Un método para estudiar la toxicidad y agregación de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizado

Resumen

Se requiere un modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína para estudiar y comprender la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Describimos un método para monitorear la citotoxicidad y la formación agregada de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizada.

Resumen

La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común y se caracteriza por la muerte celular progresiva causada por la formación de cuerpos de Lewy que contienen α-sinucleína mal plegada y agregada. La α-sinucleína es una proteína presináptica abundante que regula el tráfico de vesículas sinápticas, pero la acumulación de sus inclusiones proteicas resulta en neurotoxicidad. Estudios recientes han revelado que varios factores genéticos, incluidas las chaperonas bacterianas, podrían reducir la formación de agregados de α-sinucleína in vitro. Sin embargo, también es importante controlar el efecto antiagregación en la célula para aplicar esto como un tratamiento potencial para los pacientes. Sería ideal usar células neuronales, pero estas células son difíciles de manejar y tardan mucho tiempo en exhibir el fenotipo antiagregación. Por lo tanto, se requiere una herramienta in vivo rápida y eficaz para la evaluación adicional de la actividad antiagregación in vivo. El método descrito aquí se utilizó para monitorear y analizar el fenotipo antiagregación en la levadura humanizada Saccharomyces cerevisiae, que expresaba α-sinucleína humana. Este protocolo demuestra herramientas in vivo que podrían usarse para monitorear la toxicidad celular inducida por α-sinucleína, así como la formación de agregados de α-sinucleína en las células.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP) es un problema grave para las sociedades que envejecen en todo el mundo. La agregación de α-sinucleína está estrechamente asociada con la EP, y los agregados proteicos de α-sinucleína son ampliamente utilizados como biomarcador molecular para el diagnóstico de la enfermedad¹. α-sinucleína es una pequeña proteína ácida (140 aminoácidos de longitud) con tres dominios, a saber, la α-hélice de unión a lípidos N-terminal, el dominio central de unión a amiloide (NAC) y la cola ácida C-terminal². El plegamiento incorrecto de la α-sinucleína puede ocurrir espontáneamente y eventualmente conduce a la formación de agregados amiloides llamados cuerpos de Lewy³. α-sinucleína puede contribuir a la patogénesis de la EP de varias maneras. En general, se piensa que sus formas oligoméricas anormales y solubles llamadas protofibrillas son especies tóxicas que causan la muerte celular neuronal al afectar diversas dianas celulares, incluyendo la función sináptica³.

Los modelos biológicos utilizados para estudiar las enfermedades neurodegenerativas deben ser relevantes para los seres humanos con respecto a su genoma y biología celular. Los mejores modelos serían las líneas celulares neuronales humanas. Sin embargo, estas líneas celulares están asociadas a varios problemas técnicos, como dificultades en el mantenimiento de cultivos, baja eficiencia de la transfección y alto costo⁴. Por estas razones, se requiere una herramienta fácil y confiable para acelerar el progreso en esta área de investigación. Es importante destacar que la herramienta debe ser fácil de usar para analizar los datos recopilados. Desde estas perspectivas, varios organismos modelo han sido ampliamente utilizados, incluyendo Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, levadura y roedores⁵. Entre ellos, la levadura es el mejor organismo modelo porque la manipulación genética es fácil y es más barata que los otros organismos modelo. Lo más importante es que la levadura tiene altas similitudes con las células humanas, como un 60% de homología de secuencia con los ortólogos humanos y un 25% de homología cercana con los genes relacionados con enfermedades humanas⁶, y también comparten la biología fundamental de las células eucariotas. La levadura contiene muchas proteínas con secuencias similares y funciones análogas a las de las células humanas⁷. De hecho, la levadura que expresa genes humanos ha sido ampliamente utilizada como un sistema modelo para dilucidar los procesos celulares⁸. Esta cepa de levadura se llama levadura humanizada y es una herramienta útil para explorar la función de los genes humanos⁹. La levadura humanizada tiene mérito para estudiar las interacciones genéticas porque la manipulación genética está bien establecida en la levadura.

En este estudio, utilizamos la levadura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo para estudiar la patogénesis de la EP, particularmente para investigar la formación de agregados de α-sinucleína y la citotoxicidad¹⁰. Para la expresión de α-sinucleína en la levadura en ciernes, se utilizó la cepa W303a para la transformación con plásmidos que codifican para las variantes de tipo salvaje y familiares asociadas a la PD de la α-sinucleína. Como la cepa W303a tiene una mutación auxotrófica en URA3, es aplicable para la selección de células que contienen plásmidos con URA3. La expresión de α-sinucleína codificada en un plásmido está regulada bajo el promotor GAL1. Por lo tanto, el nivel de expresión de α-sinucleína puede ser controlado. Además, la fusión de la proteína verde fluorescente (GFP) en la región C-terminal de la α-sinucleína permite el monitoreo de la formación de focos de α-sinucleína. Para comprender las características de las variantes familiares asociadas a la EP de la α-sinucleína, también expresamos estas variantes en levaduras y examinamos sus efectos celulares. Este sistema es una herramienta sencilla para la detección de compuestos o genes que exhiben funciones protectoras contra la citotoxicidad de la α-sinucleína.

Protocolo

1. Preparación de medios y soluciones

1. Preparación de los medios
   1. Para preparar YPD medio, disolver 50 g de YPD polvo en_dH2Opara hacer un volumen final de 1 L. Autoclave para esterilización. Conservar a temperatura ambiente (RT).
   2. Para hacer medio de agar YPD, disolver 50 g de polvo YPD y 20 g de agar en 1 L de dH₂O. Autoclave para esterilización. Después de enfriar, vierta sobre placas de Petri. Conservar a 4 °C.
   3. Para hacer SC con rafinosa (SRd)-Ura media, disolver 6,7 g de levadura nitrógeno base con sulfato de amonio y sin aminoácidos en 795 mL de_dH2O. Autoclave para esterilización. Agregue 100 ml de rafinosa al 20%, 5 ml de glucosa al 20% y 100 ml de abandono 10x -Ura antes de usar.
   4. Para hacer medio de agar SD-Uura, disolver 6,7 g de levadura nitrogenada base con sulfato de amonio y sin aminoácidos y 20 g de agar en 800 mL de_dH2O. Autoclave en un matraz con un volumen superior a 2 L. Añadir 100 mL de glucosa al 20% y 100 mL de 10x-Ura de caída. Mezclar bien y verter sobre placas de Petri. Conservar a 4 °C.
   5. Para hacer SC con galactosa (SG)-Ura agar medio, disolver 6,7 g de levadura nitrogenada base con sulfato de amonio y sin aminoácidos y 20 g de agar en 800 mL de_dH2O. Autoclave en un matraz con un volumen superior a 2 L. Añadir 100 mL de galactosa al 20% y 100 mL de 10x-Ura de abandono. Mezclar bien y verter sobre placas de Petri. Conservar a 4 °C.
2. Soluciones de stock para usar con medios SD
   1. Para producir una fuente de carbono al 20% (glucosa, galactosa y rafinosa), disuelva 100 g de glucosa, galactosa o rafinosa en_dH2Opara hacer un volumen final de 500 ml. Autoclave y almacenar en RT.
   2. Para hacer 10x levadura sintética drop-out medium suplementos sin uracilo (10x-Ura drop-out), disolver 19,2 g de "levadura sintética drop-out medium supplements without uracil" en_dH2Opara hacer un volumen final de 1 L. Autoclave y almacenar en RT.
      NOTA: Para la preparación de un medio que contenga agar, añadir una barra de agitación magnética al matraz para mezclar bien todas las soluciones antes de verter sobre las placas de Petri.

2. Transformación de levadura

NOTA: El plásmido pRS426 se utilizó para clonar el gen de la α-sinucleína y contenía el gen URA3 como marcador seleccionable. Existen variantes familiares asociadas a la EP de la α-sinucleína que tienen fenotipos graves de la enfermedad (p. ej., citotoxicidad). Estas variantes también se utilizaron aquí para controlar su citotoxicidad y la formación de focos agregados. Utilice la misma colonia de transformadores de levadura para todos los experimentos para obtener resultados consistentes.

1. Para la transformación de los plásmidos de expresión de levadura, utilice un vector vacío (pRS426) como control y plásmidos que contienen α-sinucleína. Refiriéndose al método estándar de acetato de litio (LiAc)¹¹, prepare seis células competentes y 0,5 μg de cada plásmido, y realice la transformación.
2. Para seleccionar transformadores de levadura que contengan plásmidos, utilice el medio sintético definido (medio SD) sin uracilo (SD-Ura) e incube las placas a 30 °C durante 2-3 días.
3. Parche tres colonias individuales en una placa de agar SD-Ura para la selección de células que contienen plásmidos para experimentos posteriores.
   NOTA: Para generar resultados precisos y confiables, examinamos al menos tres réplicas biológicas por cepa.

3. Ensayo de manchado

NOTA: Se sabe que la expresión de α-sinucleína marcada con GFP en plásmidos de alto número de copias está asociada con citotoxicidad en levadura¹⁰.

1. Inocular los tres transformadores de levadura parcheados por cepa en 3 mL de SRd-Ura para el crecimiento selectivo de levaduras que contienen los plásmidos con rafinosa al 2% para la inhibición de la inducción de α-sinucleína bajo el promotor GAL1 y 0,1% de glucosa. Incubar el cultivo celular a 30 °C bajo agitación a 200 rpm.
   NOTA: Repetir todos los experimentos con diferentes colonias es importante. Obtener los mismos resultados de más de tres colonias independientes significa que el resultado es confiable.
2. Al día siguiente, inocular las células cultivadas durante la noche en 3 ml de SRd-Ura fresco a un OD 600 de 0,2, e incubar durante 6 h a 30 °C bajo agitación a₂₀₀ rpm.
3. Cuando el OD₆₀₀ alcance 0.6-0.8, diluya las células en placas de 96 pocillos para el ensayo de manchado de la siguiente manera.
   1. Mida el OD 600 de todas las muestras y diluya las muestras a un OD 600 de 0.5 con dH₂O estéril (el volumen mezclado es de₁₀₀ μL) en el carril 1 de una placa de 96 pocillos para igualar el número de células en cada cultivo.
   2. Realizar diluciones en serie quíntuples de las células de levadura añadiendo 160 μL de dH_2Oestéril a los siguientes cinco carriles. Asegúrese de un volumen total de 40 μL al diluir en serie las células en cada carril.
      NOTA: Los factores de dilución bajos pueden producir mayores diferencias entre las muestras. Se requiere un pipeteo suficiente para garantizar una mezcla uniforme al realizar las diluciones en serie. La punta de la pipeta debe reemplazarse en cada punto de dilución. De lo contrario, las células unidas a la superficie de la punta podrían transferirse al siguiente pocillo y afectar el número de células.
4. Utilice una pipeta multicanal para transferir 10 μL de cada pocillo para detectar las muestras en placas de agar SD-Ura para los controles y placas de agar SG-Ura para controlar la toxicidad.
   NOTA: Las placas deben secarse hasta que las muestras manchadas se absorban completamente en las placas.
5. Incubar las placas manchadas boca abajo a 30 °C durante 4 días.
6. Tome imágenes de las placas cada 24 h hasta el día 4, y luego analice los datos comparando las diferencias de crecimiento entre las cepas detectadas a ojo. Cuente las colonias individuales en la muestra más diluida, calcule el número de células viables en el cultivo original para cada cepa o compare el tamaño de las colonias individuales.

4. Medición del crecimiento de levadura utilizando un lector de microplacas

1. Inocular los tres transformadores de levadura parcheados por cepa en 3 ml de SRd-Ura, e incubar a 30 °C bajo agitación a 200 rpm durante la noche.
   NOTA: Para comprender cada fenotipo de colonia de la cepa de levadura humanizada que expresa α-sinucleína, use los mismos transformadores para todos los experimentos.
2. Al día siguiente, inocular las células cultivadas durante la noche en un total de 200 μL de SD-Ura y SG-Ura frescas en placas de 96 pocillos. Ajuste el volumen final, incluidas las células, a 200 μL, y ajuste la célula inicial OD₆₀₀ a 0,05.
   1. Ajuste la configuración del programa en la placa de microtitulación de la siguiente manera: ajuste la temperatura objetivo a 30 ° C, establezca la duración de agitación (lineal) en 890 s, establezca la amplitud de agitación (lineal) en 5 mm, establezca el tiempo de intervalo en 00:15:00 y establezca la medición como absorbancia en 600 nm.
   2. Incubar la placa durante 2-3 días para que todas las cepas alcancen la fase estacionaria en un lector de microplacas.
3. Analice los datos trazando la curva de crecimiento (por ejemplo, usando Workbook). Adquiera los puntos de datos promediando los valores de absorbancia de las tres réplicas biológicas e indique las barras de error. Utilice el valor de absorbancia de sólo medios como control, y reste esto de los valores de las celdas cultivadas (opcional).

5. Microscopía de fluorescencia

1. Inocular los transformadores de levadura parcheados en 3 ml de SRd-Ura, y cultivarlos durante la noche a 30 °C bajo agitación a 200 rpm.
   NOTA: Para determinar la correlación del fenotipo con la citotoxicidad y la formación de focos, utilice las mismas colonias para el experimento.
2. Al día siguiente, reinocular las células cultivadas durante la noche en 3 ml de SRd-Ura fresco a un OD_{600 de 0.003} . Incubar el cultivo hasta que el OD 600 alcance 0,2 a 30 °C bajo agitación a₂₀₀ rpm (~18 h).
3. Cuando se logre un OD 600 de 0.2, agregue 300 μL de galactosa al 20% y luego incubar durante otras 6 h a 30 °C bajo agitación a₂₀₀ rpm.
4. Recoger las células por centrifugación a 800 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante.
5. Resuspender suavemente el pellet celular en 30 μL de agua destilada.
6. Cargue 5 μL de las células resuspendidas en un vidrio deslizante. Prepare una almohadilla de gel de agarosa¹² y colóquela en las celdas cargadas para que se extienda uniformemente.
7. Realice imágenes microscópicas con un objetivo de 100x utilizando filtros de campo claro y de fluorescencia GFP.
   1. Primero, use campo claro para enfocar la celda con un objetivo de 100x usando aceite de inmersión. Utilice la opción de captura de pantalla para generar las imágenes utilizando el programa.
   2. Cambie a un filtro de fluorescencia GFP. Ajuste el tiempo de exposición de la imagen a entre 50 ms y 300 ms para lograr una imagen clara equilibrando la relación señal-ruido. Captura de pantalla la imagen usando el programa.
   3. Imagine muchas celdas de varios puntos en lugar de solo uno.
8. Analice las imágenes contando el porcentaje de células que contienen focos de agregados de α-sinucleína utilizando un software analítico. Observe las diferencias entre la señal de proteína GFP soluble y la señal GFP formada por focos, así como la difusión de GFP con la forma variante A30P de α-sinucleína.
   NOTA: La formación de focos se observará con las variantes de tipo salvaje, E46K y A53T de la α-sinucleína.

Resultados

Se sabe que la alta expresión de α-sinucleína está relacionada con la muerte celular neuronal y la EP en sistemas modelo de EP. Este estudio describe tres métodos para monitorear la citotoxicidad de la α-sinucleína y la formación de focos de α-sinucleína agregada en la levadura. Aquí, la α-sinucleína se sobreexpresó en levaduras, y se examinaron los fenotipos de α-sinucleína de tipo salvaje y tres variantes de α-sinucleína conocidas como mutantes familiares de la EP (Figura 1

Discusión

Dada la complejidad de varios sistemas celulares en humanos, es ventajoso utilizar la levadura como modelo para estudiar las enfermedades neurodegenerativas humanas. Aunque es casi imposible investigar las complejas interacciones celulares del cerebro humano utilizando levadura, desde una perspectiva unicelular, las células de levadura tienen un alto nivel de similitud con las células humanas en términos de homología de secuencia genómica y procesos celulares eucariotas fundamentales ^8,1...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00