Injeções intravítreas no olho ovino

Resumo

Injeções intravítreas foram realizadas no olho de ovelha com o objetivo de fornecer terapia gênica mediada por vírus para a retina.

Resumo

Existem vários métodos para a entrega de agentes terapêuticos à retina, incluindo administração intravítrea (IVT), sub-retiniana, supracoroidal, periocular ou tópica. A administração da droga IVT envolve uma injeção no humor vítreo do olho, uma substância gelatinosa que preenche a câmara posterior do olho e mantém a forma do globo ocular. Embora a via IVT seja menos especificamente direcionada do que o parto sub-retiniano, é muito menos invasiva e é amplamente utilizada em ambientes clínicos para uma série de doenças oculares.

Demonstramos anteriormente a eficácia da entrega intravítrea de um produto de terapia gênica mediado por vírus adenoassociado (AAV) (AAV9. CLN5) em ovinos com uma forma natural de CLN5 de lipofuscinose ceróide neuronal (NCL). As ovelhas afetadas receberam terapia genética IVT em um olho, com o outro olho não tratado servindo como um controle interno. A estrutura e a função da retina foram mantidas no olho tratado até 15 meses após o tratamento, enquanto o olho não tratado apresentou função progressivamente declinante e atrofia grave durante o exame post-mortem. Com base nos estudos com ovelhas, o produto de terapia genética CLN5 foi liberado como um candidato a novo medicamento experimental (IND) pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos em setembro de 2021. Este trabalho detalha o protocolo cirúrgico para a entrega de TVI de um vetor viral terapêutico ao olho ovino.

Introdução

Vários métodos podem ser usados para fornecer agentes terapêuticos à retina, incluindo administração intravítrea (IVT), sub-retiniana, supracoroidal, periocular ou tópica. Cada via de administração envolve a superação de barreiras como a barreira sangue-retina ou as membranas limitantes internas e externas e tem taxas variadas de eficácia dependendo do fármaco a ser administrado e do alvo específico da retina ^1,2.

A administração da droga IVT envolve uma injeção no humor vítreo do olho, uma substância gelatinosa que ocupa a câmara posterior do olho. A principal função do humor vítreo é manter a forma do globo ocular e manter os tecidos oculares, como a lente e a retina, no lugar. O humor vítreo é composto em grande parte de água, com pequenas quantidades de colágeno, ácido hialurônico e outras proteínas não colágenas³. A injeção de TVI é um procedimento simples e comum usado rotineiramente para tratar uma ampla gama de condições oculares, incluindo degeneração macular relacionada à idade, edema macular diabético, retinopatia diabética, oclusão da veia retiniana e várias distrofias hereditárias da retina ^4,5.

Lipofuscinoses ceroides neuronais (NCL; Doença de Batten) é um grupo de doenças fatais de armazenamento lisossômico que causam degeneração grave do cérebro e da retina. Atualmente, existem 13 variantes conhecidas de NCL resultantes de mutações em diferentes genes (CLN1-8, CLN10-14) que afetam predominantemente crianças, mas têm idades variadas de início e gravidade da doença⁶. As NCLs compartilham sintomas progressivos comuns, incluindo declínio cognitivo e motor, convulsões e perda de visão. Não há cura para a NCL; no entanto, a terapia de reposição enzimática dirigida pelo cérebro está atualmente em ensaios clínicos para a doença CLN2^7,8, e a terapia gênica mediada por AAV tem se mostrado grande promessa em estudos pré-clínicos, com um ensaio clínico para a terapia gênica CLN5 esperado para começar em 2022 ^9,10.

Muitas outras espécies desenvolvem formas naturais de NCL, incluindo gatos, cães, ovelhas e vacas. Dois modelos ovinos de NCL estão atualmente em estudo ativo na Nova Zelândia: um modelo de doença CLN5 em ovinos de Borderdale e um modelo de doença CLN6 em ovinos de South Hampshire. Os ovinos afetados apresentam muitas das características clínicas e patológicas da doença humana, incluindo atrofia retiniana e perda de visão^10,11. Embora a terapia gênica CLN5 dirigida pelo cérebro em ovinos com doença CLN5 possa prevenir ou deter a atrofia cerebral e o declínio clínico, as ovelhas tratadas ainda perdem a visão⁹. Isso evidenciou a necessidade de tratar a retina para preservar a visão e manter uma melhor qualidade de vida, levando ao estabelecimento de um protocolo de terapia gênica ocular em ovinos.

O olho de ovelha representa um bom modelo do olho humano devido à sua semelhança nas dimensões do globo ocular, volume vítreo e estrutura da retina^10,12,13. Este trabalho detalha o protocolo cirúrgico para a administração de TVI de um pequeno volume (≤100 μL) de vetor viral terapêutico ao olho ovino.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de Ética Animal da Universidade Lincoln e estão de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA para o cuidado e uso de animais em pesquisa e com a Lei de Bem-Estar Animal da Nova Zelândia (1999). As ovelhas Borderdale foram diagnosticadas ao nascer¹⁴ e mantidas em fazendas de pesquisa da Universidade Lincoln. Três ovelhas homozigotas (CLN5^{-/-) de} 3 meses de idade receberam uma única injeção de TVI no olho esquerdo, com o olho direito não tratado atuando como um controle interno. Os dados de eletrorretinografia e patologia foram comparados com os dados históricos de controle saudável e afetado. O vetor viral utilizado neste estudo foi um sorotipo 9 de vírus adenoassociado autocomplementar, contendo o promotor de ação beta de frango (CBh) e o ovino CLN5 otimizado para códons (scAAV9/CBh-oCLN5opt). O vetor viral foi fornecido pelo University of North Carolina Vector Core, NC, EUA.

1. Pré-cirurgia

1. Autoclave o kit cirúrgico (Figura 1).
2. Jejue as ovelhas por 24 h antes da cirurgia.
3. Registre pesos vivos antes da cirurgia.

Figura 1: Kit de cirurgia intravítrea. Os instrumentos necessários para a cirurgia de TVI incluem (1) um espéculo para manter as pálpebras abertas e (2) um par de pinças de nariz curvo para agarrar a conjuntiva bulbar e girar o olho. (3) Um hemostato de nariz reto também é incluído como um instrumento alternativo para segurar a conjuntiva bulbar e manter o olho no lugar se ele tiver revertido para a órbita do olho. Este kit é autoclavado antes da cirurgia. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Procedimento cirúrgico

1. Restrinja o animal e, usando cortadores eletrônicos, raspe a lã de um lado do pescoço sobre a veia jugular.
2. Ocluir a veia jugular aplicando pressão na base do sulco jugular e visualizar a veia levantada.
3. Recolher a quantidade adequada de diazepam (0,3 mg/kg) e cetamina (7,5 mg/kg) numa seringa estéril e colocar uma agulha estéril de 20 G. Insira a agulha na veia jugular e retire suavemente o êmbolo para garantir que o sangue entre no cubo e a agulha esteja dentro da veia. Uma vez confirmado, induzir através de administração intravenosa (jugular).
4. Imediatamente após a indução, coloque o animal em decúbito dorsal, estenda o pescoço e segure a língua para cima e para frente, usando um laringoscópio para visualizar a laringe. Realizar a intubação endotraqueal inserindo suavemente um tubo endotraqueal (tamanho 6,0-9,0, dependendo do tamanho da ovelha) entre as cordas vocais quando o animal expirar. Inflar o manguito endotraqueal imediatamente e prender o tubo com uma gravata ao redor da mandíbula inferior. Confirme o fluxo de ar através do tubo.
5. Transfira o ovino para a mesa cirúrgica e coloque-o em decúbito lateral.
6. Conecte imediatamente o tubo endotraqueal às mangueiras da máquina anestésica para a entrega de isoflurano em oxigênio a 100%. Inicialmente comece com 3%-4% de isoflurano e, em seguida, reduza para 2%-3% para manutenção. Observe a ventilação espontânea dos ovinos.
7. Monitore a frequência cardíaca (pulso), a frequência respiratória, a saturação de oxigênio, os níveis de CO₂ no final da maré e a temperatura corporal retal durante todo o procedimento. Veja a Tabela 1 para valores fisiológicos para esses parâmetros em ovinos anestesiados (variável, mas uso como orientação).
8. Coloque uma cortina grande, estéril e quadrada em um carrinho cirúrgico, seguido pelos instrumentos estéreis.
9. Posicione uma cortina cirúrgica estéril e fenestrada sobre o olho a ser injetado.
10. Desinfete assepticamente o olho usando uma seringa estéril de 20 mL para irrigar o olho com solução de iodopovidona a 1-5%.
11. Aplicar 1-2 gotas de Alcaine 0,5% W/V solução oftálmica, como um anestésico local, para o olho.
12. Encaixe um espéculo ocular Nopa Barraquer-Colibri (10 mm) nas pálpebras para manter o olho aberto.
13. Segure a conjuntiva bulbar na face dorsolateral do olho com fórceps e gire o globo ocular ventromedialmente.

	Consciente	Anestesiado	Ponto crítico de intervenção recomendado
Frequência cardíaca (batimentos/min)	50-80 (repouso) a 280 (ativo)	50-80	<50, >100
Frequência respiratória (respirações/min)	15-40 (descanso) a 350 (superaquecido)	10-30	<8, >40
Saturação de oxigênio (mm Hg)	95-100	98-100	<90
CO2 da maré final (mm Hg)	35-45	35-45	>55
Temperatura corporal (°C)	38.5-39.5	38.5-39.5	36 < de >40

Tabela 1: Valores fisiológicos dos parâmetros a serem monitorados em ovinos anestesiados.

3. Preparação viral

1. Armazenar alíquotas vetoriais AAV a -80 °C até o uso.
2. No dia da cirurgia, descongele o número necessário de frascos para entrega de IVT no gelo.
3. Imediatamente antes da administração, o vórtice da alíquota do vetor viral e centrifugar a 400 × g por 10 s para coletar o conteúdo.
4. Diluir cada alíquota do vetor viral em solução salina tamponada com fosfato (PBS) filtrada estéril 1x para a dose desejada em um volume final de 100 μL. Prepare diluições vetoriais em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL de baixa ligação a proteínas usando pontas de pipeta de filtro estéreis. Eliminar todos os consumíveis que tenham estado em contacto com o vector viral em solução desinfetante (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Na publicação original¹⁵ a dose do agente terapêutico (AAV9. CLN5) foi de 1,9 x 10¹⁰ genomas virais. A dosagem recomendada irá variar dependendo do agente terapêutico que está sendo administrado; portanto, uma dosagem não foi incluída no protocolo padrão aqui apresentado.
5. Retirar todos os 100 μL da preparação do vetor AAV para uma seringa estéril de 1 ml com um 28 G x 1/2 permanentemente ligado em agulha para injeção imediata. Certifique-se de que o período de tempo entre a preparação e a injeção é inferior a 2 minutos.

4. Administração viral

1. Inserir a agulha aproximadamente 7 mm posterior à esclera na face lateral do olho e inclinada posteriormente para evitar o cristalino (Figura 2 e Figura 3). Administrar a injeção única de 100 μL em bolus o mais próximo possível da retina sem perturbar a superfície da retina.
2. Enxaguar o olho com aproximadamente 10-15 mL de solução de iodopovidona a 1-5%, seguido de 10 mL de solução salina antes da remoção do espéculo e da cortina.
3. Vire as ovelhas e repita com o outro olho, se necessário.

Figura 2: Rotação ventromedial do globo ocular . (A) Segure a conjuntiva bulbar com pinça não dentada e (B) gire ventromedialmente (ou seja, para baixo e em direção ao focinho) para expor a superfície dorsolateral do olho para injeção. Abreviaturas: V = ventral, D = dorsal, M = medial, L = lateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Localização e profundidade da injeção. A agulha é injetada no aspecto dorsolateral do globo ocular e todo o comprimento do eixo da agulha (0,5 pol/12,7 mm) é inserido no olho. Observe o ângulo da agulha em direção à parte posterior do olho para evitar a lente e injete o mais próximo possível da retina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Manejo pós-operatório

1. Após a conclusão do procedimento, pare a anestesia por inalação de gás isoflurano, lave a linha com oxigênio a 100%, desconecte a mangueira do tubo endotraqueal e transfira as ovelhas para a sala de recuperação.
2. Coloque as ovelhas em decúbito esternal, com as pernas dobradas por baixo, e monitore até a recuperação completa. Certifique-se de que a boca do animal esteja livre de quaisquer obstruções.
3. Quando o reflexo de deglutição for observado, esvazie parcialmente o manguito do tubo endotraqueal e remova suavemente o tubo da boca.
4. Administrar um anti-inflamatório não esteroidal intramuscular no músculo bíceps femoral do membro posterior, antibióticos subcutâneos no lado do pescoço ou atrás do ombro e colírios de cloranfenicol a 0,5% na superfície do globo ocular.
5. Forneça água e comida (pellets de luzerna e palha) uma vez que as ovelhas possam ficar desassistidas.
6. Administrar 0,5% cloranfenicol colírio 2-3 por dia durante 7 dias após a cirurgia.
7. Mantenha as ovelhas dentro de casa durante a noite antes de retornar ao piquete ao ar livre aproximadamente 24 horas após a cirurgia.
8. Registre as temperaturas retais diariamente por 3 semanas. Monitore quaisquer alterações no pulso ou na frequência respiratória, consumo de alimentos, neurocomportamento, temperatura corporal, peso, postura, saúde ocular e sinais clínicos de problemas de saúde. Procure tratamento veterinário adequado se houver indícios de eventos adversos.

6. Avaliação da eficácia in vivo

1. Se o objetivo da injeção de TVI for preservar a visão, monitore a eficácia in vivo por métodos como o teste de labirinto ou eletrorretinografia (ERG) para avaliar a função celular da retina ou a tomografia de coerência óptica (OCT) para avaliar a estrutura da retina.
   NOTA: Essas medidas de eficácia têm sido bem descritas após a terapia gênica com^TVI 11,15,16.

7. Análise de tecido post-mortem

1. Realizar a eutanásia de ovinos por um método aprovado em um desfecho apropriado após a cirurgia de injeção intravítrea.
   NOTA: Métodos de eutanásia sugeridos, como medicamentos veterinários intravenosos para eutanásia ou um parafuso cativo penetrante na coluna cervical seguido de exsanguinação rápida, são detalhados em outros lugares^15,16.
2. Colha globos oculares de ovelha usando tesouras curvas cirúrgicas afiadas/contundentes. Corte o canto lateral e medial para aumentar a abertura da cavidade ocular e, em seguida, corte sistematicamente as dobras conjuntivais, o tecido conjuntivo, os músculos e o nervo óptico para liberar o globo ocular da órbita.
3. Imersão-fixação de globos oculares enucleados intactos em formalina a 10% por 2 h, seguida de pós-fixação em solução de Bouin por 4 h, fazendo um pequeno corte (0,5 cm) na esclera para permitir perfusão suficiente. Alternativamente, a imersão fixa os globos oculares na solução de Davidson por 48 h.
4. Processe seções do tecido ocular através da incorporação e seccionamento de cera de parafina de rotina a 3-5 μm.
   NOTA: Procedimentos de coloração por coloração de hematoxilina e eosina (H&E) e análise imuno-histoquímica já foram descritos anteriormente^15,16.
5. Avalie a eficácia no tecido post-mortem por medidas como espessura total da retina, espessura da camada da retina, contagens de fileiras celulares da camada nuclear externa e coloração imuno-histoquímica para tipos de células da retina, glia da retina ou proteínas de interesse.
   NOTA: Para protocolos para essas análises, ver publicações anteriores^15,16.

Resultados

A eficácia da administração de IVT de um vetor de terapia gênica CLN5 na atenuação da disfunção e degeneração da retina em ovinos com CLN5 NCL já foi demonstrada anteriormente por este grupo de pesquisa¹⁵. Os ovinos afetados receberam uma única injeção de 100 μL de TVI de CLN5 embalado em um vetor AAV sorotipo 9 (AAV9) (AAV9). CLN5) em um olho, com o olho contralateral servindo como um controle interno não tratado. A visão foi avaliada mensalmente desde a idade na injeção (3 mes...

Discussão

As injeções intravítreas são um dos procedimentos cirúrgicos mais comuns na oftalmologia humana e provaram ser eficazes na administração de terapias genéticas mediadas por AAV para a retina de ovinos. Já havíamos demonstrado anteriormente a eficácia do AAV9. A terapia gênica com CLN5 foi administrada intravitrealmente na atenuação da disfunção e degeneração da retina em ovinos com CLN5 NCL¹⁵. Espera-se que a tradução desta via de administração para pacientes humanos com NCL t...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL low dead-space safety syringe with permanently attached 0.5 inch needle	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	05-561-28	Covidien Monoject Tuberculin Safety syringe or similar
1.5 mL microcentrifuge tube	Sigma Aldrich	HS4323	Autoclave tubes to sterilise prior to use
Anesthesia machine with gas bench and monitor	Hyvet Anesthesia, Christchurch, New Zealand
Antibiotic eye drops	Teva Pharma Ltd, Auckland, New Zealand		Commercial name: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)
BrightMount plus anti-fade mounting medium	Abcam, Cambridge, United Kingdom	ab103748
DAPI (4′ ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States	10236276001
Diazepam sedative	Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, Tauranga, New Zealand		5 mg/mL
Endotracheal tubes	Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, United Kingdom		Standard, cuffed. Sizes 7, 7.5, or 8 depending on sheep size
Eye speculum	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	KP151/14	Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)
Fenestrated surgical drape	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	DI583	Or similar
Filter Tips	Interlab, Auckland, New Zealand		10, 200, and 1,000 µL
Formaldehyde solution (37%)	Fisher Scientific, Auckland, New Zealand	AJA809-2.5PL	Make up to 10% in distilled water with 0.9% NaCl
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 594	Invitrogen Carlsbad, CA, USA	A-11012	Use at a dilution of 1:500
Isoflurane anesthetic	Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand
Ketamine HCl anesthetic/analgesic	PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand		100 mg/mL
Laryngoscope (veterinary)	KaWe Medical, Denmark		Miller C blade, size 2
Needles	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	302025	BD Hypodermic Needles, or similar
Non-steroidal anti-inflammatory	Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand	49402/008	Commercial name: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)
Non-toothed forceps	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AB864/16	Or similar
Non-toothed hemostat	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AA150/12	Or similar
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	16210072
Oxygen (medical)	BOC Gas, Christchurch, New Zealand		D2 cylinder, gas code 180
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific, Christchurch, New Zealand	10010023	Sterile, filtered
Povidone-Iodine solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	005835	Commercial name: Betadine (10% povidone-iodine)
Rabbit anti-cow glial fibrillary acidic protein (GFAP)	Dako, Glostrup, Denmark	Z0334	Use at a dilution of 1:2,500
Self-complementary adeno-associated virus serotype 9, containing the chicken beta action (CBh) promoter and codon-optimized ovine CLN5	University of North Carolina Vector Core, NC, USA.	scAAV9/CBh-oCLN5opt
Sodium Chloride 0.9% IV Solution	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	AHB1322	Commercial name: Saline solution
Subcutaneous antibiotics	Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, Wellington, New Zealand		Commercial name: Duplocillin LA (150,000 IU/mL procaine penicillin and 115,000 IU/mL benzathine penicillin)
Surgical sharp blunt curved scissors	Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand	SSSHBLC130
Terumo Syringe Luer Lock	Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand	SH159/SH160	Sterile syringes; 10 mL for drawing up induction drugs, 20 mL for drawing up saline
Virkon Disinfectant Powder	EBOS Group Ltd, Christchurch, NZ	28461115