Интравитреальные инъекции в ячий глаз

Резюме

Интравитреальные инъекции проводились в овечий глаз с целью доставки вирусно-опосредованной генной терапии к сетчатке.

Аннотация

Существует несколько методов доставки терапевтических средств к сетчатке, включая интравитреальное (IVT), субретинальное, супрахориоидальное, периокулярное или местное введение. Доставка препарата IVT включает инъекцию в стекловидное тело глаза, желатиновое вещество, которое заполняет заднюю камеру глаза и поддерживает форму глазного шара. Хотя путь IVT менее специфичен, чем субретинальная доставка, он гораздо менее инвазивный и широко используется в клинических условиях для ряда глазных заболеваний.

Ранее мы продемонстрировали эффективность интравитреальной доставки продукта генной терапии, опосредованного аденоассоциированным вирусом (AAV) (AAV9. CLN5) у овец с естественной формой CLN5 нейронального цероидного липофусциноза (NCL). Пораженные овцы получали генную терапию IVT в одном глазу, а другой необработанный глаз служил внутренним контролем. Структура и функция сетчатки сохранялись в обработанном глазу в течение 15 месяцев после лечения, в то время как необработанный глаз демонстрировал прогрессирующее снижение функции и тяжелую атрофию во время патологоанатомического исследования. Основываясь на исследованиях на овцах, продукт генной терапии CLN5 был одобрен в качестве кандидата в исследуемые новые препараты (IND) Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США в сентябре 2021 года. В этой статье подробно описывается хирургический протокол доставки IVT терапевтического вирусного вектора в овечий глаз.

Введение

Несколько методов могут быть использованы для доставки терапевтических агентов к сетчатке, включая интравитреальное (IVT), субретинальное, супрахороидальное, периокулярное или местное введение. Каждый путь введения включает преодоление барьеров, таких как барьер крови-сетчатки или внутренняя и внешняя ограничивающие мембраны, и имеет различные показатели эффективности в зависимости от доставляемого препарата и конкретной мишени^{сетчатки 1,2}.

Доставка препарата IVT включает инъекцию в стекловидное тело глаза, студенистое вещество, которое занимает заднюю камеру глаза. Основная функция стекловидного тела заключается в поддержании формы глазного шара и удержании глазных тканей, таких как хрусталик и сетчатка, на месте. Стекловидное тело состоит в основном из воды, с небольшим количеством коллагена, гиалуроновой кислоты и других неколлагеновых белков³. Инъекция IVT является простой и распространенной процедурой, обычно используемой для лечения широкого спектра глазных состояний, включая возрастную макулярную дегенерацию, диабетический макулярный отек, диабетическую ретинопатию, окклюзию вен сетчатки и несколько наследственных дистрофий сетчатки ^4,5.

Нейрональные цероидные липофусцинозы (NCL; Болезнь Баттена) представляют собой группу смертельных лизосомальных заболеваний хранения, которые вызывают тяжелую дегенерацию мозга и сетчатки. В настоящее время известно 13 вариантов NCL, возникающих в результате мутаций в различных генах (CLN1-8, CLN10-14), которые преимущественно поражают детей, но имеют различный возраст начала и тяжесть заболевания⁶. НКЛ имеют общие прогрессирующие симптомы, включая когнитивное и двигательное снижение, судороги и потерю зрения. Не существует лекарства от NCL; тем не менее, ферментозаместительная терапия, направленная на мозг, в настоящее время находится в клинических испытаниях для болезни CLN2 ^7,8, а генная терапия, опосредованная AAV, показала большие перспективы в доклинических исследованиях, а клиническое испытание генной терапии CLN5, как ожидается, начнется в 2022 ^{году 9,10}.

Многие другие виды развивают естественные формы NCL, включая кошек, собак, овец и коров. Две модели NCL овец в настоящее время активно изучаются в Новой Зеландии: модель болезни CLN5 у овец Бордердейла и модель болезни CLN6 у овец Южного Гемпшира. Пораженные овцы проявляют многие клинические и патологические особенности заболевания человека, включая атрофию сетчатки и потерю зрения^10,11. Хотя генная терапия CLN5, направленная на мозг, у овец с болезнью CLN5 может предотвратить или остановить атрофию мозга и клиническое снижение, обработанные овцы все еще теряют зрение⁹. Это подчеркнуло необходимость лечения сетчатки для сохранения зрения и поддержания лучшего качества жизни, что привело к созданию протокола для глазной генной терапии у овец.

Овечий глаз представляет собой хорошую модель человеческого глаза из-за его сходства в размерах глазного шара, объеме стекловидного тела и^{структуре} сетчатки ^10,12,13. В этой статье подробно описывается хирургический протокол доставки IVT небольшого объема (≤100 мкл) терапевтического вирусного вектора в овечий глаз.

протокол

Все экспериментальные протоколы были одобрены комитетом по этике животных Университета Линкольна и соответствуют руководящим принципам Национального института здравоохранения США по уходу и использованию животных в исследованиях и Закону о благополучии животных Новой Зеландии (1999). Овцы Бордердейл были диагностированы при рождении¹⁴ лет и содержались на исследовательских фермах Университета Линкольна. Три 3-месячных гомозиготных (CLN5^-/-) овца получили одну инъекцию IVT в левый глаз, причем необработанный правый глаз действовал как внутренний контроль. Данные электроретинографии и патологии сравнивались с историческими здоровыми и пораженными контрольными данными. Вирусный вектор, использованный в этом исследовании, представлял собой самокомплементарный аденоассоциированный вирус серотипа 9, содержащий промотор бета-действия курицы (CBh) и оптимизированную для кодона овец CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt). Вирусный вектор был предоставлен Университетом Северной Каролины Vector Core, NC, США.

1. Предоперационная работа

1. Автоклав хирургического набора (рисунок 1).
2. Голодайте овец в течение 24 ч перед операцией.
3. Записывайте живой вес перед операцией.

Рисунок 1: Комплект для интравитреальной хирургии. Инструменты, необходимые для операции IVT, включают (1) зеркало для удержания век открытыми и (2) пару изогнутых щипцов для захвата бульбарной конъюнктивы и вращения глаза. (3) Гемостат прямого носа также включен в качестве альтернативного инструмента для захвата бульбарной конъюнктивы и удержания глаза на месте, если он откатился обратно на глазную орбиту. Этот набор автоклавируется перед операцией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Хирургическая процедура

1. Сдерживайте животное и с помощью электронных кусачек сбривайте шерсть с одной стороны шеи над яремной веной.
2. Закупорите яремную вену, оказав давление на основание яремной бороздки и визуализируйте приподнятую вену.
3. Вытяните соответствующее количество диазепама (0,3 мг/кг) и кетамина (7,5 мг/кг) в стерильный шприц и приложите стерильную иглу весом 20 г. Вставьте иглу в яремную вену и осторожно потяните обратно на поршень, чтобы убедиться, что кровь поступает в концентратор, а игла находится внутри вены. После подтверждения индуцируют путем внутривенного (яремного) введения.
4. Сразу после индукции поместите животное в спинное лежание, вытяните шею и держите язык вверх и вперед, используя ларингоскоп для визуализации гортани. Выполните эндотрахеальную интубацию, аккуратно вставив эндотрахеальную трубку (размер 6,0-9,0 в зависимости от размера овцы) между голосовыми связками, когда животное выдыхает. Немедленно надуйте эндотрахеальную манжету и закрепите трубку завязкой вокруг нижней челюсти. Подтвердите поток воздуха через трубку.
5. Переложите овцу на хирургический стол и поместите ее в боковое отделение.
6. Немедленно подключите эндотрахеальную трубку к шлангам анестезиологического аппарата для доставки изофлурана в 100% кислороде. Первоначально начинают с 3%-4% изофлурана, а затем уменьшают до 2%-3% для поддержания. Наблюдайте за спонтанной вентиляцией овец.
7. Мониторинг частоты сердечных сокращений (пульса), частоты дыхания, насыщения кислородом, конечных приливных уровней CO₂ и ректальной температуры тела на протяжении всей процедуры. Физиологические значения этих параметров у обезболенных овец (переменные, но используются в качестве ориентира) см. в таблице 1 .
8. Поместите большую, стерильную, квадратную драпировку на хирургическую операционную тележку, а затем стерильные инструменты.
9. Поместите стерильную, фенестрированную хирургическую драпировку над глазом для инъекции.
10. Асептически дезинфицировать глаза с помощью стерильного шприца объемом 20 мл для орошения глаз 1-5% раствором повидона-йода.
11. Нанесите 1-2 капли Alcaine 0,5% W/V офтальмологического раствора, в качестве местного анестетика, на глаза.
12. Поднесите зеркало глаза Nopa Barraquer-Colibri (10 мм) к векам, чтобы держать глаза открытыми.
13. Захватите бульбарную конъюнктиву на дорсолатеральном аспекте глаза щипцами и вращайте глазной шар вентромедиально.

	Сознательный	Под наркозом	Рекомендуемая критическая точка вмешательства
Частота сердечных сокращений (уд/мин)	от 50-80 (отдых) до 280 (активный)	50-80	<50, >100
Частота дыхания (вдох/мин)	15-40 (отдых) до 350 (перегрев)	10-30	<8, >40
Насыщение кислородом (мм рт.ст.)	95-100	98-100	<90
Конечный прилив CO2 (мм рт.ст.)	35-45	35-45	>55
Температура тела (°C)	38.5-39.5	38.5-39.5	<36, >40

Таблица 1: Физиологические значения параметров, подлежащих мониторингу у обезболенных овец.

3. Вирусная подготовка

1. Храните векторные аликвоты AAV при температуре −80 °C до использования.
2. В день операции разморозьте необходимое количество флаконов для доставки ИВТ на льду.
3. Непосредственно перед введением вихрь вирусной векторной аликвоты и центрифуги при 400 × г в течение 10 с для сбора содержимого.
4. Разбавьте каждый вирусный вектор аликвоты в стерильно-фильтрованном 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) до желаемой дозы в конечном объеме 100 мкл. Подготовьте векторные разведения в стерильной 1,5 мл низкобелковосвязывающей микроцентрифуги с использованием стерильных фильтрующих наконечников пипеток. Утилизируйте все расходные материалы, контактировавшие с вирусным переносчиком, в дезинфицирующем растворе (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В оригинальной публикации¹⁵ указана доза терапевтического средства (AAV9. CLN5) составил 1,9 х 10¹⁰ вирусных геномов. Рекомендуемая дозировка будет варьироваться в зависимости от вводимого терапевтического средства; поэтому дозировка не была включена в стандартный протокол, представленный здесь.
5. Нарисуйте все 100 мкл векторного препарата AAV в стерильный шприц объемом 1 мл с постоянно прикрепленной иглой 28 G x 1/2 для немедленной инъекции. Убедитесь, что продолжительность времени от приготовления до инъекции составляет менее 2 мин.

4. Вирусное введение

1. Вставьте иглу примерно на 7 мм сзади к склере в боковом аспекте глаза и под углом кзади, чтобы избежать хрусталика (рисунок 2 и рисунок 3). Вводят однократную инъекцию 100 мкл в виде болюса как можно ближе к сетчатке, не нарушая поверхность сетчатки.
2. Промыть глаза примерно 10-15 мл 1-5% раствора повидона-йода с последующим 10 мл физиологического раствора перед удалением зеркала и драпировки.
3. Переверните овцу и повторите другим глазом, если это необходимо.

Рисунок 2: Вентромедиальное вращение глазного шара. (А) Захватите бульбарную конъюнктиву с незубчатыми щипцами и (Б) вращайте вентромедиально (т.е. вниз и к морде), чтобы обнажить дорсолатеральную поверхность глаза для инъекции. Сокращения: V = вентральный, D = дорсальный, M = медиальный, L = латеральный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Расположение и глубина впрыска. Игла вводится в дорсолатеральный аспект глазного шара, а в глаз вводится вся длина ствола иглы (0,5 дюйма / 12,7 мм). Обратите внимание на угол иглы к задней части глаза, чтобы избежать хрусталика и сделать инъекцию как можно ближе к сетчатке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Послеоперационное лечение

1. По завершении процедуры прекратите ингаляционную анестезию газом изофлуран, промойте линию 100% кислородом, отсоедините шланг от эндотрахеальной трубки и переведите овец в послеоперационную палату.
2. Поместите овец в стернальную ложбину, подвернув ноги под нее, и следите за полным выздоровлением. Убедитесь, что рот животного очищен от любых препятствий.
3. При соблюдении глотательного рефлекса частично сдувают манжету эндотрахеальной трубки и аккуратно вынимают трубку изо рта.
4. Вводят внутримышечное нестероидное противовоспалительное средство в мышцу бицепса бедра задней конечности, подкожные антибиотики на стороне шеи или за плечом и 0,5% хлорамфеникол глазных капель на поверхность глазного шара.
5. Обеспечьте воду и пищу (гранулы люцерны и плевелы), как только овца сможет стоять без посторонней помощи.
6. Вводят 0,5% хлорамфеникол глазных капель 2-3 в день в течение 7 дней после операции.
7. Держите овец в помещении на ночь, прежде чем вернуться в открытый загон примерно через 24 часа после операции.
8. Записывайте ректальные температуры ежедневно в течение 3 недель. Следите за любыми изменениями пульса или частоты дыхания, потреблением пищи, нейроповедением, температурой тела, весом, осанкой, здоровьем глаз и клиническими признаками плохого самочувствия. Обратитесь за соответствующей ветеринарной помощью, если есть какие-либо признаки неблагоприятных событий.

6. Оценка эффективности in vivo

1. Если целью инъекции IVT является сохранение зрения, контролируйте эффективность in vivo с помощью таких методов, как тестирование лабиринта или электроретинография (ERG) для оценки функции клеток сетчатки или оптическая когерентная томография (OCT) для оценки структуры сетчатки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти показатели эффективности были хорошо описаны после генной терапии IVT 11,15,16.

7. Посмертный анализ тканей

1. Выполните эвтаназию овец одобренным методом в соответствующей конечной точке после интравитреальной инъекционной операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые методы эвтаназии, такие как внутривенное введение ветеринарных препаратов для эвтаназии или проникающий болт в шейный отдел позвоночника с последующим быстрым экссангинацией, подробно описаны в другом месте^15,16.
2. Собирайте шары с овечьими глазами с помощью хирургических острых / тупых изогнутых ножниц. Отрежьте боковой и медиальный кантус, чтобы увеличить отверстие глазницы, а затем систематически разрезайте конъюнктивальные складки, соединительную ткань, мышцы и зрительный нерв, чтобы освободить глазной шар от гнезда.
3. Погружение -фиксация неповрежденных, энуклеированных глазных глобусов в 10% формалине в течение 2 ч с последующей постфиксацией в растворе Буэна в течение 4 ч, делая небольшой (0,5 см) разрез в склере для обеспечения достаточной перфузии. Кроме того, можно зафиксировать глазные шары в растворе Дэвидсона в течение 48 ч.
4. Обрабатывайте участки тканей глаза с помощью обычного встраивания и разрезания парафинового воска на 3-5 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры окрашивания гематоксилина и эозина (H&E) и иммуногистохимического анализа были описаны ранее^15,16.
5. Оцените эффективность в посмертной ткани с помощью таких показателей, как общая толщина сетчатки, толщина слоя сетчатки, количество клеточных рядов наружного ядерного слоя и иммуногистохимическое окрашивание для типов клеток сетчатки, глии сетчатки или белков, представляющих интерес.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы для этих анализов см. в предыдущих публикациях^15,16.

Результаты

Эффективность доставки IVT вектора генной терапии CLN5 в ослаблении дисфункции и дегенерации сетчатки у овец с CLN5 NCL ранее была продемонстрирована этой исследовательской группой¹⁵. Пораженные овцы получали одну инъекцию 100 мкл IVT CLN5, упакованную в вектор AAV серотипа 9 (AAV9) (AAV9). CLN5...

Обсуждение

Интравитреальные инъекции являются одной из наиболее распространенных хирургических процедур в офтальмологии человека и доказали свою эффективность в доставке AAV-опосредованной генной терапии к сетчатке овец. Ранее мы продемонстрировали эффективность AAV9. Генная терапия CLN5 проводил...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	05-561-28	Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube	Sigma Aldrich	HS4323	Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor	Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops	Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand		Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	10236276001
Diazepam sedative	Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand		5 mg/mL
Endotracheal tubes	Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom		Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	KP151/14	Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	DI583	Or similar
Filter Tips	Interlab, Auckland, New Zealand		10, 200, and 1,000 µL
Formaldehyde solution (37%)	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	AJA809-2.5PL	Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen Carlsbad, CA, USA	A-11012	Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic	Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic	PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand		100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)	KaWe Medical, Denmark		Miller C blade, size 2
Needles	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	302025	BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory	Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand	49402/008	Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AB864/16	Or similar
Non-toothed hemostat	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AA150/12	Or similar
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	16210072
Oxygen (medical)	BOC Gas, Christchurch, New Zealand		D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	10010023	Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	005835	Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Dako, Glostrup, Denmark	Z0334	Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5	University of North Carolina Vector Core, NC, USA.	scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AHB1322	Commercial name: Saline solution
Subcutaneous antibiotics	Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand		Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	SH159/SH160	Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder	EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ	28461115