Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Zusammenfassung

Hier stellen wir drei Datenanalyseprotokolle für Fluorescein-Angiographie (FA) und optische Kohärenztomographie (OCT) Bilder in der Studie der Netzhautvenenokklusion (RVO) vor.

Zusammenfassung

Fortschritte bei ophthalmologischen Bildgebungswerkzeugen bieten Forschern, die mit Tiermodellen für neurovaskuläre Verletzungen arbeiten, einen beispiellosen Zugang. Um diese bessere Übersetzbarkeit richtig zu nutzen, müssen reproduzierbare Methoden entwickelt werden, um quantitative Daten aus diesen Bildern zu ziehen. Die optische Kohärenztomographie (OCT) kann die Netzhauthistologie mit Mikrometerauflösung auflösen und funktionelle Unterschiede im vaskulären Blutfluss aufdecken. Hier beschreiben wir nichtinvasive Gefäßanzeigen, die wir verwenden, um pathologische Schäden nach vaskulärer Beleidigung in einem optimierten Mausmodell des Netzhautvenenverschlusses (RVO) zu charakterisieren. Diese Auslesungen umfassen Live-Bildgebungsanalysen der Netzhautmorphologie, Disorganisation der retinalen inneren Schichten (DRIL) zur Messung der Kapillarischämie und Fluoreszenzangiographiemessungen des Netzhautödems und der vaskulären Dichte. Diese Techniken entsprechen direkt denen, die zur Untersuchung von Patienten mit Netzhauterkrankungen in der Klinik verwendet werden. Die Standardisierung dieser Methoden ermöglicht einen direkten und reproduzierbaren Vergleich von Tiermodellen mit klinischen Phänotypen ophthalmologischer Erkrankungen und erhöht die Translationskraft von Gefäßverletzungsmodellen.

Einleitung

Neurovaskuläre Erkrankungen sind ein großes Gesundheitsproblem, das für ischämische Schlaganfälle, eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität, und retinale Gefäßerkrankungen, die zu Sehverlust führen, verantwortlich^{ist 1,2}. Um neurovaskuläre Erkrankungen zu modellieren, verwenden wir ein Mausmodell des Netzhautvenenverschlusses (RVO). Dieses Modell ist nicht-invasiv und verwendet ähnliche In-vivo-Bildgebungstechniken wie diejenigen, die zur Untersuchung von Menschen mit retinalen Gefäßerkrankungen in einem klinischen Umfeld verwendet werden. Die Verwendung dieses Modells erhöht somit das translationale Potenzial von Studien, die dieses Modell verwenden. Wie bei allen Mausmodellen ist es wichtig, die Reproduzierbarkeit des Modells zu maximieren.

Netzhaut-Gefäßerkrankungen sind eine der Hauptursachen für Sehverlust bei Menschen unter 70 Jahren. RVO ist nach der diabetischen Retinopathie die zweithäufigste retinale Gefäßerkrankung³. Zu den klinischen Merkmalen, die für RVO charakteristisch sind, gehören ischämische Verletzungen, Netzhautödeme und Sehverlust als Folge eines neuronalen Verlusts ^3,4. Mausmodelle von RVO unter Verwendung der Laser-Photokoagulation von Großgefäßen wurden entwickelt und verfeinert, um wichtige klinische Pathologien zu replizieren, die bei humaner RVO ^5,6,7 beobachtet wurden. Fortschritte in der ophthalmologischen Bildgebung ermöglichen auch die Replikation nichtinvasiver Diagnosewerkzeuge, die beim Menschen verwendet werden, nämlich Fluoreszenzangiographie (FA) und optische Kohärenztomographie (OCT)⁶. Die Fluoreszenzangiographie ermöglicht die Beobachtung von Leckagen aufgrund des Zusammenbruchs der Blut-Netzhaut-Barriere (BRB) sowie der Blutflussdynamik in der Netzhaut, einschließlich der Okklusionsstellen, unter Verwendung der Injektion von Fluorescein, einem kleinen Fluoreszenzfarbstoff ^8,9. Die OCT-Bildgebung ermöglicht die Aufnahme hochauflösender Querschnittsbilder der Netzhaut und die Untersuchung der Dicke und Organisation von Netzhautschichten¹⁰. Die Analyse von FA-Bildern war in der Vergangenheit weitgehend qualitativ, was das Potenzial für einen direkten und reproduzierbaren Vergleich zwischen Studien einschränkt. In jüngster Zeit wurde eine Reihe von Methoden zur Quantifizierung der Schichtdicke in der OCT-Bildgebung entwickelt, obwohl es derzeit kein standardisiertes Analyseprotokoll gibt und der Ort der OCT-Bildaufnahme variiert¹¹. Um diese Tools richtig nutzen zu können, sind standardisierte, quantitative und replizierbare Datenanalysemethoden erforderlich. In diesem Artikel präsentieren wir drei solcher vaskulären Messwerte, die verwendet werden, um pathologische Schäden in einem Mausmodell von RVO-Fluorescein-Leckage, OCT-Schichtdicke und Desorganisation von Netzhautschichten zu bewerten.

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Protokoll

Dieses Protokoll folgt der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Nagetierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Columbia University genehmigt und überwacht.

HINWEIS: Die Bildgebung wurde an 2 Monate alten männlichen C57BL / 6J-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 23 g durchgeführt.

1. Vorbereitung von Reagenzien für die Netzhautbildgebung

1. Herstellung einer injizierbaren Fluoreszenzlösung.
   HINWEIS: Fluorescein ist sehr lichtempfindlich. Vor Licht schützen und kurz nach der Zubereitung verwenden.
   1. Verdünnen Sie Fluorescein auf eine Konzentration von 1% in steriler Kochsalzlösung.
2. Herstellung von Ketamin/Xylazin
   1. Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung entsprechend für folgende Konzentration verdünnen: Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (5-10 mg/kg).
3. Sterile Kochsalzlösung
   1. Bereiten Sie eine 5-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel mit steriler Kochsalzlösung vor.

2. OCT- und Fluoreszenzbildgebung

1. Schalten Sie den Netzhaut-Bildgebungsmikroskop-Leuchtkasten, das OCT-Gerät und die beheizte Mausplattform ein.
2. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das Imaging-Programm.
3. Fügen Sie jedem Auge einen Tropfen Phenylephrin und Tropicamid hinzu.
4. Injizieren Sie 150 μL Anästhesie (Ketamin (80-100 mg / kg) und Xylazin (5-10 mg / kg)) intraperitoneal (IP). Bestimmen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenkneifen und warten Sie, bis das Tier nicht mehr reagiert. Tragen Sie Augensalbe oder künstliche Tränen auf beide Augen auf.
5. Platzieren Sie die Maus auf der Plattform.
6. Passen Sie die Höhe und den Winkel der Plattform an, bis die Sicht auf den Netzhautfundus klar und fokussiert ist. Machen Sie ein Foto vom Fundus.
7. Öffnen Sie die Imaging- und OAT-Software. Stellen Sie im OAT-Programm den Anstoß auf 5 ein.
8. Nehmen Sie ein OCT-Bild bei 75 μm distal von der Verbrennung auf. Wiederholen Sie dies für die anderen drei Quadranten der Netzhaut.
9. Injizieren Sie 100 μL 1% Fluorescein IP.
10. Schalten Sie die Kamera auf einen 488-nm-Filter um. Erhöhen Sie die Kameraverstärkung auf 5.
11. Machen Sie ein Foto des Fundus genau 5 Minuten nach der Fluorescein-Injektion.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine längere Exposition des Auges gegenüber dem Kameralicht bei maximaler Einstellung, da Fluoreszin retinale Lichtschäden verschlimmern kann. Lassen Sie die Lichtquelle ausgeschaltet, bis die 5-minütige Wartezeit abgelaufen ist und die Maus für die Bildgebung bereit ist.

3. Nachsorge

1. Injizieren Sie 1 ml sterile Kochsalzlösung IP. Gleitende Augentropfen auf beide Augen auftragen. Tragen Sie Augensalbe oder künstliche Tränen auf beide Augen auf.
2. Beobachten Sie die Maus, wie sie sich von der Narkose erholt. Erst wenn Sie sich vollständig erholt haben, kehren Sie mit anderen Tieren in den Käfig zurück, in der Regel nach ca. 40 Minuten.

4. Beurteilung der Ausschlusskriterien

1. Öffnen Sie das Fundusbild, das 24 Stunden nach dem Eingriff aufgenommen wurde, um die Ausschlusskriterien zu beurteilen. Schließen Sie das Auge aus, wenn eines der folgenden Kriterien identifiziert wird.
2. Beurteilen, ob das Bild keine Okklusionen aufweist
   1. Werten Sie das Bild für die Anzahl der verschlossenen Gefäße aus.
      HINWEIS: Ein erfolgreicher Verschluss hat normalerweise eine violette Pigmentierung auf oder um die Verbrennung, ein sehr dünnes oder diskontinuierliches Gefäß durch die Verbrennung, ein schwaches oder nicht vorhandenes Gefäßerscheinungsbild außerhalb des Verbrennungsbereichs und eine Netzhautverfärbung durch Hypoxie. Wenn das gesamte Gefäß durch die weiße Verbrennung durch den Laser gesehen werden kann, konnte das Gefäß nicht verschließen. Manchmal erscheint das Gefäß teilweise verstopft, aber wenn es außerhalb der Verbrennung ununterbrochen aussieht, hat das Gefäß wahrscheinlich nicht verschlossen.
   2. Verwenden Sie in mehrdeutigen Fällen die FA-Bildgebung zum gleichen Zeitpunkt, um Okklusionen zu bewerten. In diesen Bildern erscheint eine Okklusion als Bruch in der Kontinuität eines Gefäßes, oft mit einer Verjüngung des umgebenden Gefäßes.
   3. Wenn keine Okklusionen festgestellt werden, schließen Sie das Auge von der Analyse aus, da die RVO als unwirksam angesehen wird.
      HINWEIS: Okklusionen klingen in der Regel 48-72 h nach RVO ab, und das Vorhandensein von Okklusionen sollte zu diesen Zeitpunkten nicht mehr als Ausschlusskriterium verwendet werden.
3. Beurteilung der Fundus- und OCT-Bilder auf übermäßige Netzhautablösung
   HINWEIS: Subretinale Flüssigkeitsansammlung ist nach Induktion von RVO üblich und verursacht eine Trennung der neuronalen Netzhaut von RPE. Ausschlusskriterien für eine übermäßige Netzhautablösung sind wie folgt definiert: OCT wird entweder völlig unsichtbar sein oder einige Schichten werden unglaublich verzerrt erscheinen. Die Bildqualität ist schlecht, mit einem Verlust der Auflösung von äußeren plexiformen und RPE-Schichten. Der Abstand zwischen der neuronalen Netzhaut und der Aderhaut ist größer als das, was das OCT-Sichtfeld erlaubt. Auf dem Fundusbild wird der Netzhautton fast vollständig weiß sein, mit einigen violetten Flecken. Ein Teil der Netzhaut kann verzerrt und unscharf erscheinen. Dies liegt daran, dass es sich gelöst hat und sich in einer anderen Brennweite befindet als der Rest der Netzhaut.
   1. Wenn die Beurteilung der Bilder eines Auges eine periphere oder vollständige Ablösung der Netzhaut feststellt, schließen Sie das Auge von der Analyse aus.
4. Bilder mit Hinweisen auf Hornhautkatarakt ausschließen
   HINWEIS: Eine Hornhautkatarakt erscheint als undurchsichtiger weißer Punkt auf der Hornhaut der Maus. Katarakte treten typischerweise aufgrund unzureichender Schmierung der Augen auf, während das Tier betäubt wird, und können weitgehend vermieden werden, indem darauf geachtet wird, die Augensalbe großzügig aufzutragen. Katarakte können in der Regel vor der Bildgebung durch Inspektion des Tieres identifiziert werden. Mäuse, die Katarakte entwickelt haben, sollten aus dem Datensatz ausgeschlossen werden, ohne sich dem bildgebenden Verfahren unterziehen zu müssen. In der Bildgebung verdecken Katarakte die Netzhaut von der Kamera und das OCT erscheint verzogen.
5. Beurteilen Sie das Bild auf übermäßige Blutungen
   HINWEIS: Übermäßige Blutungen können als Mengen an roter Flüssigkeit im Bild identifiziert werden, die normalerweise den Netzhauthintergrund, das Gefäß und die Verbrennung verdecken. Diese Bereiche der roten Flüssigkeit werden heller, undurchsichtig rot sein als die violetten Flecken, die bei erfolgreicher RVO normal sind. Blutungen zeigen sich an der Ganglienzellschicht auf der OCT-Bildgebung und stören die Fähigkeit, andere Netzhautschichten unter der Blutung zu visualisieren.
   1. Wenn festgestellt wird, dass das Bild eine übermäßige Blutung aufweist, schließen Sie das Auge von der Analyse aus.

5. Fluoreszenz-Bildverarbeitung

1. Öffnen Sie das Fluoreszenzbild in der Bildverarbeitungssoftware.
2. Duplizieren des Bilds
3. Verfolgen Sie die wichtigsten Schiffe sorgfältig mit einem Auswahlwerkzeug.
   1. Die Hauptgefäße sind die dickeren Venen und Arterien, die von der Sehscheibe ausgehen. Ignorieren Sie alle Schiffe, die von diesen Gefäßen abzweigen.
   2. Wenn die Leckage verhindert, dass der Umriss des Gefäßes in der Nähe der Okklusionsstelle zu sehen ist, verfolgen Sie die Leckage an der ungefähren Position des Gefäßes (Dicke beibehalten, den letzten sichtbaren Punkt mit dem nächsten sichtbaren Punkt verbinden).
4. Löschen Sie im ersten Bild die Auswahl, wobei nur der Hintergrund erhalten bleibt. Speichern Sie dieses maskierte Bild.
5. Verschieben Sie die Auswahl in das zweite Bild, kehren Sie die Auswahl um und löschen Sie sie, wodurch die Gefäße isoliert werden. Speichern Sie dieses maskierte Bild.
6. Öffnen Sie die beiden Bilder in ImageJ. Öffnen Sie das Hintergrundbild und messen Sie die integrierte Dichte.
7. Öffnen Sie das Bild des Gefäßes, wählen Sie den Umriss der Gefäße aus, und messen Sie dann die mittlere Intensität.
8. Teilen Sie die integrierte Dichte des Hintergrunds durch die mittlere Intensität der Gefäße, wodurch das Leckageverhältnis für das Auge erzeugt wird.
9. Zeichnen Sie dieses Leckageverhältnis für jedes Auge in einer experimentellen Kohorte auf.
10. Um den Hintergrund weiter zu kontrollieren, normalisieren Sie experimentelle Augen auf das mittlere Leckageverhältnis von unverletzten Kontrollaugen.
    HINWEIS: Um eine standardisierte Quantifizierung der Fluoreszenzleckage im FA-Bild zu erstellen, verwendet diese Berechnung ein Verhältnis der Hintergrunddichte (wo die Leckage vorhanden sein wird) mit der Helligkeit der Hauptgefäße, um Ergebnisse zu erzielen, die die Helligkeitsvariation von Bild zu Bild kontrollieren und zuverlässig quantifiziert werden können. Augen, die unbeschädigt sind, haben keine Leckage und sollten theoretisch Verhältnisse von Null haben. Die aus diesen unbeschädigten Kontrollaugen berechneten Verhältnisse stellen daher Hintergrundgeräusche dar, und dieser Wert wird verwendet, um experimentelle Werte weiter zu normalisieren.

6. Netzhautschichtdicke

1. Öffnen Sie das OAT-Bild in der Bildverarbeitungssoftware.
2. Verfolgen Sie die Grenzen der Ganglienzellschicht, der inneren Plexiformschicht, der inneren Kernschicht, der äußeren plexiformen Schicht, der Photorezeptorschicht und der RPE-Schicht. Messen Sie die mittlere Dicke jeder Schicht.
3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für OCT-Bilder aus den anderen drei Quadranten der Netzhaut. Mittelwert der mittleren Schichtdicken über die vier Quadranten, um die mittlere Dicke jeder Netzhautschicht für das Auge zu erhalten.
4. Wiederholen Sie dies für jedes Auge in der experimentellen Kohorte.

7. Desorganisation der inneren Netzhautschichten (DRIL)

1. Öffnen Sie das OAT-Bild in ImageJ.
2. Messen Sie mit dem Linienwerkzeug den Abstand, in dem der obere Rand der äußeren plexiformen Schicht undeutlich ist.
   HINWEIS: Es ist wichtig, zwischen DRIL und Bereichen mit schlechter Layer-Sichtbarkeit zu unterscheiden, die durch Bildartefakte verursacht werden. Eine schlechte OCT-Bildqualität kann ein Auge für die DRIL-Analyse ungültig machen, wenn eine ausreichende Bildauflösung nicht möglich ist. Bilder mit DRIL haben typischerweise andere Regionen oder Netzhautschichten, die klar aufgelöst und organisiert sind, was ein guter Indikator für eine ausreichende Bildqualität sein kann.
   1. Messen Sie horizontal vom Breitengrad, in dem die Desorganisation beginnt, bis zum Breitengrad, wo der obere Rand der äußeren plexiformen Schicht wieder sichtbar wird, wenn überhaupt. Auch wenn sich die äußere plexiforme Schicht vertikal nach oben oder unten verschiebt, messen Sie perfekt horizontal.
   2. Es kann mehrere Bereiche der Desorganisation geben, die durch Bereiche ohne Desorganisation getrennt sind. Messen Sie diese einzeln und berechnen Sie die Summe der Entfernungen.
3. Teilen Sie die Länge der Desorganisation durch die Gesamtlänge der Netzhaut, die in jedem OCT-Bild sichtbar ist, um das Verhältnis der Desorganisation für das Bild zu erhalten.
4. Wiederholen Sie die Messung und Berechnung für OCT-Bilder aus den anderen drei Quadranten der Netzhaut.
5. Nehmen Sie den Mittelwert der Verhältnisse der Desorganisation aus den vier OCT-Bildern. Diese Zahl stellt die durchschnittliche Desorganisation für die gesamte Netzhaut dar. Wiederholen Sie dies für jedes Auge in der experimentellen Kohorte.

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Ergebnisse

Diese Analysemethoden ermöglichen die Quantifizierung der Netzhautpathologie, die durch FA- und OCT-Bildgebung erfasst wird. Die Experimente, aus denen die repräsentativen Daten extrahiert wurden, verwendeten männliche C57BL / 6J-Mäuse, die entweder als unverletzte Kontrollen dienten oder sich dem RVO-Verfahren unterzogen und entweder Pen1-XBir3-Behandlungsaugentropfen oder Pen1-Saline-Vehikelaugentropfen erhielten. Das RVO-Verletzungsmodell beinhaltete die Laserbestrahlung (532 nm) der Hauptvenen in jedem Auge einer...

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Diskussion

Die nichtinvasive Netzhautbildgebung von Nagetieren bietet eine Möglichkeit, Pathologie zu untersuchen und Interventionen zu entwickeln. Frühere Studien haben ein Mausmodell von RVO entwickelt und optimiert, das die Variabilität begrenzt und eine zuverlässige Translation häufiger klinischer Pathologien in der murinen Netzhaut ermöglicht ^5,7,13. Entwicklungen in der ophthalmologischen Bildgebungstechnologie ermöglichen dar...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AK-Fluor 10%	Akorn	NDC: 17478-253-10	light-sensitive
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
GenTeal	Alcon	00658 06401
Image J	NIH
InSight 2D	Phoenix Technology Group		OCT analysis software
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoenix Micron IV	Phoenix Technology Group		Retinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian Module	Phoenix Technology Group		Laser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module	Phoenix Technology Group		OCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix Module	Phoenix Technology Group		Fundus imaging and acquisition targeting
Photoshop	Adobe
Refresh	Allergan	94170
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20