זריקות תוך ויטרליות בעין הבקר

Summary

זריקות תוך-גופיות בוצעו בעין הכבשה במטרה להעביר טיפול גנטי בתיווך ויראלי לרשתית.

Abstract

ישנן מספר שיטות להעברת סוכנים טיפוליים לרשתית, כולל intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, או ניהול מקומי. אספקת תרופות IVT כוללת זריקה לתוך ההומור הזגוגי של העין, חומר ג'לטיני הממלא את החדר האחורי של העין ושומר על צורת כדור הארץ. למרות שמסלול ה- IVT פחות ממוקד באופן ספציפי מאשר לידה תת-קרקעית, הוא הרבה פחות פולשני ונמצא בשימוש נרחב במסגרות קליניות למגוון מחלות עיניים.

בעבר הדגמנו את היעילות של העברה תוך-גופית של מוצר טיפול גנטי בתיווך נגיף אדנו (AAV) (AAV9). CLN5) בכבשים עם צורה טבעית של CLN5 של ליפופוסינוזיס עצבי (NCL). כבשים מושפעות קיבלו טיפול גנטי IVT בעין אחת, כאשר העין השנייה לא מטופלת משמשת כבקרה פנימית. מבנה ותפקוד הרשתית נשמרו בעין המטופלת עד 15 חודשים לאחר הטיפול, בעוד שהעין הלא מטופלת הפגינה ירידה הדרגתית בתפקוד וניוון חמור במהלך הבדיקה שלאחר המוות. בהתבסס על מחקרי הכבשים, מוצר הטיפול הגנטי CLN5 אושר כתרופה חדשה ניסיונית מועמדת (IND) על ידי מנהל המזון והתרופות של ארצות הברית בספטמבר 2021. מאמר זה מפרט את הפרוטוקול הכירורגי להעברת IVT של וקטור ויראלי טיפולי לעין הביצית.

Introduction

ניתן להשתמש במספר שיטות כדי להעביר חומרים טיפוליים לרשתית, כולל intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, או ניהול מקומי. כל מסלול של מתן כרוך בהתגברות על מחסומים כגון מחסום הדם-רשתית או הממברנות המגבילות הפנימיות והחיצוניות ויש לו שיעורי יעילות משתנים בהתאם לתרופה המועברת וליעד הרשתית^{הספציפי 1,2.}

אספקת תרופות IVT כוללת זריקה לתוך ההומור הזגוגי של העין, חומר ג'לטיני התופס את החדר האחורי של העין. תפקידו העיקרי של ההומור הזגוגי הוא לשמור על צורת כדור הארץ של העין ולשמור על רקמות העין, כגון העדשה והרשתית, במקום. ההומור הזגוגי מורכב ברובו ממים, עם כמויות קטנות של קולגן, חומצה היאלורונית וחלבונים אחרים שאינם קולוגניים³. הזרקת IVT היא הליך פשוט ונפוץ המשמש באופן שגרתי לטיפול במגוון רחב של מחלות עיניים, כולל ניוון מקולרי תלוי גיל, בצקת מקולרית סוכרתית, רטינופתיה סוכרתית, חסימת ורידים ברשתית ומספר ניוון רשתית^{תורשתי 4,5.}

ליפופוסצינוזות עצביות (NCL; מחלת באטן) הן קבוצה של מחלות אחסון ליזוזומליות קטלניות הגורמות לניוון חמור של המוח והרשתית. כיום ידועות 13 גרסאות של NCL הנובעות ממוטציות בגנים שונים (CLN1-8, CLN10-14) המשפיעות בעיקר על ילדים, אך יש להן גילאים משתנים של התפרצות וחומרת המחלה⁶. ה-NCLs חולקים תסמינים פרוגרסיביים נפוצים, כולל ירידה קוגניטיבית ומוטורית, התקפים ואובדן ראייה. אין תרופה ל-NCL; עם זאת, טיפול בתחליפי אנזימים מוכווני מוח נמצא כיום בניסויים קליניים למחלת CLN2^7,8, וטיפול גנטי בתיווך AAV הראה הבטחה רבה במחקרים פרה-קליניים, כאשר ניסוי קליני לטיפול גנטי CLN5 צפוי להתחיל בשנת 2022 ^9,10.

מינים רבים אחרים מפתחים צורות טבעיות של NCL, כולל חתולים, כלבים, כבשים ופרות. שני מודלים של ביצות NCL נמצאים כעת במחקר פעיל בניו זילנד: מודל מחלת CLN5 בכבשי בורדרדייל ומודל מחלת CLN6 בכבשים בדרום המפשייר. כבשים מושפעות מציגות רבים מהמאפיינים הקליניים והפתולוגיים של המחלה האנושית, כולל ניוון רשתית ואובדן ראייה^10,11. למרות שטיפול גנטי CLN5 מכוון מוח בכבשים עם מחלת CLN5 יכול למנוע או לעצור ניוון מוחי וירידה קלינית, הכבשים המטופלות עדיין מאבדות את ראייתן⁹. זה הדגיש את הצורך לטפל ברשתית כדי לשמר את הראייה ולשמור על איכות חיים טובה יותר, מה שהוביל להקמת פרוטוקול לטיפול גנטי בעיניים בכבשים.

עין הכבשה מייצגת מודל טוב של העין האנושית בשל הדמיון שלה בממדי הגלובוס של העין, נפח הזגוגית ומבנה הרשתית^10,12,13. מאמר זה מפרט את הפרוטוקול הניתוחי להעברת IVT בנפח קטן (≤100 μL) של וקטור ויראלי טיפולי לעין הביצית.

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת לינקולן והם עולים בקנה אחד עם הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב לטיפול ושימוש בבעלי חיים במחקר ולחוק רווחת בעלי החיים של ניו זילנד (1999). כבשי בורדרדייל אובחנו בלידה¹⁴ והוחזקו בחוות מחקר של אוניברסיטת לינקולן. שלושה אווזים הומוזיגוטיים בני 3 חודשים (CLN5-^/-) קיבלו זריקת IVT אחת לעין שמאל, כאשר עין ימין שלא טופלה משמשת כבקרה פנימית. נתוני אלקטרורטינוגרפיה ופתולוגיה הושוו לנתוני בקרה היסטוריים בריאים ומושפעים. הווקטור הנגיפי ששימש במחקר זה היה סרוטיפ נגיף 9 המשלים את עצמו הקשור לאדנו, המכיל את מקדם פעולת הבטא של עוף (CBh) ואת הביצית CLN5 המותאמת לקודון (scAAV9/CBh-oCLN5opt). הווקטור הנגיפי סופק על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה וקטור Core, צפון קרוליינה, ארה"ב.

1. טרום ניתוח

1. אוטוקלאב את ערכת הניתוח (איור 1).
2. הזימו את הכבשים במשך 24 שעות לפני הניתוח.
3. רשום משקולות חיות לפני הניתוח.

איור 1: ערכת ניתוח תוך-ורידית. המכשירים הדרושים לניתוח IVT כוללים (1) ספקולום להחזקת העפעפיים פתוחים ו-(2) זוג מלקחיים מעוקלים לאף כדי לתפוס את הלחמית הבולבארית ולסובב את העין. (3) המוסטאט אף ישר נכלל גם כמכשיר חלופי לאחיזת הלחמית הבולבארית ולהחזקת העין במקומה אם היא התגלגלה חזרה למסלול העין. ערכה זו עוברת בדיקה אוטומטית לפני הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. הליך כירורגי

1. לרסן את החיה, באמצעות קוצץ אלקטרוני, לגלח את הצמר מצד אחד של הצוואר מעל הווריד jugular.
2. Occlude את הווריד jugular על ידי הפעלת לחץ בבסיס חריץ jugular ולדמיין את הווריד מורם.
3. יש לשאוב את הכמות המתאימה של דיאזפם (0.3 מ"ג/ק"ג) וקטמין (7.5 מ"ג/ק"ג) לתוך מזרק סטרילי ולחבר מחט סטרילית של 20 גרם. הכנס את המחט לווריד הג'וגולרי ומשוך בעדינות בחזרה על הבוכנה כדי לוודא שהדם נכנס לרכזת והמחט נמצאת בתוך הווריד. לאחר האישור, לגרום באמצעות מתן תוך ורידי (jugular).
4. מיד לאחר אינדוקציה, מניחים את החיה בשכיבה הגבית, מרחיבים את הצוואר ומחזיקים את הלשון למעלה וקדימה, באמצעות לרינגוסקופ כדי לדמיין את הגרון. בצע אינטובציה אנדוטרכאלית על ידי החדרה עדינה של צינור אנדוטרכאלי (גודל 6.0-9.0 בהתאם לגודל הכבשה) בין מיתרי הקול כאשר החיה נושפת. לנפח את השרוול האנדוטרכאלי מיד ולאבטח את הצינור עם עניבה סביב הלסת התחתונה. אשר את זרימת האוויר דרך הצינור.
5. מעבירים את הכבשה לשולחן הניתוחים ומניחים אותה בשכיבה צידית.
6. מיד לחבר את צינור endotracheal צינורות של מכונת הרדמה למסירת isoflurane ב 100% חמצן. בתחילה מתחילים עם 3%-4% איזופלוראן ולאחר מכן מפחיתים ל-2%-3% לצורך תחזוקה. שימו לב לאוורור הספונטני של הכבשים.
7. עקוב אחר קצב הלב (דופק), קצב הנשימה, ריווי החמצן, רמות CO₂ בסוף הגאות וטמפרטורת הגוף הרקטלית לאורך כל ההליך. ראו טבלה 1 לערכים פיזיולוגיים לפרמטרים אלה בכבשים מורדמות (משתנה, אך משמש כהנחיה).
8. מניחים וילון גדול, סטרילי ומרובע על עגלת ניתוח כירורגית, ואחריו המכשירים הסטריליים.
9. מקמו וילון כירורגי סטרילי ופנסטרי מעל העין להזרקה.
10. לחטא את העין באופן אספטי באמצעות מזרק סטרילי של 20 מ"ל להשקיית העין עם תמיסת 1-5% פובידון-יוד.
11. יש למרוח 1-2 טיפות אלקאין 0.5% W/V תמיסת עיניים, כהרדמה מקומית, על העין.
12. יש להתאים ספקולום עיניים נופה באראקר-קוליברי (10 מ"מ) לעפעפיים כדי להחזיק את העין פתוחה.
13. לתפוס את הלחמית bulbar על ההיבט הגבי של העין עם מלקחיים, ולסובב את כדור העין ventromedial.

	בהכרה	מורדם	נקודת התערבות קריטית מומלצת
דופק (פעימות לדקה)	50-80 (מנוחה) עד 280 (פעיל)	50-80	<50, >100
קצב נשימה (נשימות לדקה)	15-40 (מנוחה) עד 350 (מחומם יתר על המידה)	10-30	<8, >40
רוויון חמצן (מ"מ כספית)	95-100	98-100	<90
CO2 סופני-גאות (מ"מ כספית)	35-45	35-45	>55
טמפרטורת הגוף (°C)	38.5-39.5	38.5-39.5	<36, >40

טבלה 1: ערכים פיזיולוגיים של פרמטרים שיש לעקוב אחריהם בכבשים מורדמות.

3. הכנה ויראלית

1. יש לאחסן את ה-AAV בטמפרטורה של 80°C- עד לשימוש.
2. ביום הניתוח, הפשירו את המספר הנדרש של בקבוקונים להעברת IVT על קרח.
3. מיד לפני הניהול, מערבבים את הווקטור הנגיפי aliquot וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 שניות כדי לאסוף את התוכן.
4. יש לדלל כל אליקוט וקטורי נגיפי בתמיסת מלח מסוננת סטרילית 1x עם פוספט (PBS) למינון הרצוי בנפח סופי של 100 μL. הכן דילולים וקטוריים בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בקושר חלבון נמוך של 1.5 מ"ל באמצעות קצוות פיפטה של מסנן סטרילי. יש להשליך את כל החומרים המתכלים שהיו במגע עם הווקטור הנגיפי בתמיסת החיטוי (ראו טבלת חומרים).
   הערה: בפרסום המקורי¹⁵ המינון של החומר הטיפולי (AAV9. CLN5) היה 1.9 x 10¹⁰ גנומים נגיפיים. המינון המומלץ ישתנה בהתאם לסוכן הטיפולי הניתן; לכן, מינון לא נכלל בפרוטוקול הסטנדרטי המוצג כאן.
5. שאבו את מלוא 100 μL של הכנת וקטור AAV לתוך מזרק סטרילי, שטח מת נמוך 1 מ"ל עם מחט המחוברת באופן קבוע 28 G x 1/2 להזרקה מיידית. ודא שמשך הזמן מההכנה להזרקה הוא פחות מ-2 דקות.

4. ניהול ויראלי

1. יש להחדיר את המחט כ-7 מ"מ אחורית לסקלרה בצד הצדדי של העין ובזווית אחורית כדי להימנע מהעדשה (איור 2 ואיור 3). לתת את הזריקה היחידה של 100 μL כמו בולוס קרוב ככל האפשר לרשתית מבלי להפריע למשטח הרשתית.
2. יש לשטוף את העין בכ-10-15 מ"ל של תמיסת 1-5% פובידון-יוד ואחריה 10 מ"ל מלח לפני הסרת הספקולום והווילונות.
3. הופכים את הכבשים וחוזרים עם העין השנייה במידת הצורך.

איור 2: סיבוב ונטרומדיאלי של כדור הארץ של העין. (A) תפסו את הלחמית הבולבארית עם מלקחיים שאינם מטורפים ו-(B) סובבו את החוטם בצורה וונטרומדית (כלומר, כלפי מטה ולכיוון החוטם) כדי לחשוף את פני השטח הגביים של העין לצורך הזרקה. קיצורים: V = גחון, D = גב, M = מדיאלי, L = לרוחב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: מיקום ההזרקה ועומקה. המחט מוזרקת על ההיבט הגבי של כדור העין, ואת מלוא אורכו של פיר המחט (0.5 אינץ '/ 12.7 מ"מ) מוכנס לתוך העין. שימו לב לזווית המחט לכיוון החלק האחורי של העין כדי להימנע מהעדשה ולהזריק קרוב ככל האפשר לרשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. ניהול לאחר הניתוח

1. עם השלמת ההליך, להפסיק הרדמה גז isoflurane, לשטוף את הקו עם 100% חמצן, לנתק את הצינור מן הצינור endotracheal, ולהעביר את הכבשים לחדר ההתאוששות.
2. מניחים את הכבשים במשענת עצם החזה, עם רגליים תחובות מתחת, ומוניטור עד להחלמה מלאה. ודא שהפה של החיה נקי מכל מכשול.
3. כאשר רפלקס הבליעה הוא ציין, חלקית לנפח את השרוול של צינור endotracheal בעדינות להסיר את הצינור מן הפה.
4. מתן נוגד דלקת לא סטרואידי תוך שרירי לתוך שריר הירך האחורי של הגפיים האחוריות, אנטיביוטיקה תת עורית בצד הצוואר או מאחורי הכתף, ו 0.5% כלורמפניקול טיפות עיניים על פני כדור הארץ העין.
5. ספק מים ומזון (כדורי לוצרן ומוץ) ברגע שהכבשים יכולות לעמוד ללא הפרעה.
6. לתת 0.5% כלורמפניקול טיפות עיניים 2-3 ליום במשך 7 ימים לאחר הניתוח.
7. השאירו את הכבשים בתוך הבית למשך הלילה לפני שהן חוזרות למשטח החיצוני כ-24 שעות לאחר הניתוח.
8. שיא טמפרטורות רקטליות מדי יום במשך 3 שבועות. עקוב אחר כל שינוי בדופק או בקצב הנשימה, צריכת מזון, התנהגות עצבית, טמפרטורת גוף, משקל, יציבה, בריאות העיניים וסימנים קליניים של בריאות לקויה. יש לפנות לטיפול וטרינרי מתאים אם יש אינדיקציות לתופעות לוואי.

6. הערכת יעילות in vivo

1. אם מטרת הזרקת IVT היא לשמר את הראייה, עקוב אחר יעילות in vivo בשיטות כגון בדיקת מבוך או אלקטרורטינוגרפיה (ERG) כדי להעריך את תפקוד תאי הרשתית או טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) להערכת מבנה הרשתית.
   הערה: אמצעי יעילות אלה תוארו היטב לאחר טיפול גנטי IVT^11,15,16.

7. ניתוח רקמות לאחר המוות

1. לבצע המתת חסד של כבשים בשיטה מאושרת בנקודת קצה מתאימה לאחר ניתוח הזרקה תוך ויטרלית.
   הערה: שיטות המתת חסד מוצעות, כגון תרופות המתת חסד וטרינריות תוך ורידיות או בורג שבוי חודר לעמוד השדרה הצווארי ואחריו exsanguination מהיר, מפורטים במקום אחר^15,16.
2. קציר גלובוסים לעין כבשים באמצעות מספריים מעוקלים חדים/קהים כירורגיים. חותכים את הקנטוס הלטרלי והמדיאלי כדי להגדיל את פתח ארובת העין ולאחר מכן חותכים באופן שיטתי דרך קפלי הלחמית, רקמת החיבור, השרירים ועצב הראייה כדי לשחרר את כדור העין מהשקע.
3. תיקון טבילה שלם, כדורי עיניים מנוקבים ב-10% פורמלין למשך שעתיים, ולאחר מכן פוסט-פיקסינג בתמיסה של Bouin למשך 4 שעות, מה שהופך חתך קטן (0.5 ס"מ) בסקלרה כדי לאפשר זלוף מספיק. לחלופין, טבילה-תיקון גלובוס העין בפתרון של דוידסון למשך 48 שעות.
4. מעבדים מקטעים של רקמת העין באמצעות הטבעה שגרתית של שעוות פרפין וחיתוך ב-3-5 מיקרומטר.
   הערה: הליכי צביעה עבור צביעה המטוקסילין ו eosin (H&E) וניתוח אימונוהיסטוכימי תוארו בעבר^15,16.
5. הערך את היעילות ברקמות שלאחר המוות על ידי מדדים כגון עובי רשתית כולל, עובי שכבת הרשתית, ספירות של שורות תאי בשכבה גרעינית חיצונית, וכתמים אימונוהיסטוכימיים עבור סוגי תאי רשתית, גליה רשתית או חלבונים מעניינים.
   הערה: לפרוטוקולים עבור ניתוחים אלה, ראה פרסומים קודמים^15,16.

תוצאות

היעילות של העברת IVT של וקטור טיפול גנטי CLN5 בהחלשת תפקוד לקוי של הרשתית וניוון בכבשים עם CLN5 NCL הוכחה בעבר על ידי קבוצת מחקר זו¹⁵. הכבשים המושפעות קיבלו זריקה אחת של 100 μL IVT של CLN5 ארוזה בסרוטיפ AAV 9 (AAV9) וקטור (AAV9). CLN5) לעין אחת, כאשר העין הנגדית משמשת כבקרה פנימית לא מטופלת. הראייה הוערכ...

Discussion

זריקות תוך-ורידיות הן אחד ההליכים הכירורגיים הנפוצים ביותר ברפואת עיניים אנושית והוכחו כיעילות במתן טיפולים גנטיים בתיווך AAV לרשתית הכבשים. הוכחנו בעבר את היעילות של AAV9. טיפול גנטי CLN5 הניתן באופן תוך-ורידי בהחלשת תפקוד לקוי של הרשתית וניוון בכבשים עם CLN5 NCL¹⁵. יש לקוות כי התרגום...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	05-561-28	Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube	Sigma Aldrich	HS4323	Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor	Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops	Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand		Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	10236276001
Diazepam sedative	Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand		5 mg/mL
Endotracheal tubes	Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom		Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	KP151/14	Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	DI583	Or similar
Filter Tips	Interlab, Auckland, New Zealand		10, 200, and 1,000 µL
Formaldehyde solution (37%)	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	AJA809-2.5PL	Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen Carlsbad, CA, USA	A-11012	Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic	Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic	PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand		100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)	KaWe Medical, Denmark		Miller C blade, size 2
Needles	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	302025	BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory	Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand	49402/008	Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AB864/16	Or similar
Non-toothed hemostat	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AA150/12	Or similar
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	16210072
Oxygen (medical)	BOC Gas, Christchurch, New Zealand		D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	10010023	Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	005835	Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Dako, Glostrup, Denmark	Z0334	Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5	University of North Carolina Vector Core, NC, USA.	scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AHB1322	Commercial name: Saline solution
Subcutaneous antibiotics	Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand		Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	SH159/SH160	Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder	EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ	28461115