In vivo קריאות פגיעה בכלי דם ברשתית העכבר כדי לקדם את יכולת השחזור

Summary

כאן אנו מציגים שלושה פרוטוקולי ניתוח נתונים עבור אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) וטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT) במחקר של חסימת ורידים ברשתית (RVO).

Abstract

ההתקדמות בכלי הדמיה אופתלמיים מציעה רמה חסרת תקדים של גישה לחוקרים העובדים עם מודלים של בעלי חיים של פגיעה נוירו-וסקולרית. כדי למנף כראוי את יכולת התרגום הגדולה הזו, יש צורך להמציא שיטות הניתנות לשחזור של ציור נתונים כמותיים מתמונות אלה. הדמיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) יכולה לפתור היסטולוגיה של הרשתית ברזולוציית מיקרומטר ולחשוף הבדלים תפקודיים בזרימת הדם הווסקולרי. כאן, אנו מגדירים קריאות כלי דם לא פולשניות שבהן אנו משתמשים כדי לאפיין נזק פתולוגי לאחר עלבון כלי דם במודל עכבר אופטימלי של חסימת ורידים ברשתית (RVO). קריאות אלה כוללות ניתוח הדמיה חיה של מורפולוגיה ברשתית, חוסר ארגון של שכבות פנימיות ברשתית (DRIL) של איסכמיה נימית, ומדדי אנגיוגרפיה פלואורסצנטית של בצקת רשתית וצפיפות כלי דם. טכניקות אלה תואמות ישירות את אלה המשמשים לבדיקת חולים עם מחלת רשתית במרפאה. סטנדרטיזציה של שיטות אלה מאפשרת השוואה ישירה וניתנת לשחזור של מודלים של בעלי חיים עם פנוטיפים קליניים של מחלות עיניים, ומגדילה את כוח התרגום של מודלים של פגיעה בכלי הדם.

Introduction

מחלות נוירו-וסקולריות הן בעיה בריאותית מרכזית האחראית לשבץ איסכמי, הגורם המוביל לתמותה ותחלואה, ולמחלות כלי דם ברשתית המובילות לאובדן ראייה ^1,2. כדי ליצור מודלים של מחלות נוירו-וסקולריות, אנו משתמשים במודל עכברי של חסימת ורידים ברשתית (RVO). מודל זה אינו פולשני ומשתמש בטכניקות הדמיה דומות של in vivo לאלה המשמשות לבדיקת אנשים עם מחלות כלי דם ברשתית במסגרת קלינית. השימוש במודל זה מגדיל אפוא את הפוטנציאל התרגומי של מחקרים המשתמשים במודל זה. כמו בכל דגמי העכברים, חיוני למקסם את יכולת השחזור של המודל.

מחלות כלי דם ברשתית הן גורם מרכזי לאובדן ראייה אצל אנשים מתחת לגיל 70. RVO היא מחלת כלי הדם השנייה בשכיחותה ברשתית אחרי רטינופתיה סוכרתית³. המאפיינים הקליניים האופייניים ל-RVO כוללים פגיעה איסכמית, בצקת ברשתית ואובדן ראייה כתוצאה מאובדן עצבי ^3,4. מודלים של עכברים של RVO באמצעות פוטוקואגולציה בלייזר של כלי שיט עיקריים פותחו ושוכללו כדי לשכפל פתולוגיות קליניות מרכזיות שנצפו ב- RVO ^5,6,7 אנושי. ההתקדמות בהדמיה אופתלמית מאפשרת גם שכפול של כלי אבחון לא פולשניים המשמשים בבני אדם, כלומר, אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT)⁶. אנגיוגרפיה פלואורסצנטית מאפשרת תצפית על דליפה עקב פירוק מחסום הדם-רשתית (BRB) וכן דינמיקה של זרימת הדם ברשתית, כולל אתרי חסימה, באמצעות הזרקת פלואורסצין, צבע פלואורסצנטי קטן ^8,9. הדמיית OCT מאפשרת רכישת תמונות חתך ברזולוציה גבוהה של הרשתית וחקר העובי והארגון של שכבות הרשתית¹⁰. ניתוח תמונות FA היה מבחינה היסטורית איכותי במידה רבה, מה שמגביל את הפוטנציאל להשוואה ישירה וניתנת לשחזור בין מחקרים. לאחרונה פותחו מספר שיטות לכימות עובי שכבה בהדמיית OCT, אם כי אין כיום פרוטוקול ניתוח סטנדרטי והאתר של רכישת תמונות OCT משתנה¹¹. על מנת למנף כראוי כלים אלה, יש צורך במתודולוגיית ניתוח נתונים סטנדרטית, כמותית וניתנת לשכפול. במאמר זה אנו מציגים שלוש קריאות כלי דם כאלה המשמשות להערכת נזק פתולוגי במודל עכבר של דליפת RVO-פלואורסצין, עובי שכבת OCT וחוסר ארגון של שכבות הרשתית.

Protocol

פרוטוקול זה תואם את הצהרת האגודה לחקר ראייה ועיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. ניסויים במכרסמים אושרו ונוטרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת קולומביה.

הערה: ההדמיה נעשתה על עכברים זכרים C57BL/6J בני חודשיים ששקלו כ-23 גרם.

1. הכנת ריאגנטים להדמיית רשתית

1. הכנת תמיסת פלואורסצין להזרקה.
   הערה: פלואורסצין רגיש מאוד לאור. יש להגן מפני אור ולהשתמש בו זמן קצר לאחר ההכנה.
   1. יש לדלל פלואורסצין לריכוז של 1% במי מלח סטריליים.
2. הכנת קטמין/קסילזין
   1. יש לדלל קטמין וקסילזין בתמיסת מלח סטרילית בהתאם לריכוז הבא: קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג/ק"ג).
3. תמיסת מלח סטרילית
   1. הכן מזרק 5 מ"ל עם מחט 26 גרם עם מלוחים סטריליים.

2. OCT והדמיית פלואורסצין

1. הפעל את תיבת התאורה של מיקרוסקופ הדמיית הרשתית, את מכשיר ה-OCT ואת פלטפורמת העכבר המחוממת.
2. הפעל את המחשב ופתח את תוכנית ההדמיה.
3. הוסיפו טיפה אחת של פנילפרין וטרופיקמיד לכל עין.
4. להזריק 150 μL של הרדמה (קטמין (80-100 מ"ג / ק"ג) וקסילזין (5-10 מ"ג / ק"ג)) intraperitoneally (IP). קבע את עומק ההרדמה על ידי צביטה בבוהן והמתן עד שהחיה לא מגיבה. יש למרוח משחת עיניים או דמעות מלאכותיות על שתי העיניים.
5. התאימו את העכבר לרציף.
6. התאימו את הגובה והזווית של הפלטפורמה עד שהתצוגה של פונדוס הרשתית תהיה ברורה וממוקדת. צלם תמונה של הפונדוס.
7. פתח את תוכנת ההדמיה וה- OCT. בתוכנית OCT, התאם את הנדנוד ל-5.
8. צלם תמונת OCT במרחק של 75 מיקרומטר דיסטלי מהכוויה. חזור על הפעולה עבור שלושת הרבעים האחרים של הרשתית.
9. להזריק 100 μL של 1% פלואורסצין IP.
10. החלף את המצלמה למסנן של 488 ננומטר. הגדל את רווח המצלמה ל-5.
11. צלם תמונה של הפונדוס בדיוק 5 דקות לאחר הזרקת פלואורסצין.
    הערה: הימנע מחשיפה ממושכת של העין לאור המצלמה בהגדרה מרבית, מכיוון שפלואורסצאין עלול להחמיר את נזקי הרשתית. יש להרחיק את מקור האור עד שחלף זמן ההמתנה של 5 דקות והעכבר מוכן להדמיה.

3. טיפול לאחר הטיפול

1. להזריק 1 מ"ל של IP מלוחים סטרילי. יש למרוח טיפות עיניים עם חומר סיכה על שתי העיניים. יש למרוח משחת עיניים או דמעות מלאכותיות על שתי העיניים.
2. התבונן בעכבר כשהוא מתאושש מהרדמה. חזרו לכלוב עם בעלי חיים אחרים רק לאחר החלמה מלאה, בדרך כלל לאחר כ-40 דקות.

4. הערכה לקריטריונים לאי-הכללה

1. פתח את תמונת הפונדוס שצולמה בשעה 24 שעות לאחר ההליך כדי להעריך קריטריונים לאי-הכללה. אל תכלול את העין אם אחד מהקריטריונים הבאים מזוהה.
2. הערך אם לתמונה יש אפס חסימות
   1. הערך את התמונה עבור מספר כלי ההסתרה.
      הערה: חסימה מוצלחת כוללת בדרך כלל פיגמנטציה סגולה כלשהי על הכוויה או סביבה, כלי דם דק מאוד או לא רציף דרך הצריבה, מראה כלי דם קלוש או לא קיים מחוץ לאזור הכוויה, ושינוי צבע הרשתית מהיפוקסיה. אם ניתן לראות את כל הכלי דרך הכוויה הלבנה על ידי הלייזר, הכלי לא הצליח להסתיר. לפעמים הכלי ייראה חסום חלקית, אבל אם הוא נראה ללא הפרעה מחוץ לכוויה, סביר להניח שהכלי לא הסתתר.
   2. במקרים מעורפלים, השתמש בהדמיית FA באותה נקודת זמן כדי להעריך חסימות. בתמונות אלה, חסימה תופיע כשבירה בהמשכיות של כלי השיט, לעתים קרובות עם התחדדות של כלי השיט שמסביב.
   3. אם מזוהים אפס חסימות, להוציא את העין מן הניתוח, כמו RVO נחשב יעיל.
      הערה: הסתרות נפתרות בדרך כלל על ידי 48-72 שעות לאחר RVO, ואין להשתמש עוד בנוכחות של חסימות כקריטריון אי הכללה בנקודות זמן אלה.
3. להעריך את תמונות הפונדוס וה-OCT לניתוק יתר של הרשתית
   הערה: הצטברות נוזל תת-קרקעי נפוצה לאחר אינדוקציה של RVO, וגורמת להפרדה של הרשתית העצבית מ-RPE. קריטריונים לא כוללים לניתוק יתר של הרשתית מוגדרים באופן הבא: OCT יהיה בלתי ניתן לצפייה לחלוטין, או ששכבות מסוימות ייראו מעוותות להפליא. איכות התמונה ירודה, עם אובדן רזולוציה של שכבות plexiform ו- RPE חיצוניות. ההפרדה בין הרשתית העצבית לבין הכורואיד גדולה ממה ששדה הראייה OCT מאפשר. בתמונת הפונדוס, גוון הרשתית יהיה לבן כמעט לחלוטין, עם כתם סגול כלשהו. חלק מהרשתית עשוי להיראות מעוות ולא ממוקד. הסיבה לכך היא שהוא התנתק ונמצא במרחק מוקד שונה משאר הרשתית.
   1. אם הערכת התמונות מעין קובעת ניתוק היקפי או מלא של הרשתית, אל תכלול את העין מהניתוח.
4. לא לכלול תמונות עם עדות לקטרקט הקרנית
   הערה: קטרקט הקרנית מופיע כנקודה לבנה אטומה על הקרנית של העכבר. קטרקט מתרחש בדרך כלל עקב שימון לא מספיק של העיניים בזמן שבעל החיים מורדם וניתן להימנע ממנו במידה רבה על ידי הקפדה על מריחת משחת עיניים בנדיבות. בדרך כלל ניתן לזהות קטרקט לפני ההדמיה על ידי בדיקת החיה. עכברים שפיתחו קטרקט צריכים להיות מחוץ למערך הנתונים ללא צורך לעבור את תהליך ההדמיה. בהדמיה, קטרקט יסתיר את הרשתית מהמצלמה, וה- OCT ייראה מעוות.
5. להעריך את התמונה עבור דימום מוגזם
   הערה: ניתן לזהות דימום מוגזם ככמויות של נוזל אדום בתמונה, בדרך כלל תוך טשטוש רקע הרשתית, כלי הדם והכוויה. אזורים אלה של נוזל אדום יהיו אדומים בהירים ואטומים יותר מאשר הכתמים הסגולים הרגילים ב-RVO מוצלח. דימומים מופיעים בשכבת תאי הגנגליון בהדמיית OCT ומפריעים ליכולת לדמיין שכבות רשתית אחרות מתחת לדימום.
   1. אם התמונה נקבעת שיש דימום מוגזם, להוציא את העין מן הניתוח.

5. עיבוד תמונה פלואורסציני

1. פתח את תמונת הפלואורסצין בתוכנת עיבוד התמונה.
2. שכפול התמונה
3. באמצעות כלי בחירה, לעקוב בקפידה אחר הכלים העיקריים.
   1. כלי הדם העיקריים הם הוורידים והעורקים העבים יותר המקרינים מתוך הדיסק האופטי. התעלמו מכל כלי שיט המסתעפים מכלי שיט אלה.
   2. אם דליפה מונעת את קווי המתאר של כלי השיט מלהיראות ליד אתר החסימה, עקבו אחר הדליפה במיקום המשוער של כלי השיט (שמרו על עובי, חברו את הנקודה הגלויה האחרונה לנקודה הנראית הבאה).
4. בתמונה הראשונה, מחק את הבחירה והשאר רק את הרקע. שמור תמונה מוסווית זו.
5. הזיזו את הבחירה לתמונה השנייה, הפכו את הבחירה ומחקו, תוך בידוד הכלים. שמור תמונה מוסווית זו.
6. פתחו את שתי התמונות ב-ImageJ. פתח את תמונת הרקע ומדוד את הצפיפות המשולבת.
7. פתח את תמונת כלי השיט, בחר את קווי המתאר של כלי השיט ולאחר מכן מדוד את העוצמה הממוצעת.
8. חלקו את הצפיפות המשולבת של הרקע בעוצמה הממוצעת של כלי הדם, ויצרו את יחס הדליפה לעין.
9. רשום את יחס הדליפה הזה עבור כל עין בקבוצת ניסוי.
10. כדי להגביר את השליטה על הרקע, נרמלו את העיניים הניסיוניות ליחס הדליפה הממוצע של עיני בקרה לא פגועות.
    הערה: על מנת ליצור כימות סטנדרטי של דליפת פלואורסצין בתמונת FA, חישוב זה משתמש ביחס של צפיפות הרקע (היכן תהיה הדליפה) עם בהירות כלי הדם העיקריים כדי ליצור תוצאות השולטות בשונות בבהירות מתמונה לתמונה וניתן לכמת אותן באופן מהימן. עיניים שאינן פגומות אינן דולפות ובאופן תיאורטי אמורות להיות בעלות יחסים של אפס. היחסים המחושבים מעיני בקרה לא פגומות אלה, אם כן, מייצגים רעשי רקע, וערך זה משמש לנרמול נוסף של ערכים ניסיוניים.

6. עובי שכבת הרשתית

1. פתח את תמונת OCT בתוכנת עיבוד התמונה.
2. עקוב אחר הגבולות של שכבת תאי הגנגליון, שכבת הפרספקס הפנימית, השכבה הגרעינית הפנימית, שכבת הפלקסיפורם החיצונית, שכבת הפוטורצפטור ושכבת RPE. מדוד את העובי הממוצע של כל שכבה.
3. חזרו על הפעולה לקבלת תמונות OCT משלושת הרבעים האחרים של הרשתית. ממוצע עובי השכבה הממוצע על פני ארבעת הרבעים כדי לקבל את העובי הממוצע של כל שכבת רשתית לעין.
4. יש לחזור על הפעולה עבור כל עין בקבוצת הניסוי.

7. חוסר ארגון של שכבות פנימיות ברשתית (DRIL)

1. פתחו את תמונת ה-OCT ב-ImageJ.
2. בעזרת הכלי קו, מדוד את המרחק שבו הגבול העליון של שכבת הפרספקס החיצונית אינו ברור.
   הערה: חשוב להבדיל בין DRIL לבין אזורים בעלי נראות שכבה לקויה הנגרמת על-ידי ממצאי הדמיה. איכות תמונה ירודה של OCT עלולה לפסול עין לניתוח DRIL אם רזולוציית תמונה מספקת אינה אפשרית. תמונות עם DRIL יכללו בדרך כלל אזורים אחרים או שכבות רשתית שנפתרו ואורגנו בבירור, מה שיכול להוות אינדיקציה טובה לאיכות תמונה מספקת.
   1. מדוד אופקית מקו הרוחב שבו מתחיל חוסר הארגון ועד לקו הרוחב שבו הגבול העליון של שכבת הפלקסיפום החיצונית הופך שוב לגלוי, אם בכלל. גם אם שכבת הפרספקס החיצונית זזה כלפי מעלה או כלפי מטה אנכית, יש למדוד בצורה אופקית מושלמת.
   2. ייתכנו מספר אזורים של אי-ארגון המופרדים על-ידי אזורים ללא אי-ארגון. מדוד אותם בנפרד וחשב את סכום המרחקים.
3. חלקו את אורך אי-הארגון באורך הכולל של הרשתית הנראית בכל תמונת OCT כדי לקבל את יחס אי-הארגון של התמונה.
4. חזור על המדידה והחישוב עבור תמונות OCT משלושת הרבעים האחרים של הרשתית.
5. קח את הממוצע של יחסי חוסר הארגון מארבע תמונות OCT. מספר זה מייצג את חוסר הארגון הממוצע עבור הרשתית כולה. יש לחזור על הפעולה עבור כל עין בקבוצת הניסוי.

תוצאות

שיטות ניתוח אלה מאפשרות כימות של פתולוגיה רשתית שנלכדה על ידי הדמיית FA ו- OCT. בניסויים שמהם מופקים הנתונים המייצגים נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6J ששימשו כבקרות לא מרוסנות או עברו את הליך ה-RVO וקיבלו טיפות עיניים לטיפול Pen1-XBir3 או טיפות עיניים של Pen1-Saline. מודל הפציעה של RVO כלל את קרינת הלייזר (532 ?...

Discussion

הדמיית רשתית מכרסמים לא פולשנית מציגה דרך לחקור פתולוגיה ולפתח התערבויות. מחקרים קודמים פיתחו וייעלו מודל עכברי של RVO, המגבילים את השונות ומאפשרים תרגום אמין של פתולוגיות קליניות נפוצות ברשתית מורין ^5,7,13. התפתחויות בטכנולוגיית דימות עינ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AK-Fluor 10%	Akorn	NDC: 17478-253-10	light-sensitive
Carprofen	Rimadyl	NADA #141-199	keep at 4 °C
GenTeal	Alcon	00658 06401
Image J	NIH
InSight 2D	Phoenix Technology Group		OCT analysis software
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Phenylephrine	Akorn	NDCL174478-201-15
Phoenix Micron IV	Phoenix Technology Group		Retinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian Module	Phoenix Technology Group		Laser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography Module	Phoenix Technology Group		OCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix Module	Phoenix Technology Group		Fundus imaging and acquisition targeting
Photoshop	Adobe
Refresh	Allergan	94170
Tropicamide	Akorn	NDC: 174478-102-12
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20