난소 눈의 유리체 내 주사

요약

유리체 내 주사는 망막에 바이러스 매개 유전자 요법을 전달하기 위해 양 눈에서 수행되었습니다.

초록

망막에 치료제를 전달하는 방법에는 유리체내(IVT), 망막하, 흉막상, 안구주위 또는 국소 투여를 비롯한 여러 방법이 있습니다. IVT 약물 전달은 눈의 후방을 채우고 눈 구체의 모양을 유지하는 젤라틴 물질인 눈의 유리체액에 주사하는 것을 포함합니다. IVT 경로는 망막 하 전달보다 덜 구체적으로 표적화되지만 훨씬 덜 침습적이며 다양한 안구 질환에 대한 임상 환경에서 널리 사용됩니다.

우리는 이전에 아데노 관련 바이러스(AAV) 매개 유전자 치료 제품(AAV9)의 유리체내 전달의 효능을 입증했습니다. CLN5) 자연적으로 발생하는 CLN5 형태의 신경 세로이드 리포푸신증(NCL)이 있는 양에서. 영향을받은 양은 한쪽 눈에서 IVT 유전자 치료를 받았고 다른 쪽 눈은 내부 대조군으로 사용되었습니다. 망막 구조와 기능은 치료 후 최대 15개월까지 치료된 눈에서 유지된 반면, 치료되지 않은 눈은 사후 검사 중에 점진적으로 기능 저하와 심각한 위축을 보였습니다. 양 연구에 따르면 CLN5 유전자 치료 제품은 2021년 9월 미국 식품의약국(FDA)으로부터 후보 임상시험용 신약(IND)으로 승인되었습니다. 이 논문은 치료 바이러스 벡터를 난소 눈에 IVT 전달하기위한 수술 프로토콜을 자세히 설명합니다.

서문

치료제를 망막에 전달하기 위해 유리체내(IVT), 망막하, 흉막상, 안구주위 또는 국소 투여를 포함하는 여러 방법이 사용될 수 있다. 각 투여 경로는 혈액 망막 장벽 또는 내부 및 외부 제한막과 같은 장벽을 극복하는 것을 포함하며 전달되는 약물 및 특정 망막 표적 ^1,2에 따라 효능 비율이 다릅니다.

IVT 약물 전달은 눈의 후방을 차지하는 젤라틴 물질 인 눈의 유리체 체액에 주사하는 것을 포함합니다. 유리체 유머의 주요 기능은 눈 구체의 모양을 유지하고 렌즈 및 망막과 같은 안구 조직을 제자리에 유지하는 것입니다. 유리체 체액은 주로 물로 구성되어 있으며 소량의 콜라겐, 히알루 론산 및 기타 비 콜라겐 성 단백질³. IVT 주사는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색 및 여러 유전성 망막 이영양증 ^4,5를 포함한 광범위한 안구 상태를 치료하기 위해 일상적으로 사용되는 간단하고 일반적인 절차입니다.

뉴런 세로이드 리포푸시노스(NCL; Batten disease)는 뇌와 망막의 심각한 퇴행을 유발하는 치명적인 리소좀 축적 질환의 그룹입니다. 현재 주로 어린이에게 영향을 미치지 만 발병 연령과 질병 중증도가 다양한 다양한 다른 유전자 (CLN1-8, CLN10-14)의 돌연변이로 인한 NCL의 13 가지 알려진 변종이 있습니다⁶. NCL은인지 및 운동 저하, 발작 및 시력 상실을 포함한 일반적인 진행성 증상을 공유합니다. NCL에 대한 치료법은 없습니다. 그러나 뇌 유도 효소 대체 요법은 현재 CLN2 질환 ^7,8에 대한 임상 시험 중이며 AAV 매개 유전자 요법은 전임상 연구에서 큰 가능성을 보여 CLN5 유전자 요법에 대한 임상 시험은 2022 년에 시작될 것으로 예상됩니다 ^9,10.

다른 많은 종들은 고양이, 개, 양 및 소를 포함하여 자연적으로 발생하는 형태의 NCL을 개발합니다. NCL의 두 가지 양 모델은 현재 뉴질랜드에서 활발히 연구 중입니다 : 보더 데일 양의 CLN5 질병 모델과 사우스 햄프셔 양의 CLN6 질병 모델. 영향을받은 양은 망막 위축 및 시력 상실^10,11을 포함하여 인간 질병의 많은 임상 적 및 병리학 적 특징을 나타냅니다. CLN5 질환이 있는 양에서 뇌 유도 CLN5 유전자 요법이 뇌 위축과 임상적 쇠퇴를 예방하거나 중단시킬 수 있지만, 치료받은 양은^{여전히 시력을} 잃습니다9. 이것은 시력을 보존하고 더 나은 삶의 질을 유지하기 위해 망막을 치료할 필요성을 강조하여 양의 안구 유전자 치료를위한 프로토콜을 수립하게되었습니다.

양눈은 눈 구체 치수, 유리체 부피 및 망막 구조^10,12,13의 유사성으로 인해 인간 눈의 좋은 모델을 나타냅니다. 이 논문은 소량의 (≤100 μL) 치료 바이러스 벡터를 난소 눈에 IVT 전달하기위한 수술 프로토콜을 자세히 설명합니다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 링컨 대학 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 미국 국립 보건원 지침 및 뉴질랜드 동물 복지법 (1999)과 일치합니다. 보더데일 양은 출생¹⁴ 세에 진단을 받았고 링컨 대학교 연구 농장에서 관리되었습니다. 3개월 된 동형접합체(CLN5-^/-) 암양 3마리가 왼쪽 눈에 IVT 단일 주사를 맞았고, 치료되지 않은 오른쪽 눈은 내부 대조군 역할을 했습니다. 전기 망막 조영술 및 병리학 데이터는 과거의 건강 및 영향을받은 대조군 데이터와 비교되었습니다. 이 연구에 사용된 바이러스 벡터는 치킨 베타 작용(CBh) 프로모터와 코돈 최적화된 양 CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt)를 포함하는 자가 상보적인 아데노 관련 바이러스 혈청형 9였습니다. 바이러스 벡터는 미국 노스캐롤라이나주 노스캐롤라이나 대학교 벡터 코어에 의해 제공되었다.

1. 수술 전

1. 수술 키트를 오토클레이브합니다(그림 1).
2. 수술 전에 양을 24 시간 동안 금식하십시오.
3. 수술 전에 생체중을 기록하십시오.

그림 1: 유리체내 수술 키트. IVT 수술에 필요한 도구에는 (1) 눈꺼풀을 열린 상태로 유지하는 검경과 (2) 구근 결막을 잡고 눈을 회전시키는 한 쌍의 구부러진 코 집게가 포함됩니다. (3) 구근 결막을 잡고 안와로 다시 굴러 들어간 경우 눈을 제자리에 고정하는 대체 도구로 직선 코 지혈 장치도 포함됩니다. 이 키트는 수술 전에 오토클레이브됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 수술 절차

1. 동물을 제지하고 전자 클리퍼를 사용하여 목의 한쪽에서 경정맥 위로 양모를 면도하십시오.
2. 경정맥 홈의 기저부에 압력을 가하여 경정맥을 폐색하고 융기된 정맥을 시각화합니다.
3. 적절한 양의 디아제팜(0.3mg/kg)과 케타민(7.5mg/kg)을 멸균 주사기에 넣고 멸균 20G 바늘을 부착합니다. 바늘을 경정맥에 삽입하고 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 혈액이 허브로 들어가고 바늘이 정맥 내부에 있는지 확인합니다. 일단 확인되면, 정맥 (jugular) 투여를 통해 유도한다.
4. 유도 직후 동물을 등쪽 누운 자세에 놓고 목을 펴고 후두경을 사용하여 후두를 시각화하여 혀를 위아래로 잡습니다. 동물이 숨을 내쉴 때 성대 사이에 기관 내 튜브 (양의 크기에 따라 크기 6.0-9.0)를 부드럽게 삽입하여 기관 내 삽관을 수행하십시오. 기관 내 커프를 즉시 팽창시키고 아래턱 주위에 넥타이로 튜브를 고정하십시오. 튜브를 통한 공기 흐름을 확인하십시오.
5. 양을 수술대로 옮기고 옆으로 누운 곳에 놓습니다.
6. 기관 내 튜브를 마취기의 호스에 즉시 연결하여 100 % 산소에서 이소 플루 란을 전달합니다. 처음에는 3%-4% 이소플루란으로 시작한 다음 유지 관리를 위해 2%-3%로 줄입니다. 양의 자발적인 환기를 관찰하십시오.
7. 시술 전반에 걸쳐 심박수, 호흡수, 산소 포화도, 호기말_CO2 수준 및 직장 체온을 모니터링합니다. 마취된 양에서 이러한 매개변수에 대한 생리학적 값은 표 1 을 참조하십시오(가변적이지만 지침으로 사용).
8. 수술용 카트에 크고 멸균된 사각형 드레이프를 놓고 멸균 기구를 그 뒤에 놓습니다.
9. 주사할 눈 위에 멸균된 수술용 드레이프를 놓습니다.
10. 멸균 된 20mL 주사기를 사용하여 눈을 무균 적으로 소독하여 1-5 % 포비돈-요오드 용액으로 눈을 관개하십시오.
11. 알카인 0.5% W/V 안액에 1-2방울을 국소 마취제로 눈에 바릅니다.
12. 노파 바라케르-콜리브리 눈 검경(10mm)을 눈꺼풀에 맞추어 눈을 뜨게 합니다.
13. 집게로 눈의 배외측 쪽에 있는 구근 결막을 잡고 눈 지구를 복측으로 회전시킵니다.

	의식	마 취	권장되는 중요 개입 지점
심박수(비트/분)	50-80(휴식)에서 280(활성)	50-80	<50, >100
호흡수(호흡수/분)	15-40 (휴식)에서 350 (과열)	10-30	<8, >40
산소 포화도 (밀리미터 Hg)	95-100	98-100	<90
호기말 CO2 (mmHg)	35-45	35-45	>55
체온 (°C)	38.5-39.5	38.5-39.5	<36, >40

표 1 : 마취 된 양에서 모니터링 할 매개 변수의 생리 학적 값.

3. 바이러스 제제

1. AAV 벡터 분취량은 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
2. 수술 당일, 얼음에서 IVT 전달에 필요한 수의 바이알을 해동하십시오.
3. 투여 직전에, 바이러스 벡터 분취량을 400 × g 에서 10초 동안 와동시켜 내용물을 수집하였다.
4. 멸균 여과된 1x 인산완충 식염수(PBS)에 각 바이러스 벡터 분취량을 최종 부피 100μL의 원하는 용량으로 희석합니다. 멸균 필터 피펫 팁을 사용하여 멸균된 1.5mL 저단백질 결합 마이크로원심분리 튜브에서 벡터 희석액을 준비합니다. 바이러스 벡터와 접촉 한 모든 소모품을 소독액에 폐기하십시오 ( 재료 표 참조).
   참고: 원래 간행물¹⁵ 에서 치료제(AAV9. CLN5)는 1.9 x 10¹⁰ 바이러스 게놈이었다. 권장 복용량은 투여되는 치료제에 따라 다릅니다. 따라서 여기에 제시된 표준 프로토콜에는 복용량이 포함되지 않았습니다.
5. AAV 벡터 제제의 전체 100μL를 즉시 주입할 수 있도록 바늘에 영구적으로 부착된 28G x 1/2가 있는 멸균된 저사수 공간 1mL 주사기에 넣습니다. 준비에서 주사까지의 시간이 2분 미만인지 확인하십시오.

4. 바이러스 투여

1. 바늘을 눈의 측면에있는 공막에 약 7mm 뒤쪽으로 삽입하고 렌즈를 피하기 위해 뒤쪽으로 기울입니다 (그림 2 및 그림 3). 100 μL의 단일 주사를 망막 표면을 교란하지 않고 가능한 한 망막에 가까운 볼루스로 투여한다.
2. 검경과 드레이프를 제거하기 전에 약 10-15mL의 1-5% 포비돈-요오드 용액과 10mL의 식염수로 눈을 헹굽니다.
3. 양을 뒤집고 필요한 경우 다른 눈으로 반복하십시오.

그림 2: 눈 지구본의 복측 회전. (A) 톱니가 없는 겸자로 구근 결막을 잡고 (B) 복부로(즉, 아래쪽으로) 회전하여 주사를 위해 눈의 등측 표면을 노출시킵니다. 약어 : V = 복부, D = 등쪽, M = 내측, L = 측면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 사출 위치 및 깊이. 바늘은 눈 지구본의 등측 측면에 주입되고 바늘 샤프트의 전체 길이(0.5인치/12.7mm)가 눈에 삽입됩니다. 렌즈를 피하고 가능한 한 망막에 가깝게 주입하기 위해 눈의 뒤쪽을 향한 바늘의 각도에 유의하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 수술 후 관리

1. 절차가 완료되면 이소 플루 란 가스 흡입 마취를 중단하고 100 % 산소로 라인을 세척하고 기관 내 튜브에서 호스를 분리 한 다음 양을 회복실로 옮깁니다.
2. 양을 흉골 누운 자세로 놓고 다리를 아래에 집어 넣고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 동물의 입에 장애물이 없는지 확인하십시오.
3. 삼키는 반사가 관찰되면 기관 내 튜브의 커프를 부분적으로 수축시키고 입에서 튜브를 부드럽게 제거하십시오.
4. 뒷다리의 이두근 대퇴근에 근육 내 비 스테로이드 성 항염증제를 투여하고 목 옆이나 어깨 뒤쪽의 피하 항생제를 투여하고 0.5 % 클로람페니콜 점안액을 눈 구체 표면에 투여합니다.
5. 양이 도움 없이 설 수 있게 되면 물과 음식(루체른 알갱이와 왕겨)을 제공하십시오.
6. 수술 후 7 일 동안 하루에 2-3 % 0.5 % 클로람페니콜 안약을 투여하십시오.
7. 수술 후 약 24 시간 후에 야외 목장으로 돌아 오기 전에 양을 밤새 실내에 두십시오.
8. 3 주 동안 매일 직장 온도를 기록하십시오. 맥박 또는 호흡수, 음식 섭취, 신경 행동, 체온, 체중, 자세, 눈 건강 및 건강 악화의 임상 징후의 변화를 모니터링합니다. 부작용의 징후가있는 경우 적절한 수의 치료를 받으십시오.

6. 생체 내 효능 평가

1. IVT 주사의 목표가 시력을 보존하는 것이라면 망막 세포 기능을 평가하기 위한 미로 검사 또는 전기 망막 조영술(ERG) 또는 망막 구조를 평가하기 위한 광학 간섭 단층 촬영(OCT)과 같은 방법으로 생체 내 효능을 모니터링합니다.
   참고: 이러한 효능 측정은 IVT 유전자 요법^11,15,16 이후에 잘 설명되었습니다.

7. 사후 조직 분석

1. 유리체 내 주사 수술 후 적절한 종말점에서 승인 된 방법으로 양 안락사를 수행하십시오.
   참고: 정맥 주사 수의학 안락사 약물 또는 경추에 관통하는 포로 볼트와 같은 제안된 안락사 방법은^15,16의 다른 곳에 자세히 설명되어 있습니다.
2. 외과 용 날카 롭고 뭉툭한 곡선 가위를 사용하여 양 눈 지구를 수확합니다. 측면 및 내측 칸투스를 절단하여 눈 소켓 개구부를 늘린 다음 결막 주름, 결합 조직, 근육 및 시신경을 체계적으로 절단하여 소켓에서 눈 지구를 제거합니다.
3. 2 시간 동안 10 % 포르말린에 온전한 상태로 핵을 제거한 눈 구체를 침지 고정시킨 다음 4 시간 동안 Bouin의 용액에 후고정하여 충분한 관류를 허용하기 위해 공막에서 작은 (0.5cm) 절단을합니다. 또는 데이비슨의 용액에 아이 글로브를 48시간 동안 침지하여 고정할 수 있습니다.
4. 일상적인 파라핀 왁스 매립 및 3-5 μm의 절편을 통해 눈 조직의 절편을 처리합니다.
   참고: 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 및 면역조직화학 분석을 위한 염색 절차는 이전에^15,16에 기술되었다.
5. 망막 세포 유형, 망막 아교 세포 또는 관심 단백질에 대한 총 망막 두께, 망막 층 두께, 외부 핵층 세포 열 수 및 면역 조직 화학적 염색과 같은 측정을 통해 사후 조직의 효능을 평가합니다.
   참고: 이러한 분석에 대한 프로토콜은 이전 간행물^15,16을 참조하십시오.

결과

CLN5 NCL을 가진 양에서 망막 기능 장애 및 퇴행을 약화시키는 CLN5 유전자 요법 벡터의 IVT 전달의 효능은 이전에 이 연구 그룹¹⁵에 의해 입증되었습니다. 영향을 받은 양은 AAV 혈청형 9(AAV9) 벡터(AAV9)에 패키징된 CLN5의 단일 100μL IVT 주사를 받았습니다. CLN5)를 한쪽 눈으로, 반대쪽 눈은 치료되지 않은 내부 대조군 역할을합니다. 시력은 주사 시점의 연령 (3 개월)부터 말기 질환 (18 개?...

토론

유리체 내 주사는 인간 안과에서 가장 일반적인 수술 절차 중 하나이며 양의 망막에 AAV 매개 유전자 요법을 전달하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 우리는 이전에 AAV9의 효능을 입증했습니다. CLN5 유전자 요법은 CLN5 NCL¹⁵로 양에서 망막 기능 장애 및 퇴행을 약화시키는 유리체 내 전달을 받았습니다. 인간 NCL 환자에게이 투여 경로의 번역이 또한 유익한 것으로 입증 될 것?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	05-561-28	Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube	Sigma Aldrich	HS4323	Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor	Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops	Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand		Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	10236276001
Diazepam sedative	Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand		5 mg/mL
Endotracheal tubes	Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom		Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	KP151/14	Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	DI583	Or similar
Filter Tips	Interlab, Auckland, New Zealand		10, 200, and 1,000 µL
Formaldehyde solution (37%)	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	AJA809-2.5PL	Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen Carlsbad, CA, USA	A-11012	Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic	Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic	PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand		100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)	KaWe Medical, Denmark		Miller C blade, size 2
Needles	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	302025	BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory	Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand	49402/008	Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AB864/16	Or similar
Non-toothed hemostat	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AA150/12	Or similar
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	16210072
Oxygen (medical)	BOC Gas, Christchurch, New Zealand		D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	10010023	Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	005835	Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Dako, Glostrup, Denmark	Z0334	Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5	University of North Carolina Vector Core, NC, USA.	scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AHB1322	Commercial name: Saline solution
Subcutaneous antibiotics	Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand		Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	SH159/SH160	Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder	EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ	28461115