In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

Resumo

Aqui, apresentamos três protocolos de análise de dados para angiografia fluoresceína (AF) e tomografia de coerência óptica (OCT) no estudo da Oclusão da Veia Retiniana (RVO).

Resumo

Os avanços nas ferramentas de imagem oftálmica oferecem um nível sem precedentes de acesso a pesquisadores que trabalham com modelos animais de lesão neurovascular. Para alavancar adequadamente essa maior traduzibilidade, há uma necessidade de conceber métodos reprodutíveis de extrair dados quantitativos dessas imagens. A tomografia de coerência óptica (OCT) pode resolver a histologia da retina na resolução de micrômetros e revelar diferenças funcionais no fluxo sanguíneo vascular. Aqui, delineamos leituras vasculares não invasivas que usamos para caracterizar o dano patológico pós-insulto vascular em um modelo otimizado de oclusão da veia retiniana (RVO) em camundongos. Essas leituras incluem análise de imagens ao vivo da morfologia da retina, desorganização das camadas internas da retina (DRIL) medida de isquemia capilar e medidas de angiografia fluoresceína de edema retiniano e densidade vascular. Essas técnicas correspondem diretamente àquelas usadas para examinar pacientes com doença da retina na clínica. A padronização desses métodos permite a comparação direta e reprodutível de modelos animais com fenótipos clínicos de doença oftálmica, aumentando o poder translacional dos modelos de lesão vascular.

Introdução

A doença neurovascular é um importante problema de saúde responsável por acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, uma das principais causas de mortalidade e morbidade, e doenças vasculares da retina que levam à perda de visão ^1,2. Para modelar a doença neurovascular, empregamos um modelo de camundongo de oclusão da veia retiniana (RVO). Este modelo não é invasivo e utiliza técnicas de imagem in vivo semelhantes àquelas usadas para examinar pessoas com doença vascular da retina em um ambiente clínico. A utilização desse modelo aumenta, assim, o potencial translacional dos estudos que utilizam esse modelo. Tal como acontece com todos os modelos de mouse, é fundamental maximizar a reprodutibilidade do modelo.

As doenças vasculares da retina são uma das principais causas de perda de visão em pessoas com menos de 70 anos. A RVO é a segunda doença vascular retiniana mais comum depois da retinopatia diabética³. As características clínicas características da OVR incluem lesão isquêmica, edema de retina e perda de visão como consequência da perda neuronal ^3,4. Modelos de RVO em camundongos utilizando fotocoagulação a laser de vasos importantes foram desenvolvidos e refinados para replicar as principais patologias clínicas observadas no RVO humano ^5,6,7. Os avanços na imagem oftálmica também permitem a replicação de ferramentas diagnósticas não invasivas utilizadas em humanos, a saber, a angiografia fluoresceína (AF) e a tomografia de coerência óptica (OCT)⁶. A Angiografia por Fluoresceína permite a observação de vazamentos devido à quebra da barreira sangue-retina (BRB), bem como a dinâmica do fluxo sanguíneo na retina, incluindo locais de oclusão, utilizando a injeção de fluoresceína, um pequeno corante fluorescente ^8,9. A OCT permite a aquisição de imagens transversais de alta resolução da retina e o estudo da espessura e organização das camadas retinianas¹⁰. A análise de imagens de AF tem sido historicamente em grande parte qualitativa, o que limita o potencial de comparação direta e reprodutível entre os estudos. Recentemente, vários métodos têm sido desenvolvidos para a quantificação da espessura da camada em imagens de OCT, embora atualmente não exista um protocolo de análise padronizado e o local de aquisição da imagem da OCT varie¹¹. Para aproveitar adequadamente essas ferramentas, é necessária uma metodologia de análise de dados padronizada, quantitativa e replicável. Neste trabalho, apresentamos três dessas leituras vasculares utilizadas para avaliar o dano patológico em um modelo de camundongo de vazamento de RVO-fluoresceína, espessura da camada OCT e desorganização das camadas retinianas.

Protocolo

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.

NOTA: A imagem foi feita em camundongos machos C57BL/6J de 2 meses de idade que pesavam aproximadamente 23 g.

1. Preparação de reagentes para imagens da retina

1. Preparação de solução injetável de fluoresceína.
   NOTA: A fluoresceína é muito sensível à luz. Proteja da luz e use-o logo após a preparação.
   1. Diluir a fluoresceína a uma concentração de 1% em solução salina estéril.
2. Preparação de cetamina/xilazina
   1. Diluir cetamina e xilazina em solução salina estéril de acordo com a seguinte concentração: cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).
3. Solução salina estéril
   1. Prepare uma seringa de 5 ml com uma agulha de 26 G com solução salina estéril.

2. OCT e imagens fluoresceínas

1. Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina OCT e a plataforma de mouse aquecida.
2. Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens.
3. Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida a cada olho.
4. Injete 150 μL de anestesia (cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)) por via intraperitoneal (IP). Determine a profundidade da anestesia por beliscão do dedo do pé e espere até que o animal não responda. Aplique pomada oftálmica ou lágrimas artificiais em ambos os olhos.
5. Acomodem o mouse na plataforma.
6. Ajuste a altura e o ângulo da plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada. Tire uma foto do fundo.
7. Abra o software de imagem e OCT. No programa OCT, ajuste o empurrão para 5.
8. Tire uma imagem OCT a 75 μm distal da queimadura. Repita para os outros três quadrantes da retina.
9. Injete 100 μL de 1% de fluoresceína IP.
10. Mude a câmera para um filtro de 488 nm. Aumente o ganho da câmera para 5.
11. Tire uma foto do fundo de olho exatamente 5 minutos após a injeção de fluoresceína.
    NOTA: Evite a exposição prolongada do olho à luz da câmera na configuração máxima, pois a fluoresceína pode exacerbar os fotodanos da retina. Mantenha a fonte de luz desligada até que o tempo de espera de 5 minutos tenha decorrido e o mouse esteja pronto para a geração de imagens.

3. Cuidados posteriores

1. Injete 1 mL de solução salina estéril IP. Aplique colírios lubrificantes em ambos os olhos. Aplique pomada oftálmica ou lágrimas artificiais em ambos os olhos.
2. Observe o rato enquanto ele se recupera da anestesia. Retornar à gaiola com outros animais somente quando totalmente recuperado, geralmente após cerca de 40 min.

4. Avaliação dos critérios de exclusão

1. Abra a imagem do fundo de olho tirada 24 horas após o procedimento para avaliar os critérios de exclusão. Exclua o olho se algum dos seguintes critérios for identificado.
2. Avaliar se a imagem tem zero oclusões
   1. Avalie a imagem para o número de vasos ocluídos.
      NOTA: Uma oclusão bem-sucedida geralmente tem alguma pigmentação roxa sobre ou ao redor da queimadura, vaso muito fino ou descontínuo através da queimadura, aparência de vaso fraco ou inexistente fora da área da queimadura e descoloração da retina por hipóxia. Se todo o vaso pode ser visto através da queimadura branca pelo laser, o vaso não conseguiu ocluir. Às vezes, o vaso aparecerá parcialmente obstruído, mas se parecer ininterrupto fora da queimadura, o vaso provavelmente não ocluiu.
   2. Para casos ambíguos, use imagens de AF ao mesmo tempo para avaliar as oclusões. Nessas imagens, uma oclusão aparecerá como uma quebra na continuidade de um vaso, muitas vezes com um afunilamento do vaso circundante.
   3. Se forem identificadas oclusões zero, exclua o olho da análise, pois o RVO é considerado ineficaz.
      NOTA: As oclusões geralmente se resolvem em 48-72 h pós-RVO, e a presença de oclusões não deve mais ser usada como critério de exclusão nesses momentos.
3. Avaliar as imagens de fundo de olho e OCT para descolamento excessivo de retina
   NOTA: O acúmulo de líquido sub-retiniano é comum após a indução de RVO e causa a separação da retina neural da EPR. Os critérios de exclusão para o descolamento excessivo de retina são definidos da seguinte forma: a OCT será completamente invisível ou algumas camadas parecerão incrivelmente distorcidas. A qualidade da imagem é fraca, com perda de resolução das camadas plexiformes e PSE externas. A separação entre a retina neural e a coroide é maior do que o que o campo de visão OCT permite. Na imagem do fundo, o tom da retina será quase completamente branco, com algumas manchas roxas. Parte da retina pode parecer distorcida e fora de foco. Isso ocorre porque ele se desprendeu e está a uma distância focal diferente do resto da retina.
   1. Se a avaliação das imagens de um olho determinar o descolamento periférico ou completo da retina, exclua o olho da análise.
4. Excluir imagens com evidência de catarata corneana
   NOTA: Uma catarata da córnea aparece como um ponto branco opaco na córnea do rato. A catarata geralmente ocorre devido à lubrificação insuficiente dos olhos enquanto o animal está anestesiado e pode ser amplamente evitada tomando cuidado para aplicar a pomada ocular generosamente. A catarata geralmente pode ser identificada antes da imagem, inspecionando o animal. Os ratos que desenvolveram catarata devem ser excluídos do conjunto de dados sem a necessidade de se submeterem ao processo de imagem. Na imagem, a catarata obscurecerá a retina da câmera e a OCT aparecerá deformada.
5. Avalie a imagem para hemorragia excessiva
   NOTA: A hemorragia excessiva pode ser identificada como quantidades de líquido vermelho na imagem, geralmente obscurecendo o fundo da retina, o vaso e a queimadura. Essas áreas de fluido vermelho serão um vermelho mais brilhante e opaco do que as manchas roxas que são normais no RVO bem-sucedido. As hemorragias aparecem na camada de células ganglionares na imagem OCT e interferem na capacidade de visualizar outras camadas da retina sob a hemorragia.
   1. Se a imagem for determinada como tendo uma hemorragia excessiva, exclua o olho da análise.

5. Processamento de imagem fluoresceína

1. Abra a imagem fluoresceína no software de processamento de imagem.
2. Duplicar a imagem
3. Usando uma ferramenta de seleção, trace cuidadosamente os principais vasos.
   1. Os principais vasos são as veias e artérias mais espessas que irradiam para fora do disco óptico. Ignore quaisquer vasos que se ramificam a partir desses vasos.
   2. Se o vazamento impedir que o contorno do vaso seja visto perto do local de oclusão, rastreie o vazamento na localização aproximada do vaso (mantenha a espessura, conecte o último ponto visível ao próximo ponto visível).
4. Na primeira imagem, exclua a seleção, deixando apenas o plano de fundo. Salve esta imagem mascarada.
5. Mova a seleção para a segunda imagem, inverta a seleção e exclua, isolando os vasos. Salve esta imagem mascarada.
6. Abra as duas imagens no ImageJ. Abra a imagem de fundo e meça a densidade integrada.
7. Abra a imagem do vaso, selecione o contorno dos vasos e, em seguida, meça a intensidade média.
8. Divida a densidade integrada do fundo pela intensidade média dos vasos, gerando a razão de vazamento para o olho.
9. Registre essa razão de vazamento para cada olho em uma coorte experimental.
10. Para maior controle do fundo, normalize os olhos experimentais para a razão média de vazamento dos olhos de controle não lesionados.
    NOTA: A fim de criar uma quantificação padronizada do vazamento de fluoresceína na imagem FA, este cálculo usa uma razão da densidade de fundo (onde o vazamento estará presente) com o brilho dos principais vasos para criar resultados que controlam a variação no brilho de imagem para imagem e podem ser quantificados de forma confiável. Os olhos que não estão danificados não têm vazamento e teoricamente devem ter proporções de zero. As razões calculadas a partir desses olhos de controle não danificados, portanto, representam ruído de fundo, e esse valor é usado para normalizar ainda mais os valores experimentais.

6. Espessura da camada retiniana

1. Abra a imagem da OCT no software de processamento de imagem.
2. Trace as bordas da camada de células ganglionares, camada plexiforme interna, camada nuclear interna, camada plexiforme externa, camada fotorreceptora e camada RPE. Meça a espessura média de cada camada.
3. Repita para imagens OCT dos outros três quadrantes da retina. Média das espessuras médias da camada nos quatro quadrantes para obter a espessura média de cada camada da retina para o olho.
4. Repetir para cada olho na coorte experimental.

7. Desorganização das camadas internas da retina (DRIL)

1. Abra a imagem da OCT no ImageJ.
2. Usando a ferramenta de linha, meça a distância em que a borda superior da camada plexiforme externa é indistinta.
   NOTA: É importante diferenciar entre DRIL e áreas de baixa visibilidade de camada causada por artefatos de imagem. A má qualidade da imagem OCT pode invalidar um olho para análise DRIL se a resolução de imagem suficiente não for possível. Imagens com DRIL normalmente terão outras regiões ou camadas da retina que são claramente resolvidas e organizadas, o que pode ser um bom indicador de qualidade de imagem suficiente.
   1. Meça horizontalmente a partir da latitude onde a desorganização começa até a latitude onde a borda superior da camada plexiforme externa se torna visível novamente, se for o caso. Mesmo que a camada plexiforme externa se desloque para cima ou para baixo verticalmente, meça perfeitamente horizontalmente.
   2. Pode haver várias áreas de desorganização separadas por áreas sem desorganização. Meça-os individualmente e calcule a soma das distâncias.
3. Divida o comprimento da desorganização pelo comprimento total da retina visível em cada imagem OCT para obter a proporção de desorganização para a imagem.
4. Repita a medição e o cálculo para imagens OCT dos outros três quadrantes da retina.
5. Tomemos a média das proporções de desorganização das quatro imagens da OCT. Este número representa a desorganização média para toda a retina. Repetir para cada olho na coorte experimental.

Resultados

Esses métodos de análise permitem a quantificação da patologia da retina capturada por imagens de AF e OCT. Os experimentos dos quais os dados representativos são extraídos usaram camundongos machos C57BL/6J que serviram como controles não feridos ou foram submetidos ao procedimento RVO e receberam colírios de tratamento Pen1-XBir3 ou colírios de veículo Pen1-Saline. O modelo de lesão RVO envolveu a irradiação a laser (532 nm) das veias principais em cada olho de um rato anestesiado após uma injeção na ve...

Discussão

A imagem não invasiva da retina de roedores apresenta uma via para estudar a patologia e desenvolver intervenções. Estudos prévios desenvolveram e otimizaram um modelo de RVO em camundongos, limitando a variabilidade e permitindo a tradução confiável de patologias clínicas comuns na retina murina ^5,7,13. Os desenvolvimentos na tecnologia de imagem oftálmica permitem ainda o uso de técnicas clínicas de imagem in vi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AK-Fluor 10%	Akorn	NDC: 17478-253-10	light-sensitive
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
GenTeal	Alcon	00658 06401
Image J	NIH
InSight 2D	Phoenix Technology Group		OCT analysis software
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoenix Micron IV	Phoenix Technology Group		Retinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian Module	Phoenix Technology Group		Laser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module	Phoenix Technology Group		OCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix Module	Phoenix Technology Group		Fundus imaging and acquisition targeting
Photoshop	Adobe
Refresh	Allergan	94170
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20