Inyecciones intravítreas en el ojo ovino

Resumen

Se realizaron inyecciones intravítreas en el ojo de oveja con el objetivo de administrar terapia génica mediada por virus a la retina.

Resumen

Existen varios métodos para la administración de agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que llena la cámara posterior del ojo y mantiene la forma del globo ocular. Aunque la vía IVT es menos específica que la administración subretiniana, es mucho menos invasiva y se usa ampliamente en entornos clínicos para una variedad de enfermedades oculares.

Anteriormente demostramos la eficacia de la administración intravítrea de un producto de terapia génica mediado por virus adenoasociados (AAV) (AAV9). CLN5) en ovejas con una forma CLN5 natural de lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL). Las ovejas afectadas recibieron terapia génica IVT en un ojo, con el otro ojo no tratado sirviendo como control interno. La estructura y función de la retina se mantuvieron en el ojo tratado hasta 15 meses después del tratamiento, mientras que el ojo no tratado mostró una función progresivamente decreciente y atrofia severa durante el examen postmortem. Sobre la base de los estudios con ovejas, el producto de terapia génica CLN5 fue aprobado como un nuevo fármaco candidato en investigación (IND) por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos en septiembre de 2021. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un vector viral terapéutico al ojo ovino.

Introducción

Se pueden usar varios métodos para administrar agentes terapéuticos a la retina, incluida la administración intravítrea (IVT), subretiniana, supracoroidea, periocular o tópica. Cada vía de administración implica superar barreras como la barrera sangre-retina o las membranas limitantes internas y externas y tiene tasas variables de eficacia dependiendo del fármaco que se administra y del objetivo retiniano específico ^1,2.

La administración de fármacos IVT implica una inyección en el humor vítreo del ojo, una sustancia gelatinosa que ocupa la cámara posterior del ojo. La función principal del humor vítreo es mantener la forma del globo ocular y mantener los tejidos oculares, como el cristalino y la retina, en su lugar. El humor vítreo está compuesto principalmente de agua, con pequeñas cantidades de colágeno, ácido hialurónico y otras proteínas no colágenas³. La inyección de IVT es un procedimiento simple y común utilizado rutinariamente para tratar una amplia gama de afecciones oculares, incluida la degeneración macular relacionada con la edad, el edema macular diabético, la retinopatía diabética, la oclusión de la vena retiniana y varias distrofias retinianas hereditarias ^4,5.

Lipofuscinosis neuronal ceroidea (NCL; Enfermedad de Batten) son un grupo de enfermedades mortales de almacenamiento lisosomal que causan una degeneración grave del cerebro y la retina. Actualmente hay 13 variantes conocidas de NCL resultantes de mutaciones en diferentes genes (CLN1-8, CLN10-14) que afectan predominantemente a los niños, pero tienen diferentes edades de inicio y gravedad de la enfermedad⁶. Las NCL comparten síntomas progresivos comunes, que incluyen deterioro cognitivo y motor, convulsiones y pérdida de la visión. No hay cura para la NCL; sin embargo, la terapia de reemplazo enzimático dirigida al cerebro se encuentra actualmente en ensayos clínicos para la enfermedad CLN2^7,8, y la terapia génica mediada por AAV ha demostrado ser muy prometedora en estudios preclínicos, con un ensayo clínico para la terapia génica CLN5 que se espera que comience en 2022 ^9,10.

Muchas otras especies desarrollan formas naturales de NCL, incluyendo gatos, perros, ovejas y vacas. Dos modelos ovinos de NCL están actualmente en estudio activo en Nueva Zelanda: un modelo de enfermedad CLN5 en ovejas de Borderdale y un modelo de enfermedad CLN6 en ovejas de South Hampshire. Las ovejas afectadas presentan muchas de las características clínicas y patológicas de la enfermedad humana, incluyendo atrofia retiniana y pérdida de visión^10,11. Aunque la terapia génica CLN5 dirigida al cerebro en ovejas con enfermedad CLN5 puede prevenir o detener la atrofia cerebral y el deterioro clínico, las ovejas tratadas aún pierden su visión⁹. Esto puso de manifiesto la necesidad de tratar la retina para preservar la visión y mantener una mejor calidad de vida, lo que llevó al establecimiento de un protocolo para la terapia génica ocular en ovejas.

El ojo de oveja representa un buen modelo del ojo humano debido a su similitud en las dimensiones del globo ocular, volumen vítreo y estructura retiniana^10,12,13. Este artículo detalla el protocolo quirúrgico para la administración de IVT de un pequeño volumen (≤100 μL) de vector viral terapéutico al ojo ovino.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Lincoln y están en línea con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el cuidado y uso de animales en la investigación y la Ley de Bienestar Animal de Nueva Zelanda (1999). Las ovejas Borderdale fueron diagnosticadas al nacer¹⁴ años y mantenidas en granjas de investigación de la Universidad de Lincoln. Tres ovejas homocigotas de 3 meses de edad (CLN5-^/-) recibieron una sola inyección de IVT en el ojo izquierdo, con el ojo derecho no tratado actuando como control interno. Los datos de electrorretinografía y patología se compararon con los datos históricos de control sanos y afectados. El vector viral utilizado en este estudio fue un virus adenoasociado autocomplementario serotipo 9, que contiene el promotor de la acción beta del pollo (CBh) y CLN5 ovino optimizado para codón (scAAV9 / CBh-oCLN5opt). El vector viral fue proporcionado por la Universidad de Carolina del Norte Vector Core, NC, EE.UU.

1. Precirugía

1. Autoclave del kit quirúrgico (Figura 1).
2. Ayunar las ovejas durante 24 h antes de la cirugía.
3. Registre los pesos vivos antes de la cirugía.

Figura 1: Botiquín de cirugía intravítrea. Los instrumentos necesarios para la cirugía de IVT incluyen (1) un espéculo para mantener los párpados abiertos y (2) un par de pinzas de nariz curva para agarrar la conjuntiva bulbar y rotar el ojo. (3) También se incluye un hemostático de nariz recta como instrumento alternativo para agarrar la conjuntiva bulbar y mantener el ojo en su lugar si ha retrocedido a la órbita del ojo. Este kit se esteriliza en autoclave antes de la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Procedimiento quirúrgico

1. Sujete al animal y, usando cortapelos electrónicos, afeite la lana de un lado del cuello sobre la vena yugular.
2. Ocluya la vena yugular aplicando presión en la base del surco yugular y visualice la vena elevada.
3. Extraiga la cantidad adecuada de diazepam (0,3 mg/kg) y ketamina (7,5 mg/kg) en una jeringa estéril y coloque una aguja estéril de 20 G. Inserte la aguja en la vena yugular y retire suavemente el émbolo para asegurarse de que la sangre ingrese al cubo y la aguja esté dentro de la vena. Una vez confirmado, inducir a través de la administración intravenosa (yugular).
4. Inmediatamente después de la inducción, coloque al animal en decúbito dorsal, extienda el cuello y sostenga la lengua hacia arriba y hacia adelante, usando un laringoscopio para visualizar la laringe. Realizar la intubación endotraqueal insertando suavemente un tubo endotraqueal (tamaño 6.0-9.0 dependiendo del tamaño de la oveja) entre las cuerdas vocales cuando el animal exhala. Infle el manguito endotraqueal inmediatamente y asegure el tubo con un lazo alrededor de la mandíbula inferior. Confirme el flujo de aire a través del tubo.
5. Transfiera la oveja a la mesa quirúrgica y colóquela en decúbito lateral.
6. Conecte inmediatamente el tubo endotraqueal a las mangueras de la máquina anestésica para la administración de isoflurano en oxígeno al 100%. Inicialmente comience con 3% -4% de isoflurano y luego reduzca a 2% -3% para el mantenimiento. Observar la ventilación espontánea de las ovejas.
7. Controle la frecuencia cardíaca (pulso), la frecuencia respiratoria, la saturación de oxígeno, los niveles de_CO2 al final de la espiración y la temperatura corporal rectal durante todo el procedimiento. Ver Tabla 1 para los valores fisiológicos para estos parámetros en ovejas anestesiadas (variable, pero usar como guía).
8. Coloque una cortina grande, estéril y cuadrada en un carro quirúrgico, seguido de los instrumentos estériles.
9. Coloque una cortina quirúrgica estéril y fenestrada sobre el ojo que se inyectará.
10. Desinfecte asépticamente el ojo con una jeringa estéril de 20 ml para irrigar el ojo con una solución de povidona yodada al 1-5%.
11. Aplique 1-2 gotas de solución oftálmica Alcaine 0.5% W/V, como anestésico local, en el ojo.
12. Coloque un espéculo de ojo de Nopa Barraquer-Colibrí (10 mm) en los párpados para mantener el ojo abierto.
13. Agarre la conjuntiva bulbar en la cara dorsolateral del ojo con fórceps y gire el globo ocular ventromedialmente.

	Consciente	Anestesiado	Punto crítico de intervención recomendado
Frecuencia cardíaca (latidos/min)	50-80 (descanso) a 280 (activo)	50-80	<50, >100
Frecuencia respiratoria (respiraciones/min)	15-40 (reposo) a 350 (sobrecalentado)	10-30	<8, >40
Saturación de oxígeno (mm Hg)	95-100	98-100	<90
CO2 al final de la marea (mm Hg)	35-45	35-45	>55
Temperatura corporal (°C)	38.5-39.5	38.5-39.5	<36, >40

Tabla 1: Valores fisiológicos de los parámetros a monitorizar en ovejas anestesiadas.

3. Preparación viral

1. Conservar las alícuotas vectoriales AAV a −80 °C hasta su uso.
2. El día de la cirugía, descongele el número requerido de viales para la administración de IVT en hielo.
3. Inmediatamente antes de la administración, vórtice la alícuota del vector viral y centrifugar a 400 × g durante 10 s para recoger el contenido.
4. Diluir cada alícuota del vector viral en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril filtrada 1x hasta la dosis deseada en un volumen final de 100 μL. Preparar diluciones vectoriales en un tubo estéril de microcentrífuga de baja unión a proteínas de 1,5 ml utilizando puntas de pipeta de filtro estériles. Deseche todos los consumibles que hayan estado en contacto con el vector viral en solución desinfectante (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: En la publicación original¹⁵ la dosis del agente terapéutico (AAV9. CLN5) fue 1,9 x 10¹⁰ genomas virales. La dosis recomendada variará dependiendo del agente terapéutico que se administre; Por lo tanto, no se ha incluido una dosis en el protocolo estándar presentado aquí.
5. Extraiga los 100 μL completos de la preparación del vector AAV en una jeringa estéril de 1 ml de espacio muerto bajo con una aguja de 28 G x 1/2 en permanentemente unida para inyección inmediata. Asegúrese de que el tiempo transcurrido desde la preparación hasta la inyección sea inferior a 2 minutos.

4. Administración viral

1. Inserte la aguja aproximadamente 7 mm posterior a la esclerótica en la cara lateral del ojo y en ángulo posterior para evitar la lente (Figura 2 y Figura 3). Administrar la inyección única de 100 μL como bolo lo más cerca posible de la retina sin alterar la superficie de la retina.
2. Enjuague el ojo con aproximadamente 10-15 ml de solución de povidona yodada al 1-5% seguida de 10 ml de solución salina antes de retirar el espéculo y la cortina.
3. Voltee las ovejas y repita con el otro ojo si es necesario.

Figura 2: Rotación ventromedial del globo ocular . (A) Agarre la conjuntiva bulbar con fórceps no dentados y (B) gire ventromedialmente (es decir, hacia abajo y hacia el hocico) para exponer la superficie dorsolateral del ojo para la inyección. Abreviaturas: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Ubicación y profundidad de la inyección. La aguja se inyecta en la cara dorsolateral del globo ocular y la longitud completa del eje de la aguja (0,5 pulgadas/12,7 mm) se inserta en el ojo. Tenga en cuenta el ángulo de la aguja hacia la parte posterior del ojo para evitar la lente e inyecte lo más cerca posible de la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Manejo postoperatorio

1. Al finalizar el procedimiento, detenga la anestesia por inhalación de gas isoflurano, enjuague la línea con oxígeno al 100%, desconecte la manguera del tubo endotraqueal y transfiera las ovejas a la sala de recuperación.
2. Coloque las ovejas en decúbito esternal, con las patas metidas debajo, y monitoree hasta su recuperación completa. Asegúrese de que la boca del animal esté libre de obstrucciones.
3. Cuando se observe el reflejo de deglución, desinfle parcialmente el manguito del tubo endotraqueal y retire suavemente el tubo de la boca.
4. Administre un antiinflamatorio no esteroideo intramuscular en el músculo bíceps femoral de la extremidad posterior, antibióticos subcutáneos en el lado del cuello o detrás del hombro y gotas oftálmicas de cloranfenicol al 0,5% en la superficie del globo ocular.
5. Proporcione agua y comida (pellets de alfalfa y paja) una vez que las ovejas puedan pararse sin ayuda.
6. Administrar gotas oftálmicas de cloranfenicol al 0,5% 2-3 por día durante 7 días después de la cirugía.
7. Mantenga las ovejas en el interior durante la noche antes de regresar al prado al aire libre aproximadamente 24 h después de la cirugía.
8. Registre las temperaturas rectales diariamente durante 3 semanas. Controle cualquier cambio en el pulso o la frecuencia respiratoria, el consumo de alimentos, el neurocomportamiento, la temperatura corporal, el peso, la postura, la salud ocular y los signos clínicos de mala salud. Busque tratamiento veterinario apropiado si hay indicios de eventos adversos.

6. Evaluación de la eficacia in vivo

1. Si el objetivo de la inyección de IVT es preservar la visión, monitoree la eficacia in vivo mediante métodos como la prueba de laberinto o la electrorretinografía (ERG) para evaluar la función de las células de la retina o la tomografía de coherencia óptica (OCT) para evaluar la estructura de la retina.
   NOTA: Estas medidas de eficacia han sido bien descritas después de la terapia génica IVT^11,15,16.

7. Análisis de tejido postmortem

1. Realizar la eutanasia ovina por un método aprobado en un punto final apropiado después de la cirugía de inyección intravítrea.
   NOTA: Los métodos de eutanasia sugeridos, como los medicamentos de eutanasia veterinaria intravenosa o un perno cautivo penetrante en la columna cervical seguido de una rápida exanguinación, se detallan en otra parte^15,16.
2. Coseche globos oculares de oveja usando tijeras curvas quirúrgicas afiladas / romas. Corte el canto lateral y medial para aumentar la abertura de la cuenca del ojo y luego corte sistemáticamente a través de los pliegues conjuntivales, el tejido conectivo, los músculos y el nervio óptico para liberar el globo ocular de la cuenca.
3. Fijación por inmersión de globos oculares intactos y enucleados en formalina al 10% durante 2 h, seguido de postfijación en la solución de Bouin durante 4 h, haciendo un corte pequeño (0,5 cm) en la esclerótica para permitir una perfusión suficiente. Alternativamente, fije por inmersión los globos oculares en la solución de Davidson durante 48 h.
4. Procesar secciones de tejido ocular a través de la incrustación y seccionamiento rutinario de cera de parafina a 3-5 μm.
   NOTA: Los procedimientos de tinción para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y el análisis inmunohistoquímico se han descrito previamente^15,16.
5. Evaluar la eficacia en el tejido postmortem mediante medidas como el grosor total de la retina, el grosor de la capa retiniana, los recuentos de filas celulares de la capa nuclear externa y la tinción inmunohistoquímica para los tipos de células de la retina, la glía retiniana o las proteínas de interés.
   NOTA: Para los protocolos para estos análisis, ver publicaciones anteriores^15,16.

Resultados

La eficacia de la administración de IVT de un vector de terapia génica CLN5 en la atenuación de la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL ha sido previamente demostrada por este grupo de investigación¹⁵. Las ovejas afectadas recibieron una única inyección IVT de 100 μL de CLN5 empaquetada en un vector AAV serotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) en un ojo, con el ojo contralateral sirviendo como un control interno no tratado. La visión se evaluó mensualmente desde la edad ...

Discusión

Las inyecciones intravítreas son uno de los procedimientos quirúrgicos más comunes en oftalmología humana y han demostrado ser eficaces en la administración de terapias génicas mediadas por AAV a la retina de las ovejas. Anteriormente habíamos demostrado la eficacia de AAV9. La terapia génica CLN5 administrada intravítreamente atenuando la disfunción retiniana y la degeneración en ovejas con CLN5 NCL¹⁵. Se espera que la traducción de esta vía de administración a pacientes humanos con...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	05-561-28	Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube	Sigma Aldrich	HS4323	Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor	Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops	Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand		Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	10236276001
Diazepam sedative	Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand		5 mg/mL
Endotracheal tubes	Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom		Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	KP151/14	Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	DI583	Or similar
Filter Tips	Interlab, Auckland, New Zealand		10, 200, and 1,000 µL
Formaldehyde solution (37%)	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	AJA809-2.5PL	Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen Carlsbad, CA, USA	A-11012	Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic	Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic	PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand		100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)	KaWe Medical, Denmark		Miller C blade, size 2
Needles	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	302025	BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory	Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand	49402/008	Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AB864/16	Or similar
Non-toothed hemostat	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AA150/12	Or similar
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	16210072
Oxygen (medical)	BOC Gas, Christchurch, New Zealand		D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	10010023	Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	005835	Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Dako, Glostrup, Denmark	Z0334	Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5	University of North Carolina Vector Core, NC, USA.	scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AHB1322	Commercial name: Saline solution
Subcutaneous antibiotics	Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand		Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	SH159/SH160	Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder	EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ	28461115