Küçükbaş Gözde İntravitreal Enjeksiyonlar

Özet

Koyun gözünde intravitreal enjeksiyonlar, retinaya viral aracılı gen tedavisi vermek amacıyla yapıldı.

Özet

Terapötik ajanların retinaya verilmesi için intravitreal (IVT), subretinal, suprakoroidal, perioküler veya topikal uygulama dahil olmak üzere çeşitli yöntemler vardır. IVT ilaç dağıtımı, gözün arka odasını dolduran ve göz küresinin şeklini koruyan jelatinimsi bir madde olan gözün vitreus mizahına bir enjeksiyon içerir. IVT yolu subretinal doğumdan daha az spesifik olarak hedeflenmiş olmasına rağmen, çok daha az invazivdir ve bir dizi oküler hastalık için klinik ortamlarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Daha önce adeno ilişkili virüs (AAV) aracılı bir gen terapisi ürününün (AAV9) intravitreal olarak verilmesinin etkinliğini göstermiştik. CLN5), doğal olarak oluşan CLN5 nöronal seroid lipofuscinosis (NCL) formuna sahip koyunlarda. Etkilenen koyunların bir gözünde IVT gen terapisi verilirken, diğer tedavi edilmeyen göz iç kontrol görevi gördü. Tedavi edilen gözde tedaviden 15 ay sonrasına kadar retinal yapı ve fonksiyon korunurken, tedavi edilmeyen gözde postmortem muayene sırasında giderek azalan fonksiyon ve ciddi atrofi görüldü. Koyun çalışmalarına dayanarak, CLN5 gen terapisi ürünü, Eylül 2021'de Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından aday bir araştırma yeni ilacı (IND) olarak temizlendi. Bu yazıda IVT'nin küçükbaş göze terapötik viral vektör verilmesi için cerrahi protokol detaylandırılmıştır.

Giriş

Retinaya terapötik ajanlar vermek için intravitreal (IVT), subretinal, suprakoroidal, perioküler veya topikal uygulama dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılabilir. Her uygulama yolu, kan-retina bariyeri veya iç ve dış sınırlayıcı membranlar gibi engellerin aşılmasını içerir ve verilen ilaca ve spesifik retinal hedefe bağlı olarak değişen etkinlik oranlarına sahiptir ^1,2.

IVT ilaç dağıtımı, gözün arka odasını kaplayan jelatinimsi bir madde olan gözün vitreus mizahına enjeksiyonu içerir. Vitröz mizahın birincil işlevi, göz küresinin şeklini korumak ve lens ve retina gibi oküler dokuları yerinde tutmaktır. Vitröz mizah, az miktarda kollajen, hyaluronik asit ve diğer kollajenöz olmayan proteinler içeren büyük ölçüde sudan oluşur³. IVT enjeksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, diyabetik makula ödemi, diyabetik retinopati, retinal ven tıkanıklığı ve çeşitli kalıtsal retina distrofileri dahil olmak üzere çok çeşitli oküler durumları tedavi etmek için rutin olarak kullanılan basit ve yaygın bir prosedürdür ^4,5.

Nöronal seroid lipofussinozlar (NCL; Batten hastalığı), beyin ve retinada ciddi dejenerasyona neden olan ölümcül lizozomal depo hastalıkları grubudur. Şu anda, ağırlıklı olarak çocukları etkileyen, ancak farklı başlangıç yaşlarına ve hastalık şiddetine sahip olan farklı genlerdeki (CLN1-8, CLN10-14) mutasyonlardan kaynaklanan 13 bilinen NCL varyantı vardır⁶. NCL'ler, bilişsel ve motor gerileme, nöbetler ve görme kaybı gibi ortak ilerleyici semptomları paylaşır. NCL'nin tedavisi yoktur; Bununla birlikte, beyne yönelik enzim replasman tedavisi şu anda CLN2 hastalığı^7,8 için klinik çalışmalardadır ve AAV aracılı gen terapisi, CLN5 gen terapisi için klinik bir araştırmanın 2022'de başlaması beklenen klinik çalışmalarla klinik öncesi çalışmalarda büyük umut vaat etmiştir ^9,10.

Diğer birçok tür, kediler, köpekler, koyunlar ve inekler de dahil olmak üzere doğal olarak oluşan NCL formları geliştirir. NCL'nin iki küçükbaş hayvan modeli şu anda Yeni Zelanda'da aktif olarak çalışılmaktadır: Borderdale koyunlarında bir CLN5 hastalık modeli ve Güney Hampshire koyunlarında bir CLN6 hastalık modeli. Etkilenen koyunlar, retina atrofisi ve görme kaybı da dahil olmak üzere insan hastalığının klinik ve patolojik özelliklerinin çoğunu sergiler^10,11. CLN5 hastalığı olan koyunlarda beyne yönelik CLN5 gen terapisi beyin atrofisini ve klinik düşüşü önleyebilse veya durdurabilse de, tedavi edilen koyunlar hala vizyonlarını kaybeder⁹. Bu, görüşü korumak ve daha iyi bir yaşam kalitesini korumak için retinayı tedavi etme ihtiyacını vurguladı ve koyunlarda oküler gen tedavisi için bir protokol oluşturulmasına yol açtı.

Koyun gözü, göz küre boyutları, vitreus hacmi ve retinal yapı^{10,12,13'teki} benzerliği nedeniyle insan gözünün iyi bir modelini temsil eder. Bu yazıda IVT'nin küçükbaş göze küçük hacimli (≤100 μL) terapötik viral vektörün verilmesi için cerrahi protokol detaylandırılmıştır.

Protokol

Tüm deneysel protokoller Lincoln Üniversitesi Hayvan Etiği komitesi tarafından onaylanmıştır ve araştırmalarda hayvanların bakımı ve kullanımı için ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzları ve Yeni Zelanda Hayvan Refahı Yasası (1999) ile uyumludur. Borderdale koyunları^{doğum 14'te} teşhis edildi ve Lincoln Üniversitesi araştırma çiftliklerinde tutuldu. 3 aylık üç homozigot (CLN5-^/-) koyun, sol göze tek bir IVT enjeksiyonu yapıldı ve tedavi edilmeyen sağ göz iç kontrol görevi gördü. Elektroretinografi ve patoloji verileri tarihsel sağlıklı ve etkilenmiş kontrol verileriyle karşılaştırıldı. Bu çalışmada kullanılan viral vektör, tavuk beta etkisi (CBh) promotörü ve kodon ile optimize edilmiş küçükbaş hayvan CLN5 (scAAV9 / CBh-oCLN5opt) içeren, kendi kendini tamamlayan adeno ilişkili bir virüs serotip 9 idi. Viral vektör, Kuzey Carolina Vector Core, NC, ABD Üniversitesi tarafından sağlanmıştır.

1. Ameliyat öncesi

1. Cerrahi kiti otoklav edin (Şekil 1).
2. Koyunları ameliyattan önce 24 saat boyunca oruç tutun.
3. Ameliyattan önce canlı ağırlıkları kaydedin.

Resim 1: İntravitreal cerrahi kit. IVT cerrahisi için gerekli aletler arasında (1) göz kapaklarını açık tutmak için bir spekulum ve (2) bulber konjonktivayı kavramak ve gözü döndürmek için bir çift kavisli burun forseps bulunur. (3) Düz bir burun hemostatı, bulber konjonktivayı kavramak ve göz yörüngesine geri dönmüşse gözü yerinde tutmak için alternatif bir araç olarak da dahil edilir. Bu kit ameliyattan önce otoklavlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Cerrahi prosedür

1. Hayvanı kısıtlayın ve elektronik makaslar kullanarak, yünü boynun bir tarafından juguler damar üzerinde tıraş edin.
2. Juguler oluğun tabanına basınç uygulayarak juguler veni tıkayın ve yükseltilmiş damarı görselleştirin.
3. Uygun miktarda diazepam (0.3 mg / kg) ve ketamin (7.5 mg / kg) steril bir şırıngaya çekin ve steril bir 20 G iğne takın. İğneyi juguler damara yerleştirin ve kanın göbeğe girdiğinden ve iğnenin damarın içinde olduğundan emin olmak için yavaşça pistona geri çekin. Doğrulandıktan sonra, intravenöz (juguler) uygulama yoluyla indükleyin.
4. İndüksiyondan hemen sonra, hayvanı dorsal yassılığa yerleştirin, boynu uzatın ve larinksi görselleştirmek için bir laringoskop kullanarak dili yukarı ve ileri doğru tutun. Hayvan nefes verirken ses telleri arasına nazikçe bir endotrakeal tüp (koyunun büyüklüğüne bağlı olarak 6.0-9.0 boyutu) yerleştirerek endotrakeal entübasyon yapın. Endotrakeal manşeti hemen şişirin ve tüpü alt çenenin etrafında bir bağ ile sabitleyin. Tüpten hava akışını onaylayın.
5. Koyunları ameliyat masasına aktarın ve yanal yassılığa yerleştirin.
6. Endotrakeal tüpü% 100 oksijende izofluran verilmesi için derhal anestezik makinenin hortumlarına bağlayın. Başlangıçta% 3 -% 4 izofluran ile başlayın ve daha sonra bakım için% 2 -% 3'e düşürün. Koyunların kendiliğinden havalandırılmasını gözlemleyin.
7. İşlem boyunca kalp (nabız) hızını, solunum hızını, oksijen doygunluğunu, son gelgit CO₂ seviyelerini ve rektal vücut ısısını izleyin. Anestezi uygulanan koyunlarda bu parametrelerin fizyolojik değerleri için Tablo 1'e bakınız (değişken, ancak kılavuz olarak kullanın).
8. Cerrahi bir ameliyat arabasına büyük, steril, kare bir örtü yerleştirin, ardından steril aletler yerleştirin.
9. Steril, federe bir cerrahi örtüyü enjekte edilecek gözün üzerine yerleştirin.
10. Gözü% 1-5 povidon-iyot çözeltisi ile sulamak için steril bir 20 mL şırınga kullanarak gözü aseptik olarak dezenfekte edin.
11. Göze lokal anestezik olarak 1-2 damla Alcaine% 0.5 W / V oftalmik solüsyon uygulayın.
12. Gözü açık tutmak için göz kapaklarına bir Nopa Barraquer-Colibri göz spekulumu (10 mm) takın.
13. Forseps ile gözün dorsolateral kısmındaki bulber konjonktivayı kavrayın ve göz küresini ventromedial olarak döndürün.

	Farkında	Anestezi uygulanmış	Önerilen kritik müdahale noktası
Kalp atış hızı (atım/dak)	50-80 (dinlenme) ila 280 (aktif)	50-80	<50, >100
Solunum hızı (nefes/dk)	15-40 (dinlenme) ila 350 (aşırı ısınmış)	10-30	<8, >40
Oksijen doygunluğu (mm Hg)	95-100	98-100	<90
Son gelgit CO2 (mm Hg)	35-45	35-45	>55
Vücut ısısı (°C)	38.5-39.5	38.5-39.5	<36, >40

Tablo 1: Anestezi uygulanan koyunlarda izlenecek parametrelerin fizyolojik değerleri.

3. Viral hazırlık

1. AAV vektör alikotlarını kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.
2. Ameliyat gününde, buzda IVT teslimatı için gerekli sayıda şişeyi çözün.
3. Uygulamadan hemen önce, viral vektör aliquot'u vorteksleyin ve içeriği toplamak için 10 s boyunca 400 × g'de santrifüj yapın.
4. Her viral vektör aliquotunu steril filtrelenmiş 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde istenen doza 100 μL'lik son hacimde seyreltin. steril filtre pipet uçlarını kullanarak steril 1,5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpünde vektör seyreltmeleri hazırlayın. Viral vektörle temas eden tüm sarf malzemelerini dezenfektan çözeltisine atın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Orijinal yayında¹⁵ terapötik ajanın dozu (AAV9. CLN5) 1.9 x 10¹⁰ viral genom idi. Önerilen dozaj, uygulanan terapötik ajana bağlı olarak değişecektir; bu nedenle, burada sunulan standart protokole bir dozaj dahil edilmemiştir.
5. AAV vektör preparatının tam 100 μL'sini, derhal enjeksiyon için iğneye kalıcı olarak tutturulmuş 28 G x 1/2 ile steril, düşük ölü alanlı 1 mL şırıngaya çekin. Hazırlıktan enjeksiyona kadar geçen sürenin 2 dakikadan az olduğundan emin olun.

4. Viral uygulama

1. İğneyi gözün lateral tarafındaki skleraya yaklaşık 7 mm posterior olarak yerleştirin ve lensten kaçınmak için posterioral olarak açılı olarak yerleştirin (Şekil 2 ve Şekil 3). 100 μL'lik tek enjeksiyonu, retina yüzeyini rahatsız etmeden retinaya mümkün olduğunca yakın bir bolus olarak uygulayın.
2. Spekulum ve perdenin çıkarılmasından önce gözü yaklaşık 10-15 mL% 1-5 povidon-iyot çözeltisi ve ardından 10 mL salin ile durulayın.
3. Koyunları ters çevirin ve gerekirse diğer gözle tekrarlayın.

Şekil 2: Göz küresinin ventromedial dönüşü. (A) Bulber konjonktivayı dişsiz forseps ile kavrayın ve (B) enjeksiyon için gözün dorsolateral yüzeyini açığa çıkarmak için ventromedial olarak (yani buruna doğru) döndürün. Kısaltmalar: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = yanal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Enjeksiyon yeri ve derinliği. İğne, göz küresinin dorsolateral yönüne enjekte edilir ve iğne milinin tam uzunluğu (0,5 inç / 12,7 mm) göze yerleştirilir. Lensten kaçınmak için iğnenin gözün arka tarafına doğru açısına dikkat edin ve retinaya mümkün olduğunca yakın enjekte edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Postoperatif yönetim

1. İşlemin tamamlanması üzerine, izofluran gazı inhalasyon anestezisini durdurun, hattı% 100 oksijenle yıkayın, hortumu endotrakeal tüpten ayırın ve koyunları iyileşme odasına aktarın.
2. Koyunları sternal yassılığa yerleştirin, bacaklar altına sıkışmış olarak ve tamamen iyileşene kadar izleyin. Hayvanın ağzının herhangi bir tıkanıklıktan arındırıldığından emin olun.
3. Yutma refleksi gözlendiğinde, endotrakeal tüpün manşetini kısmen söndürün ve tüpü ağızdan yavaşça çıkarın.
4. Arka ekstremitenin biseps femoris kasına, boynun yan tarafında veya omzun arkasında deri altı antibiyotiklere intramüsküler bir nonsteroidal anti-enflamatuar uygulayın ve% 0.5 kloramfenikol göz küresinin yüzeyine düşer.
5. Koyunlar yardımsız durabildiğinde su ve yiyecek (lucerne peletleri ve saman) sağlayın.
6. Ameliyat sonrası 7 gün boyunca% 0.5 kloramfenikol göz damlası günde 2-3 damla uygulayın.
7. Koyunları ameliyattan yaklaşık 24 saat sonra açık hava padokuna dönmeden önce gece boyunca içeride tutun.
8. 3 hafta boyunca günlük rektal sıcaklıkları kaydedin. Nabız veya solunum hızı, gıda tüketimi, nörodavranış, vücut ısısı, kilo, duruş, göz sağlığı ve klinik hastalık belirtilerindeki değişiklikleri izleyin. Herhangi bir yan etki belirtisi varsa uygun veteriner tedavisi isteyin.

6. İn vivo etkinliğin değerlendirilmesi

1. IVT enjeksiyonunun amacı görmeyi korumaksa, retina hücre fonksiyonunu değerlendirmek için labirent testi veya elektroretinografi (ERG) veya retina yapısını değerlendirmek için optik koherens tomografi (OCT) gibi yöntemlerle in vivo etkinliği izleyin.
   NOT: Bu etkinlik ölçümleri IVT gen terapisi^11,15,16'yı takiben iyi tanımlanmıştır.

7. Postmortem doku analizi

1. İntravitreal enjeksiyon ameliyatını takiben uygun bir son noktada onaylanmış bir yöntemle koyun ötenazisi uygulayın.
   NOT: İntravenöz veteriner ötenazi ilaçları veya servikal omurgaya nüfuz eden bir esir cıvata ve ardından hızlı ekssanguinasyon gibi önerilen ötenazi yöntemleri, başka bir yerde detaylandırılmıştır^15,16.
2. Cerrahi keskin/künt kavisli makas kullanarak koyun gözü kürelerini hasat edin. Göz yuvası açıklığını arttırmak için lateral ve medial kanthus kesin ve daha sonra göz küresini soketten serbest bırakmak için konjonktival kıvrımları, bağ dokusunu, kasları ve optik siniri sistematik olarak kesin.
3. Daldırma-sabitleme bozulmamış, enüklee göz küreleri 2 saat boyunca% 10 formalin içinde, ardından Bouin çözeltisinde 4 saat boyunca postfiksasyon ile yeterli perfüzyona izin vermek için sklerada küçük (0.5 cm) bir kesim yapılır. Alternatif olarak, göz kürelerini Davidson'un çözeltisine daldırarak 48 saat boyunca sabitleyin.
4. Göz dokusunun kesitlerini rutin parafin balmumu gömme ve 3-5 μm'de kesitleme yoluyla işleyin.
   NOT: Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama ve immünohistokimyasal analiz için boyama prosedürleri daha önce^15,16 olarak tanımlanmıştır.
5. Postmortem dokudaki etkinliği, toplam retina kalınlığı, retina tabakası kalınlığı, dış nükleer tabaka hücresel sıralarının sayıları ve retinal hücre tipleri, retinal glia veya ilgilenilen proteinler için immünohistokimyasal boyama gibi ölçümlerle değerlendirin.
   NOT: Bu analizlere ilişkin protokoller için önceki^{yayınlara bakınız 15,16}.

Sonuçlar

CLN5 NCL'li koyunlarda retinal disfonksiyon ve dejenerasyonun azaltılmasında bir CLN5 gen terapisi vektörünün IVT verilmesinin etkinliği daha önce bu araştırma grubu¹⁵ tarafından gösterilmiştir. Etkilenen koyunlara, bir AAV serotip 9 (AAV9) vektöründe (AAV9) paketlenmiş tek bir 100 μL IVT CLN5 enjeksiyonu yapıldı. CLN5) bir göze, kontralateral göz tedavi edilmemiş bir iç kontrol görevi görür. Görme, enjeksiyon yaşından (3 ay) son dönem hastalığına (18 ay) kadar ayl?...

Tartışmalar

İntravitreal enjeksiyonlar, insan oftalmolojisinde en yaygın cerrahi prosedürlerden biridir ve koyunların retinasına AAV aracılı gen terapilerinin uygulanmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır. Daha önce AAV9'un etkinliğini göstermiştik. CLN5 gen tedavisi, CLN5 NCL¹⁵ ile koyunlarda retinal disfonksiyon ve dejenerasyonun azaltılmasında intravitreal olarak sağlandı. Bu uygulama yolunun insan NCL hastalarına çevrilmesinin de faydalı olacağı umulmaktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	05-561-28	Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube	Sigma Aldrich	HS4323	Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor	Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops	Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand		Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	10236276001
Diazepam sedative	Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand		5 mg/mL
Endotracheal tubes	Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom		Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	KP151/14	Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	DI583	Or similar
Filter Tips	Interlab, Auckland, New Zealand		10, 200, and 1,000 µL
Formaldehyde solution (37%)	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	AJA809-2.5PL	Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen Carlsbad, CA, USA	A-11012	Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic	Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic	PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand		100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)	KaWe Medical, Denmark		Miller C blade, size 2
Needles	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	302025	BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory	Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand	49402/008	Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AB864/16	Or similar
Non-toothed hemostat	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AA150/12	Or similar
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	16210072
Oxygen (medical)	BOC Gas, Christchurch, New Zealand		D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	10010023	Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	005835	Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Dako, Glostrup, Denmark	Z0334	Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5	University of North Carolina Vector Core, NC, USA.	scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AHB1322	Commercial name: Saline solution
Subcutaneous antibiotics	Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand		Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	SH159/SH160	Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder	EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ	28461115