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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se realizaron inyecciones intravítreas en el ojo de oveja con el objetivo de administrar terapia génica mediada por virus a la retina.

Resumen

Existen varios métodos para la administración de agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que llena la cámara posterior del ojo y mantiene la forma del globo ocular. Aunque la vía IVT es menos específica que la administración subretiniana, es mucho menos invasiva y se usa ampliamente en entornos clínicos para una variedad de enfermedades oculares.

Anteriormente demostramos la eficacia de la administración intravítrea de un producto de terapia génica mediado por virus adenoasociados (AAV) (AAV9). CLN5) en ovejas con una forma CLN5 natural de lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL). Las ovejas afectadas recibieron terapia génica IVT en un ojo, con el otro ojo no tratado sirviendo como control interno. La estructura y función de la retina se mantuvieron en el ojo tratado hasta 15 meses después del tratamiento, mientras que el ojo no tratado mostró una función progresivamente decreciente y atrofia severa durante el examen postmortem. Sobre la base de los estudios con ovejas, el producto de terapia génica CLN5 fue aprobado como un nuevo fármaco candidato en investigación (IND) por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos en septiembre de 2021. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un vector viral terapéutico al ojo ovino.

Introducción

Se pueden usar varios métodos para administrar agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. Cada vía de administración implica superar barreras como la barrera sangre-retina o las membranas limitantes internas y externas y tiene tasas variables de eficacia dependiendo del fármaco que se administra y del objetivo retiniano específico 1,2.

La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que ocupa la cámara posterior del ojo. La función princ....

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Lincoln y están en línea con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el cuidado y uso de animales en la investigación y la Ley de Bienestar Animal de Nueva Zelanda (1999). Las ovejas Borderdale fueron diagnosticadas al nacer14 años y mantenidas en granjas de investigación de la Universidad de Lincoln. Tres ovejas homocigotas de 3 meses de edad (CLN5-/-) recibieron una sola inyección de IVT en el ojo izquierdo, con el ojo derecho no tratado actuando como control interno. Los datos de electror....

Resultados

La eficacia de la administración de IVT de un vector de terapia génica CLN5 en la atenuación de la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL ha sido previamente demostrada por este grupo de investigación15. Las ovejas afectadas recibieron una única inyección IVT de 100 μL de CLN5 empaquetada en un vector AAV serotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) en un ojo, con el ojo contralateral sirviendo como un control interno no tratado. La visión se evaluó mensualmente desde la edad .......

Discusión

Las inyecciones intravítreas son uno de los procedimientos quirúrgicos más comunes en oftalmología humana y han demostrado ser eficaces en la administración de terapias génicas mediadas por AAV a la retina de las ovejas. Anteriormente habíamos demostrado la eficacia de AAV9. La terapia génica CLN5 administrada intravítreamente atenuando la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL15. Se espera que la traducción de esta vía de administración a pacientes humanos con.......

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Steve Heap (BVSc, CertVOphthal) por su ayuda en el establecimiento de este protocolo y la realización de las inyecciones descritas por Murray et al.15. Los autores también reconocen la financiación de CureKids New Zealand, la Fundación de Investigación Médica de Canterbury, Neurogene Inc y la Asociación de Apoyo e Investigación de la Enfermedad de Batten.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needleFisher Scientific, Auckland, New Zealand05-561-28Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tubeSigma AldrichHS4323Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops Teva Pharma Ltd, Auckland, New ZealandCommercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting mediumAbcam, Cambridge, United Kingdomab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States10236276001
Diazepam sedativeIlium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand5 mg/mL
Endotracheal tubesFlexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United KingdomStandard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculumCapes Medical Ltd, Tauranga, New ZealandKP151/14Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drapeAmtech Medical Ltd, Whanganui, New ZealandDI583Or similar 
Filter TipsInterlab, Auckland, New Zealand10, 200, and 1,000 µL 
Formaldehyde solution (37%)Fisher Scientific, Auckland, New ZealandAJA809-2.5PLMake up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594Invitrogen Carlsbad, CA, USA A-11012Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anestheticAttane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesicPhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)KaWe Medical, DenmarkMiller C blade, size 2
Needles Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand302025BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatoryBoehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand49402/008Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forcepsCapes Medical Ltd, Tauranga, New ZealandAB864/16Or similar 
Non-toothed hemostatCapes Medical Ltd, Tauranga, New ZealandAA150/12Or similar 
Normal goat serumThermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand16210072
Oxygen (medical)BOC Gas, Christchurch, New ZealandD2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand10010023Sterile, filtered
Povidone-Iodine solutionCapes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand005835Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)Dako, Glostrup, DenmarkZ0334Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5University of North Carolina Vector Core, NC, USA.scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV SolutionCapes Medical Ltd, Tauranga, New ZealandAHB1322Commercial name: Saline solution 
Subcutaneous antibioticsIntervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New ZealandCommercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors Capes Medical Ltd, Tauranga, New ZealandSSSHBLC130
Terumo Syringe Luer LockAmtech Medical Ltd, Whanganui, New ZealandSH159/SH160Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant PowderEBOS Group Ltd, Christchurch, NZ28461115

Referencias

  1. Himawan, E., et al. Drug delivery to retinal photoreceptors. Drug Discovery Today. 24 (8), 1637-1643 (2019).
  2. Murray, S. J., Mitchell, N. L. Ocular therapies for neuronal ceroid lipofuscinoses: More than meets the eye.

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