인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

요약

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

초록

파킨슨 병은 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 질환이며 잘못 접히고 응집 된 α- 시누 클레인을 포함하는 Lewy 체의 형성으로 인한 진행성 세포 사멸을 특징으로합니다. α-시누클레인은 시냅스 소포 트래피킹을 조절하는 풍부한 시냅스 전 단백질이지만 단백질성 개재물의 축적은 신경독성을 초래합니다. 최근 연구에 따르면 박테리아 샤페론을 포함한 다양한 유전적 요인이 시험관 내에서 α-시누클레인 응집체의 형성을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌습니다. 그러나, 이를 환자에 대한 잠재적인 치료법으로 적용하기 위해 세포에서 항응집 효과를 모니터링하는 것도 중요하다. 신경 세포를 사용하는 것이 이상적이지만 이러한 세포는 다루기가 어렵고 응집 방지 표현형을 나타내는 데 오랜 시간이 걸립니다. 따라서, 생체내 항응집 활성의 추가 평가를 위해 신속하고 효과적인 생체내 도구가 필요하다. 여기에 설명된 방법은 인간 α-시누클레인을 발현하는 인간화 효모 사카로마이세스 세레비시아에에서 항응집 표현형을 모니터링하고 분석하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 α-시누클레인 유도 세포 독성과 세포에서 α-시누클레인 응집체 형성을 모니터링하는 데 사용할 수 있는 생체 내 도구를 보여줍니다.

서문

파킨슨병(PD)은 전 세계적으로 고령화 사회에 심각한 문제입니다. α-시누클레인의 응집은 PD와 밀접한 관련이 있으며, α-시누클레인의 단백질 응집체는 질병^진단을 위한 분자 바이오마커로 널리 사용됩니다1. α- synuclein은 3 개의 도메인, 즉 N 말단 지질 결합 α- 나선, 아밀로이드 결합 중심 도메인 (NAC) 및 C- 말단 산성 꼬리²를 갖는 작은 산성 단백질 (길이 140 아미노산)이다. α-synuclein의 잘못 접힘은 자발적으로 발생할 수 있으며 결국 Lewy^body3라고하는 아밀로이드 응집체의 형성으로 이어집니다. α-시누클레인은 여러 면에서 PD의 발병기전에 기여할 수 있다. 일반적으로, 프로토피브릴이라고 하는 그의 비정상적이고 용해성 올리고머 형태는 시냅스 기능³을 포함한 다양한 세포 표적에 영향을 주어 신경 세포 사멸을 유발하는 독성 종으로 생각된다.

신경 퇴행성 질환을 연구하는 데 사용되는 생물학적 모델은 게놈 및 세포 생물학과 관련하여 인간과 관련이 있어야합니다. 가장 좋은 모델은 인간 신경 세포주입니다. 그러나, 이들 세포주는 배양물의 유지의 어려움, 형질감염의 낮은 효율, 및 높은 비용^{4과 같은} 몇몇 기술적 문제와 연관된다. 이러한 이유로이 연구 분야의 진행을 가속화하려면 쉽고 신뢰할 수있는 도구가 필요합니다. 중요한 것은 이 도구가 수집된 데이터를 분석하는 데 사용하기 쉬워야 한다는 것입니다. 이러한 관점에서, 초파리, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, 효모 및 설치류⁵를 포함한 다양한 모델 유기체가 널리 사용되었습니다. 그 중에서도 효모는 유전자 조작이 쉽고 다른 모델 유기체보다 저렴하기 때문에 최고의 모델 유기체입니다. 가장 중요한 것은 효모가 인간 ortholog에 대한 60% 서열 상동성 및 인간 질병 관련 유전자6와 25% 밀접한 상동성과 같이 인간 세포와 높은 유사성을 가지며 근본적인 진핵 세포 생물학도 공유한다는 것입니다. 효모는 인간 세포와 유사한 서열 및 유사한 기능을 가진 많은 단백질을 함유하고 있습니다⁷. 실제로, 인간 유전자를 발현하는 효모는^{세포 과정을 해}명하기 위한 모델 시스템으로서 널리 사용되어 왔다8. 이 효모 균주는 인간화 효모라고 불리며 인간 유전자의 기능을 탐구하는 데 유용한 도구입니다⁹. 인간화 효모는 유전자 조작이 효모에서 잘 확립되어 있기 때문에 유전적 상호 작용을 연구하는 데 장점이 있습니다.

이 연구에서는 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애를 PD의 발병 기전을 연구하기위한 모델 유기체로 사용했으며, 특히 α- 시누 클레인 응집체 형성 및 세포 독성을 조사했습니다¹⁰. 출아 효모에서 α-시누클레인의 발현을 위해, W303a 균주를 α-시누클레인의 야생형 및 가족성 PD-관련 변이체를 암호화하는 플라스미드로 형질전환에 사용하였다. W303a 균주는 URA3에 영양요구성 돌연변이가 있기 때문에 URA3가 있는 플라스미드를 포함하는 세포의 선택에 적용할 수 있습니다. 플라스미드에서 암호화된 α-시누클레인의 발현은 GAL1 프로모터 하에서 조절된다. 따라서, α-시누클레인의 발현 수준을 조절할 수 있다. 또한, α- 시누 클레인의 C- 말단 영역에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 융합은 α- 시누 클레인 초점 형성의 모니터링을 가능하게한다. α-synuclein의 가족성 PD 관련 변이체의 특성을 이해하기 위해, 우리는 또한 효모에서 이러한 변이체를 발현하고 그들의 세포 효과를 조사하였다. 이 시스템은 α-시누클레인의 세포독성에 대한 보호 역할을 나타내는 화합물 또는 유전자를 스크리닝하기 위한 간단한 도구입니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

1. 매체 및 용액 준비

1. 미디어 준비
   1. YPD 배지를 제조하기 위해, 50 g의 YPD 분말을_dH2O에 용해시켜 1 L의 최종 부피를 만든다. 실온(RT)에서 보관하십시오.
   2. YPD 한천 배지를 만들려면 YPD 분말 50g과 한천 20g을 dH_2O. 오토 클레이브 1L에 녹여 멸균하십시오. 식힌 후 페트리 접시에 붓습니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   3. 라피노스 (SRd) -Ura 배지로 SC를 만들려면 효모 질소 염기 6.7g을 황산 암모늄과 아미노산없이 dH₂O 795mL에 녹입니다. 사용하기 전에 20% 라피노스 100mL, 20% 포도당 5mL, 10x -Ura 드롭아웃 100mL를 추가합니다.
   4. SD-Ura 한천 배지를 만들기 위해, 효모 질소 염기 6.7g을 황산 암모늄과 아미노산 및 한천 20g을 800mL의 dH 2O에 녹인다. 2L 이상의 부피를 갖는 플라스크에 오토 클레이브.₂₀% 포도당 100mL와 10x -Ura 드롭 아웃 100mL를 첨가한다. 잘 섞어 페트리 접시에 붓습니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   5. 갈락토오스 (SG)-우라 한천 배지로 SC를 만들려면 효모 질소 염기 6.7g을 황산 암모늄과 아미노산이 없는 효모 질소 염기 20g을 dH 2O 800mL에 녹입니다._2L이상의 부피를 가진 플라스크에 오토클레이브. 20% 갈락토오스 100mL와 10x -Ura 드롭아웃 100mL를 추가합니다. 잘 섞고 페트리 접시에 붓는다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. SD 미디어와 함께 사용할 스톡 솔루션
   1. 20% 탄소원(포도당, 갈락토오스, 라피노스)을 만들기 위해 포도당, 갈락토오스 또는 라피노스 100g을_dH2O에 녹여 최종 부피 500mL를 만듭니다. 오토 클레이브 및 RT에 보관하십시오.
   2. 우라실이없는 10x 효모 합성 드롭 아웃 배지 보충제 (10x-Ura 드롭 아웃)를 만들려면 dH₂O에 19.2g의 "우라실이없는 효모 합성 드롭 아웃 배지 보충제"를 녹여 최종 부피 1L. 오토 클레이브를 만들고 RT에 보관하십시오.
      알림: 한천이 포함된 배지를 준비하려면 플라스크에 자석 교반 막대를 추가하여 페트리 접시에 붓기 전에 모든 용액을 잘 혼합합니다.

2. 효모 변형

참고: pRS426 플라스미드는 α-시누클레인 유전자를 클로닝하는 데 사용되었으며 선택 가능한 마커로서 URA3 유전자를 포함했습니다. 심각한 질병 표현형 (예를 들어, 세포 독성)을 갖는 α- 시누 클레인의 가족 성 PD 관련 변이체가 있습니다. 이들 변이체는 또한 그들의 세포독성 및 응집된 초점 형성을 모니터링하기 위해 여기에서 사용되었다. 일관된 결과를 얻으려면 모든 실험에 동일한 효모 형질전환체 콜로니를 사용합니다.

1. 효모 발현 플라스미드의 형질전환을 위해, 빈 벡터(pRS426)를 대조군으로 사용하고 α-시누클레인-함유 플라스미드를 사용한다. 표준아세트산리튬(LiAc) 방법¹¹을 참조하여, 6개의 적격 세포를 준비하고, 각 플라스미드 0.5 μg을 제조하고, 형질전환을 수행한다.
2. 플라스미드를 함유하는 효모 형질전환체를 선택하려면, 우라실(SD-Ura)이 없는 합성 정의 배지(SD 배지)를 사용하고, 플레이트를 30°C에서 2-3일 동안 인큐베이션한다.
3. 추가 실험을 위해 플라스미드를 포함하는 세포를 선택하기 위해 SD-Ura 한천 플레이트에 3개의 단일 콜로니를 패치합니다.
   참고 : 정확하고 신뢰할 수있는 결과를 생성하기 위해 균주 당 최소 3 개의 생물학적 복제를 조사했습니다.

3. 스포팅 분석

참고: 높은 복제 수 플라스미드에서 GFP 태그가 부착된 α-시누클레인의 발현은 효모¹⁰의 세포독성과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다.

1. 플라스미드를 함유하는 효모의 선택적 성장을 위해 균주 당 3개의 패치된 효모 형질전환체를 GAL1 프로모터 및 0.1% 글루코스 하에서 α-시누클레인의 유도를 억제하기 위한 2% 라피노스로 3mL의 SRd-Ura에 접종한다. 세포 배양물을 200 rpm에서 교반 하에 30°C에서 배양한다.
   참고: 다른 콜로니로 모든 실험을 반복하는 것이 중요합니다. 3개 이상의 독립적인 식민지에서 동일한 결과를 얻는다는 것은 결과가 신뢰할 수 있음을 의미합니다.
2. 다음날, 밤새 배양된 세포를 0.2의_OD600 에 3 mL의 신선한 SRd-Ura에 접종하고, 200 rpm에서 교반 하에 30°C에서 6 h 동안 배양하였다.
3. OD₆₀₀ 이 0.6-0.8에 도달하면 다음과 같이 스포팅 분석을 위해 96웰 플레이트에서 세포를 희석합니다.
   1. 모든 샘플의 OD600을 측정하고, 샘플을 96-웰 플레이트의 레인 1에서 멸균_dH2O(혼합 부피는 100μL)로 0.5의_OD600으로 희석하여 각 배양물에서 세포의 수를 균등화한다.
   2. 다음 5개 레인에 160μL의 멸균_dH2O를 첨가하여 효모 세포의 5배 연속 희석을 수행한다. 각 레인에서 세포를 연속 희석할 때 총 부피가 40μL인지 확인하십시오.
      참고: 낮은 희석 계수는 샘플 간에 더 큰 차이를 생성할 수 있습니다. 연속 희석을 수행할 때 균일한 혼합을 보장하기 위해 충분한 피펫팅이 필요합니다. 피펫 팁은 모든 희석 지점에서 교체해야 합니다. 그렇지 않으면 팁 표면에 부착 된 세포가 다음 웰로 옮겨져 세포 번호에 영향을 줄 수 있습니다.
4. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 10μL를 옮겨 대조군을 위한 SD-Ura 한천 플레이트에서 샘플을 발견하고 SG-Ura 한천 플레이트에서 샘플을 추출하여 독성을 모니터링합니다.
   알림: 발견 된 샘플이 플레이트에 완전히 흡수 될 때까지 플레이트를 건조시켜야합니다.
5. 점박이 플레이트를 30°C에서 거꾸로 4일 동안 배양합니다.
6. 4일째까지 24시간마다 플레이트의 이미지를 촬영한 다음 눈으로 발견한 균주 간의 성장 차이를 비교하여 데이터를 분석합니다. 가장 희석된 샘플의 개별 콜로니를 계산하거나, 각 균주에 대한 원래 배양에서 생존 가능한 세포의 수를 계산하거나, 단일 콜로니의 크기를 비교합니다.

4. 마이크로플레이트 리더를 이용한 효모 성장 측정

1. 균주 당 3개의 패치된 효모 형질전환체를 3mL의 SRd-Ura에 접종하고, 200rpm의 교반 하에 30°C에서 밤새 배양한다.
   참고: α-시누클레인을 발현하는 인간화 효모 균주의 각 콜로니 표현형을 이해하려면 모든 실험에 동일한 형질전환체를 사용하십시오.
2. 다음날, 밤새 배양된 세포를 총 200μL의 신선한 SD-Ura와 SG-Ura를 96웰 플레이트에 접종합니다. 세포를 포함한 최종 부피를 200 μL로 조정하고, 초기 세포_OD600 을 0.05로 조정한다.
   1. 목표 온도를 30 ° C로 설정하고, 흔들림 (선형) 지속 시간을 890 초로 설정하고, 흔들림 (선형) 진폭을 5mm로 설정하고, 간격 시간을 00:15:00으로 설정하고, 측정을 600nm에서 흡광도로 설정합니다.
   2. 모든 균주가 마이크로플레이트 리더에서 고정상에 도달하기 위해 플레이트를 2-3일 동안 배양합니다.
3. 성장 곡선을 플로팅하여 데이터를 분석합니다(예: Workbook 사용). 세 가지 생물학적 반복실험에서 흡광도 값을 평균화하여 데이터 포인트를 수집하고 오차 막대를 나타냅니다. 배지의 흡광도 값만 대조군으로 사용하고 배양된 세포의 값에서 이 값을 뺍니다(선택 사항).

5. 형광 현미경

1. 패치된 효모 형질전환체를 3mL의 SRd-Ura에 접종하고, 200rpm으로 교반 하에 30°C에서 밤새 배양한다.
   참고 : 표현형과 세포 독성 및 초점 형성의 상관 관계를 확인하려면 실험에 동일한 콜로니를 사용하십시오.
2. 다음날, 밤새 배양된 세포를 3mL의 신선한 SRd-Ura에 0.003의_OD600 이 되도록 재접종합니다. OD₆₀₀ 이 200 rpm (~ 18 h)의 교반하에 30 ° C에서 0.2에 도달 할 때까지 배양물을 배양합니다.
3. 0.2의 OD600이 달성되면, 20% 갈락토스 300μL를 첨가하고,_200rpm 에서 교반 하에 30°C에서 6시간 더 배양한다.
4. 세포를 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 수집하고, 상청액을 버린다.
5. 30μL의 증류수에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
6. 재현탁된 세포 5μL를 슬라이드 글라스에 로드합니다. 아가로스 겔 패드(¹² )를 준비하고, 로딩된 세포 위에 올려 고르게 퍼지도록 한다.
7. 명시야 및 GFP 형광 필터를 모두 사용하여 100x 대물렌즈로 현미경 이미징을 수행합니다.
   1. 먼저 명시야를 사용하여 이멀젼 오일을 사용하여 100x 대물렌즈로 셀에 초점을 맞춥니다. 프로그램을 사용하여 이미지를 생성하기위한 화면 캡처 옵션을 사용하십시오.
   2. GFP 형광 필터로 전환합니다. 이미지 노출 시간을 50ms에서 300ms 사이로 조정하여 신호 대 잡음비의 균형을 조정하여 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 프로그램을 사용하여 이미지를 화면 캡처합니다.
   3. 하나가 아닌 여러 지점에서 많은 셀을 이미지화합니다.
8. 분석 소프트웨어를 사용하여 α-시누클레인 응집체의 초점을 포함하는 세포의 백분율을 계산하여 이미지를 분석합니다. 가용성 GFP 단백질 신호와 초점 형성 GFP 신호 간의 차이와 A30P 변이체 형태의 α-시누클레인으로 GFP의 확산을 관찰합니다.
   참고: 초점 형성은 α-시누클레인의 야생형, E46K 및 A53T 변이체에서 관찰됩니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

α-시누클레인의 높은 발현은 PD의 모델 시스템에서 신경 세포 사멸 및 PD와 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 연구는 α- 시누 클레인의 세포 독성과 효모에서 응집 된 α- 시누 클레인의 초점 형성을 모니터링하는 세 가지 방법을 설명합니다. 여기에서는 효모에서 α-시누클레인이 과발현되었고, 야생형 α-시누클레인의 표현형과 PD의 가족성 돌연변이체로 알려진 α-시누클레인의 3가지 변이?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

인간의 다양한 세포 시스템의 복잡성을 감안할 때, 인간 신경 퇴행성 질환을 연구하기위한 모델로서 효모를 사용하는 것이 유리하다. 효모를 사용하여 인간 뇌의 복잡한 세포 상호 작용을 조사하는 것은 거의 불가능하지만, 단일 세포 관점에서 효모 세포는 게놈 서열 상 동성 및 근본적인 진핵 세포 과정 ^8,13 측면에서 인간 세포와 높은 수준의 유사성을...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00