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Resumen

Tradicionalmente, el cultivo celular se realiza sobre sustratos planos que imitan mal el entorno natural de las células in vivo. Aquí describimos un método para producir sustratos de cultivo celular con geometrías curvas fisiológicamente relevantes y proteínas extracelulares micromodeladas, lo que permite investigaciones sistemáticas sobre la detección celular de estas señales extracelulares.

Resumen

La matriz extracelular es un importante regulador de la función celular. Se ha demostrado cada vez más que las señales ambientales existentes en el microambiente celular, como la distribución de ligandos y la geometría de los tejidos, desempeñan un papel crítico en el gobierno del fenotipo y el comportamiento celular. Sin embargo, estas señales ambientales y sus efectos sobre las células a menudo se estudian por separado utilizando plataformas in vitro que aíslan las señales individuales, una estrategia que simplifica en gran medida la compleja situación in vivo de múltiples señales. Los enfoques de ingeniería pueden ser particularmente útiles para cerrar esta brecha, mediante el desarrollo de configuraciones experimentales que capturen la complejidad del microambiente in vivo , pero que conserven el grado de precisión y manipulabilidad de los sistemas in vitro .

Este estudio destaca un enfoque que combina el modelado de proteínas basado en ultravioleta (UV) y la microfabricación de sustrato basada en litografía, que en conjunto permiten una investigación de alto rendimiento sobre los comportamientos celulares en entornos de multicue. Mediante el fotopatronaje UV sin máscara, es posible crear distribuciones de proteínas complejas y adhesivas en sustratos de cultivo celular tridimensionales (3D) en chips que contienen una variedad de señales geométricas bien definidas. La técnica propuesta se puede emplear para sustratos de cultivo hechos de diferentes materiales poliméricos y combinados con áreas con patrones adhesivos de una amplia gama de proteínas. Con este enfoque, las células individuales, así como las monocapas, pueden ser sometidas a combinaciones de señales geométricas y señales de guía de contacto presentadas por los sustratos modelados. La investigación sistemática utilizando combinaciones de materiales de chips, patrones de proteínas y tipos de células puede proporcionar información fundamental sobre las respuestas celulares a los entornos de multicue.

Introducción

In vivo, las células están sujetas a una amplia variedad de señales ambientales que pueden ser de naturaleza mecánica, física y bioquímica que se originan en la matriz extracelular (ECM). Se han identificado numerosas señales ambientales que desempeñan un papel vital en la regulación del comportamiento celular, como la proliferación, la diferenciación yla migración 1,2,3,4,5. Uno de los fenómenos más ampliamente investigados es la guía de contacto, que describe la alineación celular mediada por adhesión a lo largo de patrones bioquímicos o topográficos anisotrópicos presentes en el sustrato extracelular 6,7,8,9,10,11. Más allá de dirigir la alineación de las células, también se ha demostrado que las señales de guía de contacto influyen en otras propiedades celulares como la migración celular, la organización de las proteínas intracelulares, la forma celular y el destino celular 12,13,14,15. Además, la arquitectura geométrica del entorno celular 3D también ha sido reconocida por su influencia reguladora en el comportamiento celular16,17. En el cuerpo humano, las células están expuestas a una variedad de geometrías curvas, que van desde fibras de colágeno a microescala, capilares y glomérulos, hasta alvéolos y arterias de mesoescala18,19. Curiosamente, estudios recientes in vitro han demostrado que las células pueden detectar y responder a tales señales físicas, desde la nanoescala hasta la mesoescala 20,21,22,23.

Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que investigan la respuesta celular a las señales ambientales se han realizado en gran medida utilizando configuraciones experimentales que aíslan señales individuales. Si bien este enfoque ha permitido un tremendo progreso en la comprensión de los mecanismos básicos detrás de la detección celular de señales ambientales, recapitula mal el entorno in vivo que presenta simultáneamente múltiples señales. Para cerrar esta brecha, es útil desarrollar plataformas de cultivo mediante las cuales se puedan controlar múltiples señales ambientales de forma independiente y simultánea. Este concepto ha ganado una tracción creciente últimamente24,25, con estudios que combinan la rigidez de la matriz y la densidad del ligando 26,27,28,29, la rigidez y la porosidaddel sustrato 30, la rigidez del sustrato y el volumen31 del microniche 3D, la topografía de la superficie y las señales de guía de contacto32,33,34 , y señales de guía de contacto a nanoescala con señales de guía de curvatura a mesoescala23. Sin embargo, sigue siendo un desafío combinar las señales de guía de contacto con una variedad de geometrías 3D de una manera controlada y de alto rendimiento.

Este protocolo de investigación aborda este desafío e introduce un método para crear sustratos de cultivo celular con una combinación controlada de áreas adhesivas estampadas de proteínas ECM (señales de guía de contacto) y curvatura del sustrato (señales geométricas). Este enfoque permite la disección de la respuesta celular en un entorno biomimético multicue de una manera sistemática y de alto rendimiento. El conocimiento adquirido puede ayudar a comprender mejor el comportamiento celular en entornos complejos y se puede utilizar para diseñar materiales instructivos con propiedades que dirijan las respuestas celulares hacia un resultado deseado.

Fotopatronaje de proteínas 3D
La creación de áreas adhesivas de proteínas ECM (señales de guía de contacto) en materiales de cultivo celular se puede lograr utilizando una variedad de técnicas, por ejemplo, mediante patrones ultravioleta profundo (UV profundo) o impresiónde microcontacto 35,36. El patrón UV profundo hace uso de la luz UV que se proyecta a través de una máscara en un material polimérico para degradar los polímeros de pasivación en lugares específicos en el sustrato de cultivo celular. El sustrato modelado se incuba con un ligando de interés, lo que resulta en áreas adhesivas que soportan la unión celular y el cultivo en ubicaciones predefinidas 12,37,38. Una forma alternativa de introducir patrones de proteínas es mediante la impresión de microcontactos, donde los sellos elastoméricos que contienen una forma deseada se recubren con una proteína de elección y se presionan sobre un sustrato de cultivo celular, transfiriendo así el recubrimiento proteico al que las células pueden adherirse 35,37,39,40 . Desafortunadamente, dado que ambas técnicas se basan en la preparación de máscaras y métodos de litografía suave, los experimentos consumen mucho tiempo y mano de obra, así como son limitados en términos de flexibilidad del patrón. Además, tanto el patrón UV profundo como la impresión de microcontacto son más adecuados para materiales planos y son técnicamente difíciles, si no imposibles, para modelar ligandos en un entorno 3D.

Para mejorar estos métodos convencionales, Waterkotte et al. combinaron litografía sin máscara, deposición química de vapor y termoformado para generar sustratos poliméricos 3D con micromodelado41. Sin embargo, esta técnica se basa en el uso de películas de polímeros termoformables y ofrece una baja resolución de patrón de proteínas (7,5 μm), mientras que se ha informado que las células responden a patrones geométricos de proteínas tan pequeños como 0,1 μm 2,42. Sevcik et al. describieron otro método prometedor para nanomodelar ligandos ECM en sustratos que contienen topografías nanométricas y micrómetros43. Utilizando la impresión de microcontacto, las proteínas ECM se transfirieron de sellos de polidimetilsiloxano (PDMS) a un sustrato termosensible de poli(N-isopropilacrilamida) (pNIPAM). Posteriormente, la propiedad termorreceptiva de la red pNIPAM les permitió transferir el patrón de proteína bidimensional (2D) a un sustrato TOPOGRÁFICO PDMS (surcos de 10-100 μm de profundidad), controlando así la localización de sitios de adhesión en características topográficas. Sin embargo, no todas las microtopografías posibles pueden ser modeladas ya que la disminución de los problemas de humectabilidad hace que sea más difícil modelar sustratos topográficos más profundos. Se ha informado que las zanjas con una relación de aspecto profundidad-anchura de 2,4 son el límite final para transferir con éxito el patrón al sustrato topográfico43. Además, la flexibilidad de los patrones variables y la resolución de los patrones generados son deficientes debido al requisito de la impresión de microcontactos.

Este documento describe un método que supera los cuellos de botella mencionados anteriormente y ofrece un método flexible y de alto rendimiento para crear sustratos multicue que se pueden utilizar para el cultivo celular (ver Figura 1). Las geometrías fisiológicamente relevantes (cilindros, cúpulas, elipses y superficies de sillín) con curvaturas que van desde ĸ = 1/2500 a ĸ = 1/125 μm-1 están prediseñadas y microfabricadas en chips PDMS. Posteriormente, las señales de guía de contacto se crean sobre las geometrías 3D utilizando una variedad de diseños de patrones digitales mediante el empleo de una técnica de fotopatronaje con una resolución tan pequeña como 1.5 μm44. Con este fin, los chips PDMS se pasivan inicialmente para evitar que las células y las proteínas se adhieran; esta capa de pasivación se puede eliminar mediante la combinación del fotoiniciador cloruro de 4-benzoilbencil-trimetilamonio (PLPP) y la exposición a la luz UV45. Una máscara digital está diseñada para especificar las ubicaciones de la exposición a los rayos UV y, por lo tanto, el área donde se elimina la capa de pasivación. Las proteínas pueden adherirse posteriormente a estas áreas, lo que permite la unión celular. Dado que el modelado se realiza utilizando una máscara digital (en lugar de física), se puede crear rápidamente una variedad de patrones sin la molestia y el costo asociados con el diseño y la fabricación de fotomáscaras adicionales. Además, una amplia gama de proteínas ECM (por ejemplo, colágeno tipo I, gelatina y fibronectina) pueden ser modeladas en el sustrato. Aunque este protocolo se realiza utilizando chips de cultivo celular hechos de PDMS, el principio se puede aplicar a cualquier otro material de interés46.

Protocolo

En los estudios descritos en este protocolo se utilizaron queratocitos humanos primarios. Esta investigación se realizó de conformidad con los principios de la Declaración de Helsinki. Los queratocitos primarios se aislaron de tejidos corneoesclerales cadavéricos humanos sobrantes de la cirugía de queratoplastia endotelial de membrana de Descemet, que se obtuvieron del Departamento de Córnea del Centro Multitesular ETB-BISLIFE (Beverwijk, Países Bajos) después de obtener el consentimiento de los familiares de todos los donantes fallecidos.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, reactivos, equipos y software utilizados en este protocolo.

1. Fabricación de sustratos de cultivo celular 3D

  1. Cree un molde de vidrio negativo (# 1) que contenga todas las características de interés, en este caso, hecho de vidrio utilizando una técnica de escritura directa con láser de femtosegundo (ver Figura 2).
  2. Coloque con cuidado el molde de vidrio negativo (# 1) en la parte inferior de una placa de Petri.
  3. Prepare un prepolímero PDMS colocando un tubo cónico vacío de 50 ml en una báscula, tara la escala y vierta la cantidad deseada de base de elastómero de silicona en el tubo.
  4. Agregue el agente de curado utilizando una pipeta Pasteur para que la proporción final de base de elastómero y agente de curado sea de 10: 1 (p / w).
  5. Mezcle bien los componentes en el tubo cónico usando una espátula.
  6. Centrifugar a 2.000 × g durante 70 s para eliminar todas las burbujas de aire.
  7. Vierta el prepolímero PDMS sobre el molde de vidrio negativo (# 1) en la placa de Petri para cubrirlo por completo.
  8. Coloque la placa de Petri con el molde de vidrio negativo (# 1) y el prepolímero PDMS en el desecador de vacío y encienda la bomba de vacío. Una vez que se alcanza el vacío, espere 5 minutos para eliminar todas las burbujas presentes en la interfaz entre la superficie del molde y el prepolímero PDMS.
  9. Retira la aspiradora y saca la placa de Petri del desecador.
  10. Cure el prepolímero PDMS durante la noche en el horno a 65 °C.
  11. Retire con cuidado el chip PDMS positivo recién curado (# 2) del molde de vidrio negativo (# 1) levantando los bordes del PDMS con una espátula. Si el chip PDMS positivo (# 2) tiende a adherirse al molde de vidrio negativo (# 1), agregue etanol o agua a los bordes de la huella mientras se levanta.
    NOTA: El fluido correrá entre las dos capas y facilitará la separación del molde de vidrio negativo (# 1) y el chip PDMS positivo (# 2).
  12. Con una cuchilla, corte los lados del chip PDMS positivo (# 2) para que quede un chip rectangular.
  13. Coloque el chip PDMS positivo (#2) en un desecador junto a un vial pequeño con una gota de tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorosilano, un agente de silanización, y déjelo al vacío durante la noche.
    NOTA: La silanización se asegurará de que la impresión no se vincule a otras capas de PDMS más adelante en el protocolo. Otros agentes y/o métodos de silanización también pueden funcionar para garantizar que las superficies de los chips PDMS no se adhieran a otras capas PDMS.
    PRECAUCIÓN: Tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahidrooctil)triclorosilano es inflamable (H226) y causa quemaduras graves en la piel y daño ocular (H314). Use equipo de protección personal, trabaje en una campana extractora de humos y lávese bien las manos después de manipularlo. Mantenga el agente de silanización alejado del calor, las superficies calientes, las chispas, las llamas abiertas y otras fuentes de ignición. Conservar entre 15 y 30 °C (P280, P210, P240, P403, P235, P310).
  14. Retire el vacío y coloque el chip PDMS positivo (# 2) en la parte inferior de una placa de Petri. Vierta el prepolímero PDMS (10: 1) en la parte superior para producir múltiples moldes PDMS negativos (# 3).
  15. Coloque la placa de Petri al vacío en el desecador durante 15 minutos para eliminar todas las burbujas.
  16. Cure el prepolímero PDMS a 65 ° C durante la noche, después de lo cual el molde PDMS negativo (# 3) se puede despegar del chip PDMS positivo (# 2) usando una espátula.
  17. Silanizar el molde PDMS negativo final (#3) utilizando el agente de silanización en un desecador al vacío durante la noche.
  18. Producir múltiples chips de cultivo celular (#4, ver Figura 2) de aproximadamente 5 mm de espesor vertiendo el prepolímero PDMS en el molde PDMS negativo (#3), eliminando burbujas usando el desecador y curando durante 3 h a 65 °C. Con una cuchilla de afeitar, corte el chip al tamaño final como se visualiza en la Figura 2. Guarde las virutas a temperatura ambiente.
    NOTA: La rugosidad de la superficie puede influir en la respuesta celular. Si es necesario, se puede usar una capa delgada adicional de PDMS como recubrimiento en el chip PDMS positivo (# 2) para alisar la superficie. Para hacerlo, vierta una pequeña gota de prepolímero PDMS en el chip y extiéndalo sobre el chip completo con aire a presión. Curar la viruta recubierta a 65 °C durante 3 h y continuar con el paso 1.12.

2. Fabricación de muestras planas de PDMS (muestras de control)

  1. Prepare el prepolímero PDMS (10:1) de acuerdo con los pasos 1.3-1.6.
  2. Coloque una cubierta de vidrio en el poste de vacío redondeado en el centro del revestimiento de centrifugado.
  3. Encienda la aspiradora para conectar la cubierta de vidrio a la máquina y pipetee una gota de PDMS en el medio de la cubierta con una pipeta Pasteur.
  4. Distribuya el prepolímero PDMS sobre el sustrato de vidrio utilizando el siguiente protocolo para obtener una capa de aproximadamente 10 μm de espesor.
    1. Spincoat para 10 s a 0,45 × g, aceleración: 0,2 × g/s.
    2. Spincoat para 50 s a 44,8 × g, aceleración: 0,54 × g/s.
  5. Apague la aspiradora, retire la funda de la rejilla de centrifugado con pinzas y colóquela en una placa de Petri. Cure el PDMS durante la noche en el horno a 65 °C y guárdelo a temperatura ambiente después.

3. Pasivación de sustratos de cultivo celular 3D

  1. Activar los grupos hidroxilo en la superficie del chip PDMS (#4) usando O2-plasma. Usando pinzas, coloque el chip en la canasta del plasma asher.
  2. Ejecute un ciclo de cenizas utilizando una potencia de 20 W durante 30 s. Ventile la cámara de cenizas usando N2.
  3. Saque el chip de la cesta y colóquelo en un pequeño contenedor PDMS (consulte la Figura 1).
  4. Usando una pipeta Pasteur, agregue 500 μL de poli-L-lisina (PLL, 0.01%) en la parte superior del chip para que la superficie completa se sumerja en la solución PLL. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  5. Retire 450 μL del PLL del chip de cultivo celular con una pipeta y enjuague la superficie del chip tres veces con 500 μL de tampón HEPES de 0,1 M (8 < pH < 8,5). Siempre deje un pequeño volumen de líquido en el chip PDMS para evitar que se seque la muestra, lo que reducirá la calidad del patrón final.
  6. Hacer 500 μL de un valerato de metoxipolietilenglitilenglicol-succinimidil de 50 mg/ml (mPEG-SVA; MW 5.000 Da) solución en tampón HEPES de 0,1 M (8 < pH < 8,5) por chip de cultivo celular y dejar incubar en la muestra durante 60 min. Dado que el mPEG-SVA tiene una vida media de 15 minutos, asegúrese de preparar la cantidad requerida justo antes de su uso.
    NOTA: El mPEG-SVA se disuelve cuando la solución es completamente transparente.
  7. Retire 450 μL de la solución mPEG-SVA con un micropipeta y lave la superficie del chip cinco veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Asegúrese de canalizar hacia arriba y hacia abajo varias veces por lavado para asegurarse de que se elimine todo el mPEG-SVA no unido. Para evitar que la muestra se seque, minimice el tiempo entre los pasos de lavado y asegúrese de usar un exceso (500 μL o más) de PBS para el lavado.
  8. Almacene las muestras sumergiéndolas en PBS o continúe con el paso de modelado del protocolo.
    NOTA: Si se desea, la pasivación se puede realizar en condiciones estériles cuando se trabaja en un gabinete de cultivo y se trabaja con soluciones y equipos estériles.

4. Almacenamiento de sustratos de cultivo celular modelados

NOTA: Los sustratos de cultivo celular 3D se pueden almacenar durante diferentes pasos del proceso.

  1. Almacene los chips de cultivo celular PDMS curados en condiciones secas a temperatura ambiente.
  2. Almacene los chips de cultivo celular pasivados de una de estas dos maneras:
    1. Conservar en PBS a 4 °C durante un máximo de 7 días.
    2. Almacenar en condiciones secas hasta por varios meses. Para obtener muestras secas, retire el PBS y enjuague varias veces con agua destilada doble (ddH2O). Secado por soplado con una pistola de nitrógeno o aire.

5. Diseño de máscaras digitales utilizadas para el fotopatronaje

NOTA: El modelado de sustratos 3D se puede realizar utilizando uno o varios planos focales (ver Figura 3). Se puede utilizar un solo plano focal en funciones que no son más grandes que un dispositivo espejo digital (DMD, aproximadamente 300 μm x 500 μm) y que no son demasiado altas (50-100 μm). En ese caso, diseñe un patrón digital utilizando el modo TIFF. Para las características que exceden las dimensiones de un DMD y son relativamente altas, divida el patrón del sustrato en varios pasos. En este caso, se diseñan múltiples patrones utilizando el modo PDF que todos se enfocan individualmente en planos focales individuales.

  1. Diseñe una máscara digital utilizando herramientas de software de diseño.
    1. Modelado en modo TIFF (píxeles): Cree una mesa de trabajo completamente negra de 1.140 x 1.824 píxeles (el tamaño exacto de 1 DMD, aproximadamente 300 μm x 500 μm) y llene la mesa de trabajo con las formas de interés. Exporte la mesa de trabajo como un archivo TIFF de 8 bits.
      NOTA: Los diferentes niveles de gris en el diseño del patrón determinan la cantidad de exposición que se realizará en esa ubicación.
    2. Patronaje en modo PDF (unidades métricas): Cree una mesa de trabajo negra del tamaño deseado en mm y llene la mesa de trabajo con cualquier forma de interés. Divida el patrón en varios archivos si el sustrato 3D necesita ser modelado utilizando múltiples planos focales. Guarde la mesa de trabajo como un archivo PDF.
      NOTA: Los diferentes niveles de gris en el diseño del patrón determinan la cantidad de exposición que se realizará en esa ubicación.

6. Fotopatronaje UV de sustratos de cultivo celular 3D

  1. Calibración
    NOTA: La calibración del láser se realiza para obtener un enfoque adecuado en el material de interés. Dado que los sustratos de cultivo celular PDMS son demasiado gruesos para modelar, use una diapositiva de vidrio en la que se coloque el chip al revés. Dado que el láser se encuentra primero con la diapositiva de vidrio, use vidrio para calibrar el láser.
    1. Aplique un iluminador fluorescente en una funda de vidrio y coloque la cubierta de vidrio en la etapa del microscopio fluorescente. Asegúrese de que la superficie resaltada esté orientada hacia arriba.
    2. Encienda el microscopio y el equipo PRIMO y abra Micro-manager para acceder al software Leonardo en 'plugins'.
    3. Elija Calibración en el menú inicial, seguido de seleccionar el objetivo 20x tanto en el microscopio como en el software. Haga clic en Siguiente.
    4. Coloque el portaobjetos de vidrio con resaltador fluorescente en la trayectoria óptica del microscopio. Cambie al modo fluorescente y concéntrese cuidadosamente en la imagen PRIMO que aparece, asegurándose de que tanto el logotipo como el texto estén enfocados. Haga clic en Siguiente para finalizar el procedimiento de calibración.
    5. Anote la ubicación Z del escenario al calibrar y use esta ubicación como referencia más adelante en el protocolo.
      NOTA: El material de calibración debe coincidir con el material que se utiliza para el modelado más adelante en el protocolo. Los pasos anteriores describen la calibración necesaria para los sustratos de cultivo celular. Para la calibración de muestras planas de control de PDMS, aplique un iluminador fluorescente sobre una muestra de PDMS plana adicional y calibre siguiendo los pasos 6.1.2-6.1.5.
  2. Modelado de características 3D utilizando un único plano focal
    NOTA: El modelado utilizando un solo plano focal se realiza en características 3D que no exceden las dimensiones de un DMD (aproximadamente 300 μm x 500 μm). En la figura 3 se ilustra un esquema de la configuración del plano focal.
    1. Retire la diapositiva de calibración del escenario y coloque una diapositiva de vidrio que contenga una gota (~ 50 μL) de fotoiniciador (PLPP) en la etapa.
      PRECAUCIÓN: PlPP es irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel (R36-38). Use equipo de protección personal, manténgalo alejado de materiales explosivos, nunca agregue agua a este producto, tome medidas de precaución contra las descargas estáticas y evite golpes y fricción (S26-36).
    2. Coloque el sustrato de cultivo celular PDMS boca abajo en la gota del fotoiniciador. Asegúrese de que las características 3D en la superficie del sustrato de cultivo celular se enfrenten al portaobjetos de vidrio y estén completamente sumergidas en PLPP para garantizar un patrón adecuado.
    3. Seleccione Patrón en el software.
    4. Cambie al modo de campo brillante en el microscopio y mueva el escenario a la característica de interés.
    5. Concéntrese en la parte superior o inferior de las estructuras convexas y cóncavas respectivamente (Figura 3).
    6. Seleccione PRIMO para insertar un patrón de su elección. Observe la vista previa del patrón en naranja en la parte superior de la imagen de campo brillante en vivo.
    7. Ajuste la configuración de patrones de acuerdo con la función (ubicación, ángulo, repeticiones) y seleccione una dosis de 1.000 mJ / mm2.
    8. Haga clic en Bloquear y cambie el microscopio al modo fluorescente .
    9. Haga clic en el botón Reproducir en la parte inferior derecha de la pantalla para iniciar el patrón. Una vez terminado, observe el patrón que se muestra en verde.
    10. Una vez que haya terminado con todas las características en un chip de cultivo celular, retire el chip de la diapositiva de patrón y guárdelo en PBS a 4 ° C.
  3. Modelado de características 3D utilizando múltiples planos focales
    NOTA: El modelado utilizando múltiples planos focales se realiza en características 3D que son más grandes que un DMD (aproximadamente 300 μm x 500 μm) o son relativamente altas. En este caso, las características 3D deben ser modeladas en múltiples pasos, es decir, el diseño del patrón debe adaptarse de acuerdo con el ejemplo de la Figura 3.
    1. Retire la diapositiva de calibración del escenario y coloque una diapositiva de vidrio que contenga una gota (~ 50 μL) de fotoiniciador (PLPP) en la etapa.
    2. Coloque el chip de cultivo celular PDMS boca abajo en la gota del fotoiniciador con pinzas.
    3. Seleccione Patrón en el software. Cambie al modo de campo brillante en el microscopio y mueva el escenario a la característica de interés.
    4. Concéntrese en el área del chip en la ubicación correcta. Dado que el modelado se realiza en un solo plano focal y las características son más grandes que un solo DMD, use múltiples planos focales y, por lo tanto, múltiples rondas de patrones por sustrato 3D para garantizar una resolución de patrón suficiente a lo largo de la altura y el ancho completos de la función (consulte la Figura 3). Por ejemplo, para una función con una altura de 150 μm, modele la función en tres rondas (± 1 plano focal por 50 μm de recorrido en Z), centrándose alrededor de 25 μm, 75 μm y 125 μm desde la parte inferior de la función. Asegúrese de que la parte inferior de la función esté alrededor del valor anotado en el paso 6.1.5.
    5. Seleccione PRIMO para insertar el patrón de elección. Observe la vista previa del patrón que se muestra en naranja en la parte superior de la imagen de campo brillante en vivo.
    6. Ajuste la configuración de patrones de acuerdo con la función (ubicación, ángulo) y seleccione una dosis de 1.000 mJ/ mm2.
    7. Haga clic en Bloquear y cambie el microscopio al modo fluorescente .
    8. Haga clic en el botón Reproducir en la parte inferior derecha de la pantalla para iniciar el patrón. Una vez terminado, observe el patrón que se muestra en verde.
    9. Repita los pasos 6.3.4 a 6.3.8 sobre la característica de interés cuando se utilicen varios planos focales.
    10. Una vez que haya terminado con todas las características en un chip de cultivo celular, retire el chip de la diapositiva de patrón y guárdelo en PBS a 4 ° C.
      NOTA: Si lo desea, aplique el fotopatronaje UV en condiciones estériles, haciendo uso de placas de Petri con fondo de vidrio y prepare todos los sustratos en gabinetes de cultivo estériles. Almacene las muestras con patrones en PBS hasta por un par de semanas. Cuando se lavan con ddH2O y se secan con aire a presión, las muestras se pueden almacenar hasta unos meses a 4 °C.

7. Incubación de proteínas

NOTA: Se recomienda utilizar sustratos recién incubados con proteínas para el cultivo celular. Solo proceda a esta parte del protocolo si la siembra celular (paso 8) se realiza directamente después.

  1. Transfiera el chip de cultivo celular con patrón a contenedores PDMS estériles en el gabinete de cultivo.
  2. Lave los chips de cultivo celular con patrón 3x con un exceso de PBS estéril si el patrón no se realizó en condiciones estériles.
  3. Prepare una solución de proteína fresca en PBS.
    1. Fibronectina: añadir 2 ml de PBS utilizando una micropipeta a un vial de 20 μg de fibronectina marcada con rodamina para obtener una concentración de 10 μg/ml. Pipetee suavemente para evitar la formación de grupos de proteínas y proteger de la luz.
    2. Gelatina: descongelar una alícuota de 200 μL de gelatina-fluoresceína disuelta. Proteger de la luz.
  4. Agregue 200-500 μL de la solución de proteína al chip de cultivo celular usando un micropipeta. Ajuste el tiempo y la temperatura de incubación dependiendo de la proteína de elección: Fibronectina: 5 min a temperatura ambiente, Gelatina: 15 min a 37 °C. Asegúrese de cubrir la muestra (por ejemplo, con papel de aluminio).
  5. Retire la solución proteica y lave 5 veces con 500 μL de PBS estéril. Asegúrese de canalizar el PBS hacia arriba y hacia abajo varias veces por encima de todas las características relevantes del chip de cultivo celular para eliminar cualquier proteína no unida.
    NOTA: Durante los pasos de lavado, es crucial que la muestra nunca se seque. Al retirar la solución de proteína o PBS durante el lavado, agregue pbS nuevo inmediatamente para evitar que se formen grupos de proteínas (consulte la Figura 4). Las características convexas son especialmente sensibles a la desecación, ya que se elevan por encima de la superficie del sustrato.
  6. Opcional: revise los patrones de proteínas bajo un microscopio de fluorescencia. Mantenga las muestras estériles e inmersas en PBS.

8. Siembra celular

NOTA: Este protocolo utiliza queratocitos primarios humanos y fibroblastos dérmicos humanos. Los queratocitos fueron recolectados de tejido corneal humano de pacientes, de acuerdo con las directrices holandesas para el uso secundario de materiales, y previamente caracterizados como queratocitos47. Estas células se cultivan en DMEM suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) y 1 mM de ácido L-ascórbico 2-fosfato de sesquimagnesio hidratado de sal (vitamina C) a 37 °C durante un máximo de cuatro pasajes. Los fibroblastos dérmicos humanos se compraron y cultivaron en DMEM suplementados con 10% de FBS y 1% de P / S a 37 ° C para un máximo de 15 pasajes. Para la siembra de queratocitos y fibroblastos dérmicos en el chip de cultivo celular fotopatronado, se utilizaron 20.000 células por chip.

  1. Separar las células de interés (por ejemplo, usando tripsina) y preparar 1 ml de una suspensión celular de ± 10.000-50.000 células/ml en medio de cultivo por chip. Ajuste el número exacto de celdas añadidas por sustrato en función del tamaño de la celda y la lectura deseada.
  2. Retire el PBS del chip de cultivo celular y agregue 1 ml de suspensión celular.
  3. Transportar suavemente el chip de cultivo celular con las células a la incubadora e incubar durante 60 min a 37 °C.
  4. Compruebe la adhesión de las células en el chip de cultivo celular modelado bajo un microscopio de campo brillante. Busque morfologías celulares alargadas en el caso de patrones de línea (ver Figura 5). Si las células también han comenzado a adherirse fuera del área estampada, retírelas mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo directamente sobre las células en el sustrato.
    NOTA: Las celdas unidas al área con patrón permanecerán unidas, mientras que las celdas fuera de las áreas con patrón se separarán.
  5. Retire el chip de cultivo celular del recipiente PDMS y use pinzas estériles para colocarlo en una placa de 6 pocillos llena de ~ 5 ml de medio de cultivo.
  6. Cultive las células durante el tiempo deseado. Reemplace el medio de cultivo celular cada 2-3 días. Para garantizar la visualización del patrón de proteínas después del cultivo celular, reduzca la cantidad de exposición de la muestra a la luz durante el cultivo.

9. Tinción, adquisición y análisis de imágenes

  1. Fijación y tinción
    1. Después de la duración deseada del cultivo, retire casi todo el medio y lave tres veces con exceso de PBS. A continuación, incubar con formalina al 3,7% durante 15 min a temperatura ambiente seguido de tres pasos de lavado con PBS durante 5 min por lavado a temperatura ambiente. Nunca deje que la muestra se seque.
      PRECAUCIÓN: La formalina es dañina si se ingiere o si se inhala (H302, H332), puede causar una reacción alérgica en la piel (H317), se sospecha que causa defectos genéticos (H341) y puede causar cáncer (H350). Use equipo de protección personal y trabaje en una campana extractora de humos.
    2. Mante el sustrato de cultivo celular con los agentes de tinción o anticuerpos deseados. Para reducir los volúmenes de agentes de tinción, coloque las virutas de cultivo celular boca abajo en una gota de solución de tinción canalizada en un portaobjetos de vidrio.
    3. Almacene las muestras en PBS (a corto plazo) o adheridas a un funda utilizando un medio de montaje (a largo plazo) a 4 °C.
  2. Adquisición de imágenes
    1. Coloque la muestra teñida boca abajo en una gota de PBS en un portaobjetos de vidrio. Coloque la muestra en la etapa de un microscopio confocal.
    2. Dependiendo del nivel de detalle requerido, haga pilas Z con un objetivo adecuado (10x, 20x o 40x) y espaciado Z para garantizar la adquisición adecuada de imágenes.
  3. Análisis y visualización de imágenes
    1. Abra los archivos de imagen sin procesar en el software de análisis de imágenes y compruebe que las propiedades de la imagen (por ejemplo, dimensiones, resolución) son correctas.
    2. Ajuste el brillo y el contraste por canal si es necesario.
    3. Recorte la región de interés que contiene el patrón y las células.
    4. Opcional: realice un paso de deconvolución si es necesario.
    5. Cree un renderizado 3D de la pila Z utilizando el software de renderizado 3D.
    6. Optimice la configuración de contraste y ganancia para cada canal individual.
    7. Para crear una imagen del renderizado 3D, cree una instantánea y expórtela como . Archivo TIFF.
    8. Para crear una película del renderizado 3D, establezca el fotograma inicial y final, así como el período de tiempo antes de registrar la película. Exportar como .avi.

Resultados

Mediante el protocolo descrito, los sustratos de cultivo celular 3D PDMS pueden ser fotopatronados UV para crear áreas adhesivas precisas y de alto rendimiento adecuadas para la fijación celular. De esta manera, las células se someten a geometrías de sustrato relevantes y patrones de ligando adhesivo simultáneamente. Las propiedades celulares, como la orientación, el área celular y el número de adherencias focales, se pueden monitorear y utilizar fácilmente para comprender mejor el comportamiento celular en entornos complejos e in vivo.

Para verificar los eventos de patronaje en los sustratos 3D PDMS, se han medido composiciones de la superficie atómica del material en diferentes etapas del protocolo mediante espectroscopia atómica de fotoelectrones de rayos X (XPS)48. En resumen, las mediciones de XPS mostraron la presencia de cadenas PEG con una mayor señal de carbono en muestras pasivadas, que se redujo después del fotopatronaje. La incubación con fibronectina resultó en un aumento de la señal de carbono, lo que nuevamente indica una adhesión exitosa de proteínas en la superficie del chip de cultivo celular. A continuación, la resolución del patrón y la alineación en las características 3D se caracterizaron en una variedad de fosas cóncavas con patrones circulares (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1,000 μm-1 y ĸ = 1/3,750 μm-1, ver Figura 6). A partir de las proyecciones de máxima intensidad, se puede concluir que el patrón de proteínas se modeló con éxito en las tres características 3D. El perfil de intensidad de la Figura 6A muestra una alta resolución de patrón con transiciones nítidas entre áreas con y sin patrón. Además, se obtuvo una intensidad de proteína consistente a través del patrón completo en el hoyo.

El pozo cóncavo con ĸ = 1/250 μm-1 se modeló utilizando el método de plano focal único (un patrón), mientras que los pozos con ĸ = 1/1.000 μm-1 y ĸ = 1/3.750 μm-1 se modelaron utilizando dos y tres planos focales (patrones), respectivamente. Como se puede ver en las proyecciones de máxima intensidad en la Figura 6, ambos métodos dan como resultado una alineación perfecta de los patrones en la parte superior de las características. No se pueden observar transiciones desalineadas entre los dos planos y patrones focales diferentes.

Utilizando el protocolo descrito, se puede aplicar una amplia gama de diseños de patrones de proteínas a una variedad de geometrías (ver Figura 7 y Video 1). Para ilustrar la versatilidad de este método, los semicilinders (convexos y cóncavos), una superficie de silla de montar y un hoyo fueron modelados utilizando líneas y círculos de varios anchos. Los materiales fotomodelados se pueden utilizar posteriormente para el cultivo celular (ver Figura 7, Figura 8, Video 2, Video 3 y Video 4). Un ejemplo de fibroblastos dérmicos cultivados en un semicilinder cóncavo patrón (líneas de fibronectina, rojo, 5 μm de ancho y 5 μm) se muestra en la Figura 8, Figura 9 y Video 4. Durante el experimento, las células detectan y se adhieren al sustrato de cultivo celular multicue y permanecen viables con el tiempo. Como se puede ver en la tinción inmunofluorescente en la Figura 8, las células forman adherencias focales (grupos de vinculina) principalmente en las líneas de fibronectina.

Otro estudio de ejemplo que hace uso de estos materiales de cultivo celular fue publicado recientemente por nuestro grupo48. En este estudio, los miofibroblastos humanos y las células endoteliales se sometieron a la combinación de señales de guía de contacto y topografías geométricas. In vivo, ambos tipos de células experimentan señales de guía de curvatura y contacto en tejidos nativos, como en la vasculatura humana. Al someter las células in vitro a un entorno que combina ambas señales ambientales, la situación in vivo se puede recapitular, proporcionando una comprensión más profunda del papel del microambiente en el comportamiento celular. Se demostró que los miofibroblastos humanos se alinean con las señales de guía de contacto (líneas paralelas de fibronectina) en sustratos cilíndricos cóncavos48. Sin embargo, en estructuras convexas con curvaturas crecientes, las señales geométricas anularon las señales bioquímicas, lo que sugiere que los miofibroblastos pueden detectar tanto el grado como el signo de curvatura. Curiosamente, las células endoteliales solo podían adherirse a los sustratos cóncavos de multicue y no a los sustratos convexos de PDMS. En sustratos cóncavos con patrón de proteínas, las células endoteliales están orientadas en la dirección de la señal de guía de contacto. Este conocimiento fundamental in vitro tiene relevancia fisiológica en el campo de la ingeniería de tejidos vasculares y eventualmente puede ayudar en el diseño de construcciones inteligentes de ingeniería de tejidos.

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Figura 1: La línea de tiempo experimental de la aplicación de señales de guía de contacto en sustratos de cultivo celular 3D. En primer lugar, los chips de cultivo celular positivo se producen a partir de un molde PDMS negativo que contiene una gama de geometrías. El PDMS sin curar se vierte en el molde y se cura durante 3 h a 65 °C. Posteriormente, el PDMS se trata con plasma de O2 y se incuba con PLL y mPEG-SVA (azul, marcado) para pasivar la superficie del sustrato de cultivo celular. Después del lavado, el sustrato se voltea boca abajo en una gota de fotoiniciador (PLPP, verde, etiquetado) y se fotopatrea CON UV utilizando el enfoque LIMAP. Aquí, se utiliza una máscara digital con un patrón definido por el usuario para dividir la capa de pasivación en ubicaciones definidas. A continuación, se puede incubar una solución de proteína (roja, etiquetada) y solo se adherirá a los lugares donde se elimina la capa de pasivación. Las células sembradas en el sustrato se someten tanto a la geometría como a los patrones de proteínas, lo que permite la investigación del comportamiento celular en entornos complejos que imitan el vivo. Abreviaturas: PDMS = polidimetilsiloxano; mPEG-SVA = valerato de metoxipolietilenglicol-succinimidil; PLPP = cloruro de 4-benzoilbencil-trimetilamonio; LIMAP = Adsorción molecular inducida por la luz de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Diferentes etapas durante la producción y pasivación del sustrato de cultivo celular 3D. El molde de vidrio negativo (# 1) está diseñado con software de diseño asistido por computadora y producido utilizando una técnica de escritura directa con láser de femtosegundo. Este molde se utiliza para producir el chip PDMS positivo intermedio (# 2) y el molde PDMS negativo (# 3), que posteriormente se utilizan para producir el chip de cultivo celular final (# 4). Abreviatura: PDMS = polidimetilsiloxano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ilustración esquemática de los dos métodos de modelado. Izquierda: El fotopatronaje UV se realiza en características más pequeñas (aproximadamente un DMD) utilizando un solo plano focal y patrón. Como resultado, la función completa se modela de una sola vez. Derecha: Cuando se utilizan características más grandes (más grandes que un DMD), el patrón se divide en múltiples planos focales y patrones. Abreviatura: DMD = dispositivo espejo digital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Un ejemplo típico de un sustrato incubado con proteínas normal y seco. Proyecciones de máxima intensidad (XY) y vistas ortogonales (XZ) de sustratos normales y secos incubados con proteínas. Al lavar un sustrato de cultivo celular modelado después de la incubación con una solución de proteína, es crucial mantener siempre la muestra húmeda. Aunque el patrón es idéntico en todas las imágenes en las características (ĸ = 1/1.000 μm-1), la gelatina-fluoresceína (verde) se agregó formando un grupo importante cuando la muestra se dejó secar durante unos segundos. Si la muestra siempre permanece húmeda, se pueden observar patrones de proteínas correctos. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Imágenes de campo brillante después de la siembra. Queratocitos primarios (izquierda) y fibroblastos dérmicos (derecha) 4 h después de la siembra en características geométricas 3D (fosa cóncava de ĸ = 1/1.000 μm-1 y semicilinders de ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 y 1/125 μm-1). Las inserciones superiores izquierdas representan el patrón de línea utilizado para el modelado de las geometrías. Las flechas blancas indican celdas de propagación que ya muestran alineación. Barras de escala = 250 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Caracterización de patrones circulares en fosas cóncavas. (A) La proyección de máxima intensidad (XY) y vista ortogonal (XZ) de fosa aconceva (ĸ = 1/250 μm-1) estampada utilizando LIMAP (ancho de línea: 20 μm, ancho de hueco: 20 μm) e incubada con gelatina-fluoresceína (verde). El perfil de intensidad a lo largo de la línea blanca se traza contra la distancia, mostrando una calidad y resolución de patrón consistentes. (B) Patrones adicionales realizados en fosas cóncavas con ĸ = 1/1,000 μm-1 y ĸ = 1/3750 μm-1, mostrando flexibilidad en términos de características geométricas que pueden usarse para el modelado. Una vez más, se visualizan tanto las proyecciones de intensidad máxima (XY) como las vistas ortogonales (XZ). Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Datos de microscopía 3D de estructuras modeladas. Ejemplos típicos de materiales de cultivo celular con patrones 3D después del fotopatronaje y el cultivo celular, visualizados utilizando software de renderizado 3D. (A) Semicilinder convexo modelado con líneas de 10 μm de ancho (rodamina-fibronectina, rojo) y espacios de 10 μm de ancho. Barra de escala = 5 μm. (B) Fibroblastos dérmicos teñidos para F-actina (verde) cultivados en semicilinder cóncavo modelado con líneas de 20 μm de ancho (rodamina-fibronectina, rojo) y espacios de 20 μm de ancho. Barra de escala = 5 μm. (C) Superficie del sillín modelada con líneas de 20 μm de ancho (rodamina-fibronectina, rojo) y espacios de 20 μm de ancho. Barra de escala = 5 μm. (D) Fosa cóncava modelada con círculos concéntricos de líneas de 20 μm de ancho (gelatina-fluoresceína, verde) y huecos de 20 μm de ancho. El citoesqueleto de F-actina de los queratocitos humanos se tiñe con faloidina y se visualiza en rojo. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Tinción inmunofluorescente de fibroblastos dérmicos humanos en un semicilinder cóncavo fotomodelado. (A) Proyección de máxima intensidad (XY) y secciones ortogonales (XZ y YZ) de fibroblastos dérmicos humanos cultivados durante 24 h en un semicilizador cóncavo patrónado (líneas de fibronectina, rojo, 5 μm de ancho y huecos de 5 μm). Las células se tiñen para F-actina (magenta), vinculina (verde) y núcleos (azul). Barra de escala = 100 μm. (B) Zoom de una celda adherida al entorno multicue. Barras de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Imágenes de lapso de tiempo de campo brillante de fibroblastos dérmicos humanos en un cilindro cóncavo estampado. El semicífero cóncavo (ĸ = 1/250 μm-1) se modeló con líneas paralelas (5 μm de ancho y 5 μm de huecos) y se incubó con rodamina-fibronectina antes de la siembra celular. La imagen de lapso de tiempo se inicia 1 h después de la siembra celular inicial (izquierda, 0 min), cuando las células todavía están redondeadas y no adherentes (flechas). Después de aproximadamente 24 h (medio, 1.420 min), las células se adhirieron al sustrato multicue y muestran una respuesta de alineación de acuerdo con el patrón de guía de contacto. Tanto la respuesta de alineación como la viabilidad celular se mantienen a lo largo de toda la duración del cultivo (derecha, 3.180 min). Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Ejemplo de patrón en un sustrato cilíndrico 3D. Representación 3D de un cilindro convexo modelado con rodamina-fibronectina (rojo). Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Representación 3D de fibroblastos dérmicos cultivados en un sustrato cilíndrico 3D modelado (ĸ = 1/500 μm-1). Fibroblastos dérmicos cultivados durante 24 h en un semicilinder convexo patrón (líneas de fibronectina, rojo, 10 μm de ancho y huecos de 10 μm). Las células se tiñen para F-actina (magenta), vinculina (verde) y núcleos (azul). Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3: Representación 3D de queratocitos humanos cultivados en un pozo 3D modelado (ĸ = 1/3,750 μm-1). Representación 3D de queratocitos humanos cultivados durante 24 h en un hoyo cóncavo y estampado (círculos de gelatina, verdes, de 20 μm de ancho y huecos de 20 μm). Las células se tiñen para F-actina (rojo). Haga clic aquí para descargar este video.

Video 4: Imágenes de lapso de tiempo de campo brillante de fibroblastos dérmicos humanos en un cilindro cóncavo con patrón. El semicífero cóncavo (ĸ = 1/250 μm-1) se modeló con líneas paralelas (5 μm de ancho y 5 μm de huecos) y se incubó con rodamina-fibronectina antes de la siembra celular. La imagen de lapso de tiempo se inicia 1 h después de la siembra celular inicial, cuando las células muestran adherencia inicial al entorno multicue. Durante el lapso de tiempo completo, las células se orientan predominantemente a lo largo de las señales de guía de contacto, mientras que la viabilidad celular se mantiene. Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

Hoy en día, el comportamiento celular se estudia a menudo en sustratos de cultivo plano que carecen de la complejidad del microambiente celular nativo. Los entornos 3D como andamios e hidrogeles se utilizan como alternativa. Aunque estos entornos de cultivo celular mejoran la relevancia in vivo, tanto los estudios sistemáticos del comportamiento celular como la viabilidad de los métodos de lectura siguen siendo un desafío. Para investigar sistemáticamente el comportamiento celular en sustratos de cultivo representativos, se necesitan sustratos multicue consistentes que permitan la lectura microscópica. Por lo tanto, en este protocolo, describimos un método para crear sustratos de cultivo celular multicue con geometrías fisiológicamente relevantes y proteínas ECM modeladas. El principal desafío en la combinación de señales ambientales como la geometría de tejidos y las señales de guía de contacto en plataformas in vitro es en gran medida de naturaleza tecnológica. Los métodos convencionales para aplicar señales de guía de contacto (por ejemplo, litografía blanda, patrones UV profundos e impresiónde microcontacto 35,36) a materiales de cultivo celular se han optimizado para sustratos planos. La necesidad de materiales de cultivo celular 3D combinados con señales de guía de contacto destacó varios desafíos tecnológicos, como la mala alineación de patrones, la resolución y la flexibilidad. Para superar estos desafíos, se puede utilizar un método de modelado de alto rendimiento, sin máscaras y basado en la luz45,49. Aquí, un microscopio óptico permite una alineación precisa del patrón y una resolución del orden de micrómetros (ver Figura 6). Además, el uso de una máscara digital permite a los investigadores estudiar el comportamiento celular en una amplia gama de patrones sin la necesidad de fabricar máscaras físicas que requieren mucha mano de obra.

El enfoque de fotopatronaje UV se puede utilizar en combinación con una variedad de geometrías 3D (por ejemplo, cilindros, sillines, cúpulas, pozos) producidas a partir de una variedad de materiales48. Los sustratos de cultivo celular 3D utilizados en este estudio están hechos de PDMS; sin embargo, también se pueden utilizar otros materiales. Esto podría requerir diferentes pasos para producir el sustrato final de cultivo celular que contenga las características de interés. Dado que se ha demostrado que las células son sensibles a la rugosidad superficial de los materiales de cultivo celular, es importante crear los chips de cultivo celular con una superficie lisa para que la respuesta de las células observadas pueda ser totalmente atribuible a la geometría 3D y las señales de guía de contacto50,51. Se pueden utilizar métodos de medición como la profilometría óptica, la microscopía electrónica de barrido o la microscopía de fuerza atómica para medir la rugosidad de la superficie. Después de la fabricación del material de cultivo celular, se puede seleccionar un método de modelado basado en uno o varios planos focales dependiendo de las dimensiones específicas de la característica de interés (ver Figura 3). Por lo general, se utiliza un solo plano focal para modelar un área dentro de un rango Z de aproximadamente 50 μm. Se demostró que la resolución del patrón era consistente usando esta regla general (ver Figura 6). Sin embargo, una desventaja de este método es el aumento del tiempo de modelado con la introducción de múltiples planos y patrones focales. En nuestra mano, utilizando múltiples planos focales, las características geométricas 3D de hasta 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) se han modelado con éxito con una alta calidad de patrón.

Además, es importante mencionar que la altura (eje Z) de las características geométricas que se pueden utilizar en combinación con este protocolo es limitada. Dado que tanto el fotopatronaje UV como muchas lecturas celulares dependen de una configuración de microscopía, la distancia de trabajo de los objetivos determina la altura máxima de una característica. En nuestra mano, las geometrías que superan una altura de 300 μm todavía pueden ser fotopatronadas uv, y las lecturas se han realizado utilizando un microscopio confocal con objetivos 40x. Por lo tanto, la investigación mecanobiológica que va desde las escalas intracelulares hasta las celulares y tisulares es posible utilizando el protocolo descrito.

Otro factor que debe tenerse en cuenta es el riesgo de que las muestras se sequen durante o después del fotopatronaje UV49. Esto es especialmente relevante cuando se utilizan geometrías 3D, ya que las convexidades a menudo se exponen fuera de los materiales de cultivo celular. Como se muestra en la Figura 4, esto podría resultar en patrones desiguales con agregados de proteínas que se forman sobre la característica de interés. El lavado de los chips de cultivo celular después de la incubación de proteínas y durante el cultivo celular es fundamental para el recubrimiento adecuado de las geometrías 3D. Por lo tanto, se recomienda dejar siempre pequeños volúmenes de una solución de trabajo (PBS, PLPP, solución de proteína, medio de cultivo celular) sobre el chip de cultivo celular.

Hasta ahora, varios recubrimientos de proteínas (fibronectina, colágeno tipo I y IV, gelatina, FNC) y tipos de células (células estromales de médula ósea humana, miofibroblastos humanos, células endoteliales humanas, queratocitos humanos y fibroblastos dérmicos) se han utilizado en combinación con el enfoque de fotopatronaje descrito en materiales de cultivo celular estructurado. Como se muestra en un estudio anterior48, la optimización de los parámetros de incubación de proteínas es clave para la investigación sistemática en nuevos tipos de células. Por lo tanto, antes de realizar un nuevo experimento con nuevas proteínas o células, se recomienda probar un rango de concentraciones de proteínas, temperaturas de incubación y tiempos de incubación. Al comparar la morfología celular después de la adhesión inicial en áreas planas homogéneas y modeladas con la morfología celular en condiciones de cultivo celular "normales", se puede obtener un conjunto optimizado de parámetros experimentales. Además, cada tipo de célula puede requerir una cantidad diferente de tiempo después de la siembra para mostrar una morfología de adhesión reconocible en un entorno multicue específico (ver Figura 5). Con este fin, es crucial optimizar el tiempo requerido por tipo de célula para presentar eventos de contacto en el área estampada durante el lavado en el paso 8.4. Por ejemplo, observamos que en los patrones en línea, los queratocitos humanos muestran morfologías alargadas dentro de los primeros 30 minutos después de la siembra, mientras que las células endoteliales y los fibroblastos dérmicos requieren varias horas antes de mostrar un cambio en la morfología de adhesión. Por lo tanto, los parámetros experimentales requeridos para la incubación de proteínas (paso 7) y la siembra celular (paso 8) podrían depender de la proteína y el tipo de célula de elección.

El enfoque presentado para aplicar señales de guía de contacto en geometrías 3D puede ayudar a crear una comprensión más profunda del comportamiento celular en entornos complejos de múltiples capas. Esto puede incluir investigaciones sobre componentes intracelulares, como adherencias focales y núcleos, y también puede involucrar experimentos realizados en una escala más grande, celular o tisular utilizando el método propuesto. Eventualmente, se anticipa que el conocimiento adquirido se puede utilizar en el diseño de aplicaciones de ingeniería de tejidos, donde los entornos celulares complejos están diseñados para dirigir el comportamiento celular hacia un resultado deseado.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) por proporcionar queratocitos primarios humanos. Este trabajo ha sido apoyado por el Chemelot InSciTe (proyecto BM3.02); el Consejo Europeo de Investigación (subvención 851960); y el Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia para el Programa de Gravitación 024.003.013 "Regeneración Impulsada por Materiales". Los autores desean agradecer a Alvéole por su correspondencia, ayuda y solución de problemas.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1SigmaV9131Dilution: 1/600
Bovine Serum albumin, Fraction VRoche10735086001
DMEM, high glucose, pyruvateGibco41966029
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x)Gibco10565018
DMi8 epifluorescent microscopeLeica Microsystems
EthanolBiosolve0005250210BS
Fetal Bovine SerumSerana758093
Fiji/ImageJ, version v1.53kwww.imageJ.nih.gov
Fluorescent highlighterStabilo4006381333627
Fluorescin-labeled gelatinInvitrogenG13187Concentration: 0.01%
Formaldehyde solutionMerckF8775
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1VWR631-1575
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1Menzel-Gläser
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objectiveLeica11506242
HEPESGibco15630080
Human dermal fibroblastsLonzaCC-2511
Human primary keratocytesMERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine
Illustrator, Version 26.0.1Adobe
Laboratory ovenCarbolite
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigma-AldrichA8960
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225Leica Microsystems
Leonardo software, version 4.16Alvéole
Micro-manager, version 1.4.23Open imaging
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381mounting medium
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 DaLaysan BioMPEG-SVA-5000Concentration: 50 mg/mL
Negative glass moldFEMTOprint
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342)InvitrogenR376052 drops/mL
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140163
Petri dish (ø=100 mm)Greiner Bio-one664160
Phalloidin Atto 647NSigma65906Dilution: 1/250
Phosphate Buffered SalineSigmaP4417
Plasma asherEmitechK1050X
PLPP (photoinitiator)Alvéole
Poly-L-lysine, sterile-filteredSigma-AldrichP4707Concentration: 0.01%
PRIMOAlvéole
Rhodamine-labeled fibronectinCytoskeletn, Inc.FNR01Concentration: 10 µg/mL
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H)Molecular ProbesA21121Dilution: 1/300
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H)Molecular ProbesA21127Dilution: 1/300
Spin coaterLeurell Technologies Corporationmodel WS-650MZ-23NPPB
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDOW1673921
TCS SP8X confocal microscopeLeica Microsystems
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilaneABCRAB111444
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol redGibco12604013
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054

Referencias

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