In vivo Lecture des lésions vasculaires dans la rétine de souris pour favoriser la reproductibilité

Résumé

Ici, nous présentons trois protocoles d’analyse de données pour les images d’angiographie à la fluorescéine (AF) et de tomographie par cohérence optique (OCT) dans l’étude de l’occlusion veineuse rétinienne (OVR).

Résumé

Les progrès réalisés dans les outils d’imagerie ophtalmique offrent un niveau d’accès sans précédent aux chercheurs travaillant avec des modèles animaux de lésions neurovasculaires. Pour tirer correctement parti de cette plus grande traduisibilité, il est nécessaire de concevoir des méthodes reproductibles pour tirer des données quantitatives de ces images. L’imagerie par tomographie par cohérence optique (TCO) peut résoudre l’histologie rétinienne à une résolution micrométrique et révéler des différences fonctionnelles dans le flux sanguin vasculaire. Ici, nous décrivons des lectures vasculaires non invasives que nous utilisons pour caractériser les dommages pathologiques post-agression vasculaire dans un modèle murin optimisé d’occlusion veineuse rétinienne (OVR). Ces lectures comprennent l’analyse par imagerie en direct de la morphologie rétinienne, la désorganisation des couches internes de la rétine (DRIL) mesure de l’ischémie capillaire et les mesures d’angiographie à la fluorescéine de l’œdème rétinien et de la densité vasculaire. Ces techniques correspondent directement à celles utilisées pour examiner les patients atteints de maladie de la rétine en clinique. La normalisation de ces méthodes permet une comparaison directe et reproductible de modèles animaux avec des phénotypes cliniques de maladies ophtalmiques, augmentant ainsi le pouvoir translationnel des modèles de lésions vasculaires.

Introduction

Les maladies neurovasculaires sont un problème de santé majeur responsable des accidents vasculaires cérébraux ischémiques, l’une des principales causes de mortalité et de morbidité, et des maladies vasculaires rétiniennes entraînant une perte de vision ^1,2. Pour modéliser la maladie neurovasculaire, nous utilisons un modèle murin d’occlusion veineuse rétinienne (OVR). Ce modèle est non invasif et utilise des techniques d’imagerie in vivo similaires à celles utilisées pour examiner les personnes atteintes d’une maladie vasculaire rétinienne en milieu clinique. L’utilisation de ce modèle augmente donc le potentiel translationnel des études utilisant ce modèle. Comme pour tous les modèles de souris, il est essentiel de maximiser la reproductibilité du modèle.

Les maladies vasculaires rétiniennes sont une cause majeure de perte de vision chez les personnes de moins de 70 ans. La RVO est la deuxième maladie vasculaire rétinienne la plus fréquente après la rétinopathie diabétique³. Les caractéristiques cliniques caractéristiques de la RVO comprennent une lésion ischémique, un œdème rétinien et une perte de vision à la suite d’une perte neuronale ^3,4. Des modèles murins de RVO utilisant la photocoagulation laser des principaux vaisseaux ont été développés et affinés pour reproduire les principales pathologies cliniques observées chez l’homme RVO ^5,6,7. Les progrès de l’imagerie ophtalmique permettent également la reproduction d’outils de diagnostic non invasifs utilisés chez l’homme, à savoir l’angiographie à la fluorescéine (AF) et la tomographie par cohérence optique (OCT)⁶. L’angiographie à la fluorescéine permet d’observer les fuites dues à la rupture de la barrière hémato-rétinienne (BRB) ainsi que la dynamique du flux sanguin dans la rétine, y compris les sites d’occlusion, en utilisant l’injection de fluorescéine, un petit colorant fluorescent ^8,9. L’imagerie OCT permet l’acquisition d’images transversales haute résolution de la rétine et l’étude de l’épaisseur et de l’organisation des couches rétiniennes¹⁰. L’analyse des images FA a toujours été largement qualitative, ce qui limite le potentiel de comparaison directe et reproductible entre les études. Récemment, un certain nombre de méthodes ont été développées pour la quantification de l’épaisseur de couche en imagerie OCT, bien qu’il n’existe actuellement aucun protocole d’analyse normalisé et que le site d’acquisition d’images OCT varie¹¹. Afin de tirer correctement parti de ces outils, une méthodologie d’analyse des données normalisée, quantitative et reproductible est nécessaire. Dans cet article, nous présentons trois lectures vasculaires utilisées pour évaluer les dommages pathologiques dans un modèle murin de fuite de fluorescéine RVO, d’épaisseur de couche OCT et de désorganisation des couches rétiniennes.

Protocole

Ce protocole suit la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche en ophtalmologie et en vision. Les expériences sur les rongeurs ont été approuvées et surveillées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Columbia.

REMARQUE : L’imagerie a été effectuée sur des souris mâles C57BL/6J âgées de 2 mois qui pesaient environ 23 g.

1. Préparation des réactifs pour l’imagerie rétinienne

1. Préparation d’une solution injectable de fluorescéine.
   REMARQUE: La fluorescéine est très sensible à la lumière. Protéger de la lumière et l’utiliser peu de temps après la préparation.
   1. Diluer la fluorescéine à une concentration de 1% dans une solution saline stérile.
2. Préparation de kétamine/xylazine
   1. Diluer la kétamine et la xylazine dans une solution saline stérile en conséquence pour obtenir la concentration suivante : kétamine (80-100 mg/kg) et xylazine (5-10 mg/kg).
3. Solution saline stérile
   1. Préparez une seringue de 5 mL avec une aiguille de 26 G avec une solution saline stérile.

2. Imagerie OCT et fluorescéine

1. Allumez le caisson lumineux du microscope imageur rétinien, l’appareil OCT et la plate-forme de souris chauffée.
2. Allumez l’ordinateur et ouvrez le programme d’imagerie.
3. Ajouter une goutte de phényléphrine et de tropicamide à chaque œil.
4. Injecter 150 μL d’anesthésie (kétamine (80-100 mg / kg) et xylazine (5-10 mg / kg)) par voie intrapéritonéale (IP). Déterminez la profondeur de l’anesthésie par pincement des orteils et attendez que l’animal ne réponde plus. Appliquez une pommade ophtalmique ou des larmes artificielles sur les deux yeux.
5. Accueillez la souris sur la plate-forme.
6. Ajustez la hauteur et l’angle de la plate-forme jusqu’à ce que la vue du fond d’œil rétinien soit claire et nette. Prenez une photo du fond d’œil.
7. Ouvrez le logiciel d’imagerie et d’OPO. Dans le programme de l’OPO, réglez nudge sur 5.
8. Prenez une image OCT à 75 μm distale de la brûlure. Répétez l’opération pour les trois autres quadrants de la rétine.
9. Injecter 100 μL de fluorescéine IP à 1%.
10. Basculez la caméra sur un filtre de 488 nm. Augmentez le gain de la caméra à 5.
11. Prenez une photo du fond d’œil exactement 5 min après l’injection de fluorescéine.
    REMARQUE: Évitez l’exposition prolongée de l’œil à la lumière de l’appareil photo au réglage maximal, car la fluorescéine peut exacerber les photodommages rétiniens. Gardez la source lumineuse éteinte jusqu’à ce que le temps d’attente de 5 minutes soit écoulé et que la souris soit prête pour l’imagerie.

3. Suivi

1. Injecter 1 mL de solution saline IP stérile. Appliquez des gouttes ophtalmiques lubrifiantes sur les deux yeux. Appliquez une pommade ophtalmique ou des larmes artificielles sur les deux yeux.
2. Observez la souris pendant qu’elle se remet de l’anesthésie. Ne retournez à la cage avec d’autres animaux que lorsqu’ils sont complètement rétablis, généralement après environ 40 minutes.

4. Appréciation des critères d’exclusion

1. Ouvrez l’image du fond d’œil prise 24 heures après la procédure pour évaluer les critères d’exclusion. Exclure l’œil si l’un des critères suivants est identifié.
2. Évaluer si l’image n’a aucune occlusion
   1. Évaluez l’image pour le nombre de vaisseaux occlus.
      REMARQUE: Une occlusion réussie a généralement une pigmentation pourpre sur ou autour de la brûlure, un vaisseau très mince ou discontinu à travers la brûlure, une apparence de vaisseau faible ou inexistant à l’extérieur de la zone de brûlure et une décoloration rétinienne due à l’hypoxie. Si le vaisseau entier peut être vu à travers la brûlure blanche par le laser, le vaisseau n’a pas réussi à s’obstruer. Parfois, le vaisseau semblera partiellement obstrué, mais s’il semble ininterrompu à l’extérieur de la brûlure, le vaisseau ne s’est probablement pas obstrué.
   2. Pour les cas ambigus, utilisez l’imagerie FA au même moment pour évaluer les occlusions. Dans ces images, une occlusion apparaîtra comme une rupture dans la continuité d’un vaisseau, souvent avec un effilement du vaisseau environnant.
   3. Si aucune occlusion n’est identifiée, exclure l’œil de l’analyse, car l’ORV est considéré comme inefficace.
      REMARQUE : Les occlusions disparaissent généralement 48 à 72 h après l’OVR, et la présence d’occlusions ne doit plus être utilisée comme critère d’exclusion à ces moments.
3. Évaluer les images du fond d’œil et de la TCO pour détecter un décollement excessif de la rétine
   REMARQUE: L’accumulation de liquide sous-rétinien est fréquente après l’induction de l’OVR et provoque la séparation de la rétine neurale de l’EPR. Les critères d’exclusion pour un décollement excessif de la rétine sont définis comme suit : soit la TCO sera complètement invisible, soit certaines couches apparaîtront incroyablement déformées. La qualité d’image est médiocre, avec une perte de résolution des couches plexiformes et RPE extérieures. La séparation entre la rétine neurale et la choroïde est plus grande que ce que permet le champ de vision OCT. Sur l’image du fond d’œil, le ton de la rétine sera presque complètement blanc, avec quelques taches violettes. Une partie de la rétine peut sembler déformée et floue. C’est parce qu’il s’est détaché et est à une distance focale différente du reste de la rétine.
   1. Si l’évaluation des images d’un œil détermine un décollement périphérique ou complet de la rétine, exclure l’œil de l’analyse.
4. Exclure les images présentant des signes de cataracte cornéenne
   REMARQUE: Une cataracte cornéenne apparaît comme un point blanc opaque sur la cornée de la souris. La cataracte survient généralement en raison d’une lubrification insuffisante des yeux pendant que l’animal est anesthésié et peut être largement évitée en prenant soin d’appliquer généreusement une pommade pour les yeux. La cataracte peut généralement être identifiée avant l’imagerie en inspectant l’animal. Les souris qui ont développé des cataractes doivent être exclues de l’ensemble de données sans avoir besoin de subir le processus d’imagerie. En imagerie, les cataractes masqueront la rétine de la caméra et l’OCT apparaîtra déformé.
5. Évaluer l’image pour une hémorragie excessive
   REMARQUE: Une hémorragie excessive peut être identifiée comme des quantités de liquide rouge dans l’image, masquant généralement l’arrière-plan rétinien, le vaisseau et la brûlure. Ces zones de liquide rouge seront d’un rouge plus vif et plus opaque que les taches violettes qui sont normales dans une OVR réussie. Les hémorragies apparaissent au niveau de la couche de cellules ganglionnaires sur l’imagerie OCT et interfèrent avec la capacité de visualiser d’autres couches rétiniennes sous l’hémorragie.
   1. S’il est déterminé que l’image présente une hémorragie excessive, exclure l’œil de l’analyse.

5. Traitement d’image à la fluorescéine

1. Ouvrez l’image de fluorescéine dans le logiciel de traitement d’image.
2. Dupliquer l’image
3. À l’aide d’un outil de sélection, tracez soigneusement les principaux navires.
   1. Les principaux vaisseaux sont les veines et les artères les plus épaisses rayonnant du disque optique. Ignorez tous les navires qui se ramifient à partir de ces navires.
   2. Si une fuite empêche le contour du navire d’être vu près du site d’occlusion, tracer à travers la fuite à l’emplacement approximatif du récipient (maintenir l’épaisseur, relier le dernier point visible au point visible suivant).
4. Dans la première image, supprimez la sélection, en ne laissant que l’arrière-plan. Enregistrez cette image masquée.
5. Déplacez la sélection vers la deuxième image, inversez la sélection et supprimez-la, isolant ainsi les vaisseaux. Enregistrez cette image masquée.
6. Ouvrez les deux images dans ImageJ. Ouvrez l’image d’arrière-plan et mesurez la densité intégrée.
7. Ouvrez l’image du navire, sélectionnez le contour des vaisseaux, puis mesurez l’intensité moyenne.
8. Diviser la densité intégrée du bruit de fond par l’intensité moyenne des vaisseaux, générant le rapport de fuite pour l’œil.
9. Notez ce rapport de fuite pour chaque œil dans une cohorte expérimentale.
10. Pour mieux contrôler le bruit de fond, normaliser les yeux expérimentaux au rapport de fuite moyen des yeux témoins non blessés.
    REMARQUE: Afin de créer une quantification normalisée de la fuite de fluorescéine dans l’image FA, ce calcul utilise un rapport entre la densité de fond (où la fuite sera présente) et la luminosité des principaux récipients pour créer des résultats qui contrôlent la variation de luminosité d’une image à l’autre et peuvent être quantifiés de manière fiable. Les yeux qui ne sont pas endommagés n’ont pas de fuite et devraient théoriquement avoir des rapports de zéro. Les rapports calculés à partir de ces yeux témoins non endommagés représentent donc le bruit de fond, et cette valeur est utilisée pour normaliser davantage les valeurs expérimentales.

6. Épaisseur de la couche rétinienne

1. Ouvrez l’image de l’OPO dans le logiciel de traitement d’image.
2. Tracez les bordures de la couche de cellules ganglionnaires, de la couche plexiforme interne, de la couche nucléaire interne, de la couche plexiforme externe, de la couche photoréceptrice et de la couche RPE. Mesurez l’épaisseur moyenne de chaque couche.
3. Répétez l’opération pour les images OCT des trois autres quadrants de la rétine. Faire la moyenne des épaisseurs moyennes des couches dans les quatre quadrants pour obtenir l’épaisseur moyenne de chaque couche rétinienne pour l’œil.
4. Répéter pour chaque œil de la cohorte expérimentale.

7. Désorganisation des couches internes de la rétine (DRIL)

1. Ouvrez l’image de l’OPO dans ImageJ.
2. À l’aide de l’outil de ligne, mesurez la distance où la bordure supérieure de la couche plexiforme externe est indistincte.
   REMARQUE : Il est important de faire la différence entre les DRIL et les zones de mauvaise visibilité des couches causées par les artefacts d’imagerie. Une mauvaise qualité d’image de la TCO peut invalider un œil pour l’analyse DRIL si une résolution d’image suffisante n’est pas possible. Les images avec DRIL auront généralement d’autres régions ou couches rétiniennes qui sont clairement résolues et organisées, ce qui peut être un bon indicateur d’une qualité d’image suffisante.
   1. Mesurer horizontalement à partir de la latitude où la désorganisation commence jusqu’à la latitude où le bord supérieur de la couche plexiforme externe redevient visible, le cas échéant. Même si la couche plexiforme extérieure se déplace verticalement vers le haut ou vers le bas, mesurez parfaitement horizontalement.
   2. Il peut y avoir plusieurs zones de désorganisation séparées par des zones sans désorganisation. Mesurez-les individuellement et calculez la somme des distances.
3. Divisez la longueur de désorganisation par la longueur totale de la rétine visible dans chaque image OCT pour obtenir le rapport de désorganisation de l’image.
4. Répétez la mesure et le calcul pour les images OCT des trois autres quadrants de la rétine.
5. Prenons la moyenne des ratios de désorganisation des quatre images OCT. Ce nombre représente la désorganisation moyenne pour l’ensemble de la rétine. Répéter pour chaque œil de la cohorte expérimentale.

Résultats

Ces méthodes d’analyse permettent de quantifier la pathologie rétinienne capturée par imagerie FA et OCT. Les expériences dont les données représentatives sont extraites ont utilisé des souris mâles C57BL / 6J qui ont servi de témoins non blessés ou ont subi la procédure RVO et ont reçu soit des gouttes ophtalmiques de traitement Pen1-XBir3, soit des gouttes ophtalmiques pour véhicules Pen1-Saline. Le modèle de lésion RVO impliquait l’irradiation laser (532 nm) des veines principales de chaque œil d?...

Discussion

L’imagerie rétinienne non invasive des rongeurs offre une avenue pour étudier la pathologie et développer des interventions. Des études antérieures ont développé et optimisé un modèle murin d’OVR, limitant la variabilité et permettant une traduction fiable des pathologies cliniques courantes dans la rétine murine 5,7,13. Les progrès de la technologie d’imagerie ophtalmique permettent en outre l’utilisation de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AK-Fluor 10%	Akorn	NDC: 17478-253-10	light-sensitive
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
GenTeal	Alcon	00658 06401
Image J	NIH
InSight 2D	Phoenix Technology Group		OCT analysis software
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoenix Micron IV	Phoenix Technology Group		Retinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian Module	Phoenix Technology Group		Laser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module	Phoenix Technology Group		OCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix Module	Phoenix Technology Group		Fundus imaging and acquisition targeting
Photoshop	Adobe
Refresh	Allergan	94170
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20