат кетамина/ксилазина
    1. Разбавляют кетамин и ксилазин в стерильном физиологическом растворе соответственно для следующей концентрации: кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазин (5-10 мг/кг).
  3. Стерильный физиологический раствор
    1. Приготовьте шприц объемом 5 мл с иглой 26 г со стерильным физиологическим раствором.

2. Визуализация ОКТ и флуоресцеина

  1. Включите лайтбокс микроскопа визуализации сетчатки, машину OCT и платформу мыши с подогревом.
  2. Включите компьютер и откройте программу создания образов.
  3. Добавьте по одной капле фенилэфрина и тропикамида в каждый глаз.
  4. Вводят 150 мкл анестезии (кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазин (5-10 мг/кг)) внутрибрюшинно (ИП). Определите глубину анестезии по щелчку пальца ноги и подождите, пока животное перестанет реагировать. Нанесите офтальмологическую мазь или искусственные слезы на оба глаза.
  5. Разместите мышь на платформе.
  6. Отрегулируйте высоту и угол наклона платформы до тех пор, пока вид глазного дна сетчатки не станет четким и сфокусированным. Сфотографируйте глазное дно.
  7. Откройте программное обеспечение для создания образов и центра развертывания Office. В программе центра развертывания Office отрегулируйте подталкивание на 5.
  8. Сделайте изображение OCT на расстоянии 75 мкм от ожога. Повторите для трех других квадрантов сетчатки.
  9. Вводят 100 мкл 1% флуоресцеина IP.
  10. Переключите камеру на фильтр 488 нм. Увеличьте коэффициент усиления камеры до 5.
  11. Сделайте снимок глазного дна ровно через 5 мин после инъекции флуоресцеина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте длительного воздействия на глаз света камеры при максимальной настройке, так как флуоресцеин может усугубить фотоповреждения сетчатки. Держите источник света выключенным до тех пор, пока не истечет 5-минутное время ожидания и мышь не будет готова к визуализации.

3. Последующий уход

  1. Вводят 1 мл стерильного физиологического раствора IP. Нанесите смазочные глазные капли на оба глаза. Нанесите офтальмологическую мазь или искусственные слезы на оба глаза.
  2. Понаблюдайте за мышью, когда она восстанавливается после анестезии. Возвращение в клетку с другими животными только после полного выздоровления, как правило, примерно через 40 минут.

4. Оценка по критериям исключения

  1. Откройте снимок глазного дна, сделанный через 24 часа после процедуры, чтобы оценить критерии исключения. Исключите глаз, если определен любой из следующих критериев.
  2. Оцените, имеет ли изображение нулевую окклюзию
    1. Оцените изображение по количеству закупоренных сосудов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная окклюзия обычно имеет некоторую фиолетовую пигментацию на ожоге или вокруг него, очень тонкий или прерывистый сосуд через ожог, слабый или несуществующий вид сосуда за пределами области ожога и обесцвечивание сетчатки от гипоксии. Если весь сосуд можно увидеть сквозь белый ожог лазером, сосуд не смог заткнуться. Иногда сосуд будет казаться частично закупоренным, но если он выглядит непрерывным за пределами ожога, сосуд, вероятно, не закрылся.
    2. Для неоднозначных случаев используйте визуализацию ФА в то же время для оценки окклюзий. На этих изображениях окклюзия будет выглядеть как разрыв в непрерывности сосуда, часто с сужением окружающего сосуда.
    3. Если выявлены нулевые окклюзии, исключите глаз из анализа, так как РВО считается неэффективным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окклюзии обычно разрешаются через 48-72 ч после RVO, и наличие окклюзий больше не должно использоваться в качестве критерия исключения в эти моменты времени.
  3. Оценка изображений глазного дна и ОКТ на предмет чрезмерной отслойки сетчатки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Накопление субретинальной жидкости распространено после индукции RVO и вызывает отделение нервной сетчатки от RPE. Исключающие критерии чрезмерной отслойки сетчатки определяются следующим образом: ОКТ либо будет полностью невидимым, либо некоторые слои будут казаться невероятно искаженными. Качество изображения низкое, с потерей разрешения внешних плексиформных и RPE слоев. Расстояние между нервной сетчаткой и сосудистой оболочкой больше, чем позволяет поле зрения OCT. На изображении глазного дна тон сетчатки будет почти полностью белым, с некоторыми фиолетовыми пятнами. Часть сетчатки может казаться искаженной и не в фокусе. Это связано с тем, что он отделился и находится на другом фокусном расстоянии, чем остальная часть сетчатки.
    1. Если оценка изображений с глаза определяет периферическое или полное отслоение сетчатки, исключите глаз из анализа.
  4. Исключить изображения с признаками катаракты роговицы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Катаракта роговицы выглядит как непрозрачная белая точка на роговице мыши. Катаракта обычно возникает из-за недостаточной смазки глаз, пока животное подвергается анестезии, и его можно в значительной степени избежать, позаботившись о том, чтобы щедро наносить глазную мазь. Катаракта, как правило, может быть идентифицирована перед визуализацией путем осмотра животного. Мыши, у которых развилась катаракта, должны быть исключены из набора данных без необходимости проходить процесс визуализации. При визуализации катаракта будет скрывать сетчатку от камеры, и OCT будет казаться искривленным.
  5. Оцените изображение на предмет чрезмерного кровоизлияния
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное кровоизлияние может быть идентифицировано как количество красной жидкости на изображении, обычно скрывающее фон сетчатки, сосуд и ожог. Эти области красной жидкости будут более яркими, непрозрачными красными, чем фиолетовые пятна, которые являются нормальными при успешном RVO. Кровоизлияния проявляются в ганглиозном клеточном слое на ВИЗУАЛИЗАЦИИ OCT и мешают способности визуализировать другие слои сетчатки под кровоизлиянием.
    1. Если на изображении установлено чрезмерное кровоизлияние, исключите глаз из анализа.

5. Обработка изображений флуоресцеином

  1. Откройте флуоресцеиновое изображение в программном обеспечении для обработки изображений.
  2. Дублирование изображения
  3. Используя инструмент выделения, тщательно проследите основные сосуды.
    1. Основными сосудами являются более толстые вены и артерии, исходящие из диска зрительного нерва. Игнорируйте любые суда, ответвляющиеся от этих судов.
    2. Если утечка не позволяет контуру сосуда быть замеченным вблизи места окклюзии, проследите утечку в приблизительном месте сосуда (поддерживайте толщину, соедините последнюю видимую точку со следующей видимой точкой).
  4. На первом изображении удалите выделенную область, оставив только фон. Сохраните это замаскированное изображение.
  5. Переместите выделенную область на второе изображение, инвертируйте выделенную область и удалите, изолировав сосуды. Сохраните это замаскированное изображение.
  6. Откройте два изображения в ImageJ. Откройте фоновое изображение и измерьте встроенную плотность.
  7. Откройте изображение сосуда, выберите контур сосудов, а затем измерьте среднюю интенсивность.
  8. Разделите интегральную плотность фона на среднюю интенсивность сосудов, создав коэффициент утечки для глаза.
  9. Запишите этот коэффициент утечки для каждого глаза в экспериментальной когорте.
  10. Для дальнейшего контроля за фоном нормализуйте экспериментальные глаза до среднего коэффициента утечки неповрежденных контрольных глаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы создать стандартизированную количественную оценку утечки флуоресцеина в изображении FA, этот расчет использует отношение плотности фона (где утечка будет присутствовать) с яркостью основных сосудов для создания результатов, которые контролируют изменение яркости от изображения к изображению и могут быть надежно количественно определены. Глаза, которые не повреждены, не имеют утечки и теоретически должны иметь нулевые соотношения. Таким образом, коэффициенты, рассчитанные из этих неповрежденных контрольных глаз, представляют собой фоновый шум, и это значение используется для дальнейшей нормализации экспериментальных значений.

6. Толщина слоя сетчатки

  1. Откройте изображение центра развертывания Office в программном обеспечении для обработки изображений.
  2. Проследите границы слоя ганглиозных клеток, внутреннего плексиформного слоя, внутреннего ядерного слоя, наружного плексиформного слоя, слоя фоторецепторов и слоя RPE. Измерьте среднюю толщину каждого слоя.
  3. Повторите для изображений OCT из трех других квадрантов сетчатки. Усредните среднюю толщину слоя по четырем квадрантам, чтобы получить среднюю толщину каждого слоя сетчатки для глаза.
  4. Повторить для каждого глаза в экспериментальной когорте.

7. Дезорганизация внутренних слоев сетчатки (ДРИЛ)

  1. Откройте изображение центра развертывания Office в ImageJ.
  2. С помощью инструмента «Линия» измерьте расстояние, на котором верхняя граница внешнего плексиформного слоя нечеткая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно различать DRIL и области плохой видимости слоя, вызванные артефактами визуализации. Низкое качество изображения OCT может сделать невозможным анализ DRIL, если достаточное разрешение изображения невозможно. Изображения с DRIL, как правило, имеют другие области или слои сетчатки, которые четко разрешены и организованы, что может быть хорошим показателем достаточного качества изображения.
    1. Измерьте горизонтально от широты, где начинается дезорганизация, до широты, где верхняя граница внешнего плексиформного слоя снова становится видимой, если вообще видна. Даже если внешний плексиформный слой смещается вверх или вниз по вертикали, измеряйте идеально горизонтально.
    2. Может быть несколько областей дезорганизации, разделенных областями без дезорганизации. Измерьте их по отдельности и рассчитайте сумму расстояний.
  3. Разделите длину дезорганизации на общую длину сетчатки, видимой на каждом изображении OCT, чтобы получить соотношение дезорганизации для изображения.
  4. Повторите измерение и расчет для изображений OCT из трех других квадрантов сетчатки.
  5. Возьмем среднее значение соотношения дезорганизации из четырех изображений OCT. Это число представляет собой среднюю дезорганизацию для всей сетчатки. Повторить для каждого глаза в экспериментальной когорте.

Результаты

Эти методы анализа позволяют количественно оценить патологию сетчатки, захваченную визуализацией FA и OCT. В экспериментах, из которых извлекаются репрезентативные данные, использовали самцов мышей C57BL/6J, которые либо служили в качестве неповрежденных контрольных органов, либо проходил...

Обсуждение

Неинвазивная визуализация сетчатки грызунов представляет собой путь для изучения патологии и разработки вмешательств. Предыдущие исследования разработали и оптимизировали мышиную модель RVO, ограничивающую изменчивость и позволяющую достоверно транслировать распространенные клин?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом DGE - 1644869 (CKCO), Национальным институтом глаз (NEI) 5T32EY013933 (для AMP), Национальным институтом глаз (NEI) 5T32EY013933 (для AMP), Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (RO1 NS081333, R03 NS099920 для CMT) и Министерством обороны армии / военно-воздушных сил (DURIP to CMT).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AK-Fluor 10%AkornNDC: 17478-253-10light-sensitive
CarprofenRimadylNADA #141-199keep at 4 °C
GenTealAlcon00658 06401
Image JNIH
InSight 2DPhoenix Technology GroupOCT analysis software
Ketamine HydrochlorideHenry ScheinNDC: 11695-0702-1
PhenylephrineAkornNDCL174478-201-15
Phoenix Micron IVPhoenix Technology GroupRetinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian ModulePhoenix Technology GroupLaser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography ModulePhoenix Technology GroupOCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix ModulePhoenix Technology GroupFundus imaging and acquisition targeting
PhotoshopAdobe
RefreshAllergan94170
TropicamideAkornNDC: 174478-102-12
XylazineAkornNDCL 59399-110-20

Ссылки

  1. Tong, X., et al. The burden of cerebrovascular disease in the united states. Preventing Chronic Disease. 16, 180411 (2019).
  2. Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles. Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).
  3. Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature. Retina. 33 (5), 901-910 (2013).
  4. Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment. Retina. 36 (3), 432-448 (2016).
  5. Zhang, H., et al. Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization. Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).
  6. Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion. PLoS One. 10 (3), 0119046 (2015).
  7. Fuma, S., et al. A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model. Scientific Reports. 7, 43509 (2017).
  8. Cavallerano, A. Ophthalmic fluorescein angiography. Clinical Optometry. 5 (1), 1-23 (1996).
  9. Laatikainen, L. The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).
  10. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  11. Oberwahrenbrock, T., et al. Reliability of intra-retinal layer thickness estimates. PLoS One. 10 (9), 0137316 (2015).
  12. Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
  13. Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980 (2021).
  14. Schmidt-Erfurth, U., et al. Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA). Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).
  15. Yoshimura, T., et al. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4 (12), 8158 (2009).
  16. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  17. Hui, F., et al. Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye. PLoS One. 9 (11), 111330 (2014).
  18. Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion. Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).
  19. Nicholson, L., et al. Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy. Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).
  20. Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. Diabetic cataracts: mechanisms and management. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).
  21. Hegde, K., Henein, M., Varma, S. Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts. Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).
  22. Takahashi, H., et al. Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation. Heliyon. 7 (1), 05902 (2021).
  23. Haj Najeeb, B., et al. Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).
  24. Alam, M., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy. Retina. 40 (2), 322-332 (2020).
  25. Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO). Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).
  26. Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization. Frontiers in Neuroscience. 15, 734860 (2021).
  27. Park, J., et al. Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography. Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331 (2016).
  28. Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis. PLoS One. 8 (5), 63904 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены