Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Zusammenfassung

Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Zusammenfassung

Die Parkinson-Krankheit ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung und ist gekennzeichnet durch einen fortschreitenden Zelltod, der durch die Bildung von Lewy-Körperchen verursacht wird, die fehlgefaltetes und aggregiertes α-Synuclein enthalten. α-Synuclein ist ein reichlich vorhandenes präsynaptisches Protein, das den synaptischen Vesikeltransport reguliert, aber die Anhäufung seiner proteinartigen Einschlüsse führt zu Neurotoxizität. Neuere Studien haben gezeigt, dass verschiedene genetische Faktoren, einschließlich bakterieller Chaperone, die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in vitro reduzieren könnten. Es ist jedoch auch wichtig, den Anti-Aggregationseffekt in der Zelle zu überwachen, um dies als mögliche Behandlung für die Patienten anzuwenden. Es wäre ideal, neuronale Zellen zu verwenden, aber diese Zellen sind schwer zu handhaben und brauchen lange, um den Anti-Aggregations-Phänotyp zu zeigen. Daher ist ein schnelles und effektives In-vivo-Tool für die weitere Bewertung der In-vivo-Antiaggregationsaktivität erforderlich. Die hier beschriebene Methode wurde verwendet, um den Anti-Aggregationsphänotyp in der humanisierten Hefe Saccharomyces cerevisiae zu überwachen und zu analysieren, der humanes α-Synuclein exprimierte. Dieses Protokoll demonstriert In-vivo-Werkzeuge, die zur Überwachung der α-Synuclein-induzierten zellulären Toxizität sowie der Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in Zellen verwendet werden könnten.

Einleitung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist ein ernstes Problem für alternde Gesellschaften weltweit. Die Aggregation von α-Synuclein ist eng mit Parkinson verbunden, und Proteinaggregate von α-Synuclein werden häufig als molekularer Biomarker für die Diagnose der Krankheit verwendet¹. α-Synuclein ist ein kleines saures Protein (140 Aminosäuren lang) mit drei Domänen, nämlich der N-terminalen Lipid-bindenden α-Helix, der Amyloid-bindenden zentralen Domäne (NAC) und dem C-terminalen sauren Schwanz². Die Fehlfaltung von α-Synuclein kann spontan auftreten und führt schließlich zur Bildung von Amyloid-Aggregaten, die als Lewy-Körper³ bezeichnet werden. α-Synuclein kann auf verschiedene Weise zur Pathogenese der Parkinson-Krankheit beitragen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass seine abnormalen, löslichen oligomeren Formen, die Protofibrillen genannt werden, toxische Spezies sind, die den neuronalen Zelltod verursachen, indem sie verschiedene zelluläre Ziele, einschließlich der synaptischen Funktion³, beeinflussen.

Die biologischen Modelle, mit denen neurodegenerative Erkrankungen untersucht werden, müssen für den Menschen in Bezug auf sein Genom und seine Zellbiologie relevant sein. Die besten Modelle wären menschliche neuronale Zelllinien. Diese Zelllinien sind jedoch mit mehreren technischen Problemen verbunden, wie z. B. Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung von Kulturen, geringer Effizienz der Transfektion und hohen Kosten⁴. Aus diesen Gründen ist ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug erforderlich, um den Fortschritt in diesem Forschungsbereich zu beschleunigen. Wichtig ist, dass das Tool für die Analyse der gesammelten Daten einfach zu bedienen ist. Aus dieser Perspektive wurden verschiedene Modellorganismen weit verbreitet, darunter Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, Hefe und Nagetiere⁵. Unter ihnen ist Hefe der beste Modellorganismus, weil genetische Manipulation einfach und billiger ist als die anderen Modellorganismen. Am wichtigsten ist, dass Hefe hohe Ähnlichkeiten mit menschlichen Zellen aufweist, wie z.B. 60% Sequenzhomologie zu menschlichen Orthologen und 25% enge Homologie mit menschlichen krankheitsbezogenen Genen⁶, und sie teilen auch eine grundlegende eukaryotische Zellbiologie. Hefe enthält viele Proteine mit ähnlichen Sequenzen und ähnlichen Funktionen wie in menschlichen Zellen⁷. In der Tat wurde Hefe, die menschliche Gene exprimiert, häufig als Modellsystem zur Aufklärung zellulärer Prozesse verwendet⁸. Dieser Hefestamm wird als humanisierte Hefe bezeichnet und ist ein nützliches Werkzeug, um die Funktion menschlicher Gene zu erforschen⁹. Humanisierte Hefe hat Vorteile für die Untersuchung genetischer Interaktionen, da die genetische Manipulation in Hefe gut etabliert ist.

In dieser Studie haben wir die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus verwendet, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen, insbesondere um die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten und die Zytotoxizität zu untersuchen¹⁰. Für die Expression von α-Synuclein in der Knospungshefe wurde der W303a-Stamm zur Transformation mit Plasmiden verwendet, die für die Wildtyp- und familiären PD-assoziierten Varianten von α-Synuclein kodieren. Da der W303a-Stamm eine auxotrophe Mutation auf URA3 aufweist, ist er für die Selektion von Zellen geeignet, die Plasmide mit URA3 enthalten. Die Expression von α-Synuclein, das in einem Plasmid kodiert ist, wird unter dem GAL1-Promotor reguliert. So kann das Expressionsniveau von α-Synuclein gesteuert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Fusion von grün fluoreszierendem Protein (GFP) an der C-terminalen Region von α-Synuclein die Überwachung der Bildung von α-Synuclein-Herden. Um die Eigenschaften der familiären PD-assoziierten Varianten von α-Synuclein zu verstehen, haben wir diese Varianten auch in Hefe exprimiert und ihre zellulären Wirkungen untersucht. Dieses System ist ein einfaches Werkzeug für das Screening von Verbindungen oder Genen, die eine schützende Rolle gegen die Zytotoxizität von α-Synuclein spielen.

Protokoll

1. Aufbereitung von Medien und Lösungen

1. Medienaufbereitung
   1. Zur Herstellung des YPD-Mediums werden 50 g YPD-Pulver in dH₂O gelöst, um ein Endvolumen von 1 L zu erhalten. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.
   2. Um YPD-Agarmedium herzustellen, lösen Sie 50 g YPD-Pulver und 20 g Agar in 1 L dH₂O. Autoklav zur Sterilisation. Nach dem Abkühlen auf Petrischalen gießen. Bei 4 °C lagern.
   3. Zur Herstellung von SC mit Raffinose (SRd)-Ura-Medium werden 6,7 g Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat und ohne Aminosäuren in 795 ml_dH2O. Autoklav zur Sterilisation gelöst. Fügen Sie vor Gebrauch 100 ml 20% Raffinose, 5 ml 20% Glukose und 100 ml 10x -Ura-Drop-out hinzu.
   4. Zur Herstellung von SD-Ura-Agarmedium werden 6,7 g Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat und ohne Aminosäuren und 20 g Agar in 800 ml_dH2O. Autoklav in einem Kolben mit einem Volumen von über 2 l auflösen. Gut verrühren und auf Petrischalen gießen. Bei 4 °C lagern.
   5. Zur Herstellung von SC mit Galactose (SG)-Ura-Agarmedium werden 6,7 g Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat und ohne Aminosäuren und 20 g Agar in 800 ml_dH2O. Autoklav in einem Kolben mit einem Volumen von über 2 l gelöst. 100 ml 20% Galaktose und 100 ml 10x -Ura-Drop-out hinzufügen. Gut vermischen und mit Petrischalen übergießen. Bei 4 °C lagern.
2. Standardlösungen für die Verwendung mit SD-Medien
   1. Um eine 20% ige Kohlenstoffquelle (Glukose, Galaktose und Raffinose) herzustellen, lösen Sie 100 g Glukose, Galaktose oder Raffinose in dH₂O auf, um ein Endvolumen von 500 ml zu erhalten. Autoklav und Lagerung bei RT.
   2. Um 10x Hefe synthetische Drop-out-Medium-Ergänzungen ohne Uracil (10x-Ura-Drop-out) herzustellen, lösen Sie 19,2 g "Hefe-synthetische Drop-out-Medium-Ergänzungen ohne Uracil" in dH_2Oauf, um ein Endvolumen von 1 L zu erhalten.
      HINWEIS: Für die Zubereitung eines agarhaltigen Mediums fügen Sie einen magnetischen Rührstab in den Kolben ein, um alle Lösungen gut zu mischen, bevor Sie sie auf Petrischalen gießen.

2. Hefe-Umwandlung

HINWEIS: Das pRS426-Plasmid wurde verwendet, um das α-Synuclein-Gen zu klonen und enthielt das URA3-Gen als selektierbaren Marker. Es gibt familiäre PD-assoziierte Varianten von α-Synuclein, die schwere Krankheitsphänotypen (z. B. Zytotoxizität) aufweisen. Diese Varianten wurden auch hier verwendet, um ihre Zytotoxizität und aggregierte Herdenbildung zu überwachen. Verwenden Sie die gleiche Kolonie von Hefetransformanten für alle Experimente, um konsistente Ergebnisse zu erhalten.

1. Für die Transformation der Hefeexpressionsplasmide ist ein leerer Vektor (pRS426) als Kontroll- und α-Synuclein-haltige Plasmide zu verwenden. Unter Bezugnahme auf die Standardmethode Lithiumacetat (LiAc)¹¹ werden sechs kompetente Zellen und 0,5 μg jedes Plasmids hergestellt und die Transformation durchgeführt.
2. Um Hefetransformatoren auszuwählen, die Plasmide enthalten, verwenden Sie das synthetisch definierte Medium (SD-Medium) ohne Uracil (SD-Ura) und inkubieren Sie die Platten bei 30 °C für 2-3 Tage.
3. Patchen Sie drei einzelne Kolonien auf eine SD-Ura-Agarplatte für die Auswahl von Zellen, die Plasmide für weitere Experimente enthalten.
   HINWEIS: Um genaue und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, haben wir mindestens drei biologische Replikate pro Stamm untersucht.

3. Spotting-Test

ANMERKUNG: Es ist bekannt, dass die Expression von GFP-markiertem α-Synuclein in Plasmiden mit hoher Kopienzahl mit Zytotoxizität in Hefe¹⁰ assoziiert ist.

1. Die drei gepatchten Hefetransformatoren pro Stamm werden in 3 ml SRd-Ura für das selektive Wachstum von Hefe geimpft, die die Plasmide mit 2% Raffinose zur Hemmung der Induktion von α-Synuclein unter dem GAL1-Promotor und 0,1% Glukose enthält. Die Zellkultur wird bei 30 °C unter Rühren bei 200 U/min inkubiert.
   HINWEIS: Es ist wichtig, alle Experimente mit verschiedenen Kolonien zu wiederholen. Wenn Sie die gleichen Ergebnisse von mehr als drei unabhängigen Kolonien erhalten, bedeutet dies, dass das Ergebnis zuverlässig ist.
2. Am nächsten Tag werden die über Nacht kultivierten Zellen in 3 ml frisches SRd-Ura auf einen OD 600 von 0,2 beimpft und 6 h bei 30 °C unter Rühren bei₂₀₀ U/min inkubiert.
3. Wenn der OD₆₀₀ 0,6-0,8 erreicht, verdünnen Sie die Zellen in 96-Well-Platten für den Spotting-Assay wie folgt.
   1. Messen Sie den OD 600 aller Proben und verdünnen Sie die Proben auf einen OD 600 von 0,5 mit sterilem_dH2O(das gemischte Volumen beträgt₁₀₀ μL) in Spur 1 einer 96-Well-Platte, um die Anzahl der Zellen in jeder Kultur auszugleichen.
   2. Führen Sie fünffache serielle Verdünnungen der Hefezellen durch, indem Sie 160 μL steriles_dH2Oin die nächsten fünf Bahnen geben. Stellen Sie ein Gesamtvolumen von 40 μL sicher, wenn Sie die Zellen in jeder Spur seriell verdünnen.
      HINWEIS: Niedrige Verdünnungsfaktoren können zu größeren Unterschieden zwischen den Proben führen. Ein ausreichendes Pipettieren ist erforderlich, um eine gleichmäßige Durchmischung bei der Durchführung der seriellen Verdünnungen zu gewährleisten. Die Pipettenspitze sollte an jeder Verdünnungsstelle ausgetauscht werden. Andernfalls könnten die Zellen, die an der Oberfläche der Spitze befestigt sind, in die nächste Vertiefung übertragen werden und die Zellzahl beeinflussen.
4. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 μL aus jeder Vertiefung zu übertragen, um die Proben auf SD-Ura-Agarplatten für die Kontrollen und SG-Ura-Agarplatten zur Überwachung der Toxizität zu erkennen.
   HINWEIS: Die Platten sollten getrocknet werden, bis die gefleckten Proben vollständig auf den Platten absorbiert sind.
5. Die gefleckten Platten kopfüber bei 30 °C 4 Tage lang bebrüten.
6. Nehmen Sie alle 24 Stunden bis zum 4. Tag Bilder von den Platten auf und analysieren Sie dann die Daten, indem Sie die Wachstumsunterschiede zwischen den mit dem Auge entdeckten Stämmen vergleichen. Zählen Sie die einzelnen Kolonien in der am stärksten verdünnten Probe, berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der ursprünglichen Kultur für jeden Stamm oder vergleichen Sie die Größe der einzelnen Kolonien.

4. Messung des Hefewachstums mit einem Mikrotiterplatten-Reader

1. Die drei geflickten Hefetransformatoren pro Stamm werden in 3 ml SRd-Ura geimpft und bei 30 °C unter Rühren bei 200 U/min über Nacht inkubiert.
   HINWEIS: Um jeden Koloniephänotyp des humanisierten Hefestamms, der α-Synuclein exprimiert, zu verstehen, verwenden Sie für alle Experimente die gleichen Transformanten.
2. Am nächsten Tag impfen Sie die über Nacht kultivierten Zellen in insgesamt 200 μL frisches SD-Ura und SG-Ura in 96-Well-Platten. Stellen Sie das Endvolumen, einschließlich der Zellen, auf 200 μL und die Anfangszelle OD₆₀₀ auf 0,05 ein.
   1. Stellen Sie die Programmeinstellungen in der Mikrotiterplatte wie folgt ein: Stellen Sie die Zieltemperatur auf 30 ° C ein, stellen Sie die Schütteldauer (Linear) auf 890 s ein, stellen Sie die Schüttelamplitude (Linear) auf 5 mm ein, stellen Sie die Intervallzeit auf 00:15:00 ein und stellen Sie die Messung als Absorption bei 600 nm ein.
   2. Inkubieren Sie die Platte für 2-3 Tage, damit alle Stämme die stationäre Phase in einem Mikroplatten-Reader erreichen.
3. Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Wachstumskurve zeichnen (z. B. mit der Arbeitsmappe). Erfassen Sie die Datenpunkte, indem Sie die Extinktionswerte aus den drei biologischen Replikaten mittelen, und geben Sie die Fehlerbalken an. Verwenden Sie den Wert der Absorption nur von Medien als Kontrolle, und subtrahieren Sie diesen von den Werten von kultivierten Zellen (optional).

5. Fluoreszenzmikroskopie

1. Die geflickten Hefetransformatoren werden in 3 ml SRd-Ura geimpft und über Nacht bei 30 °C unter Rühren bei 200 U/min kultiviert.
   HINWEIS: Um die Korrelation des Phänotyps mit der Zytotoxizität und der Herdenbildung zu bestimmen, verwenden Sie die gleichen Kolonien für das Experiment.
2. Am nächsten Tag reinokulieren Sie die über Nacht kultivierten Zellen in 3 ml frisches SRd-Ura bis zu einem OD₆₀₀ von 0,003. Inkubieren Sie die Kultur, bis der OD 600 bei 30 °C unter Rühren bei₂₀₀ U/min (~18 h) 0,2 erreicht.
3. Wenn ein OD 600 von 0,2 erreicht ist, werden 300 μl 20%ige Galaktose zugegeben und dann weitere 6 h bei 30 °C unter Rühren bei₂₀₀ U/min inkubiert.
4. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 800 x g für 5 min gesammelt und der Überstand verworfen.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 30 μL destilliertem Wasser.
6. Laden Sie 5 μL der resuspendierten Zellen auf ein Objektträgerglas. Bereiten Sie ein Agarose-Gel-Pad¹² vor und legen Sie es auf die geladenen Zellen, damit es sich gleichmäßig verteilt.
7. Führen Sie mikroskopische Aufnahmen mit einem 100-fachen Objektiv durch, wobei sowohl Hellfeld- als auch GFP-Fluoreszenzfilter verwendet werden.
   1. Verwenden Sie zunächst das Hellfeld, um die Zelle mit einem 100-fachen Objektiv mit Immersionsöl zu fokussieren. Verwenden Sie die Screen-Capture-Option , um die Bilder mit dem Programm zu generieren.
   2. Wechseln Sie zu einem GFP-Fluoreszenzfilter. Stellen Sie die Belichtungszeit zwischen 50 ms und 300 ms ein, um ein klares Bild zu erzielen, indem Sie das Signal-Rausch-Verhältnis ausgleichen. Machen Sie eine Bildschirmaufnahme des Bildes mit dem Programm.
   3. Stellen Sie sich viele Zellen von mehreren Punkten aus und nicht nur eine.
8. Analysieren Sie die Bilder, indem Sie den Prozentsatz der Zellen zählen, die Herde von α-Synuclein-Aggregaten mit Hilfe von Analysesoftware enthalten. Beobachten Sie die Unterschiede zwischen dem löslichen GFP-Proteinsignal und dem foci-gebildeten GFP-Signal sowie die Diffusion von GFP mit der A30P-Variante von α-Synuclein.
   HINWEIS: Die Bildung von Herden wird bei den Wildtyp-, E46K- und A53T-Varianten von α-Synuclein beobachtet.

Ergebnisse

Es ist bekannt, dass die hohe Expression von α-Synuclein mit dem neuronalen Zelltod und der Parkinson-Krankheit in Modellsystemen der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Diese Studie beschreibt drei Methoden zur Überwachung der Zytotoxizität von α-Synuclein und der Bildung von aggregiertem α-Synuclein in Hefe. Hier wurde das α-Synuclein in Hefe überexprimiert, und die Phänotypen von Wildtyp-α-Synuclein und drei Varianten von α-Synuclein, die als familiäre Mutanten von PD bekannt sind, wurden unter...

Diskussion

Angesichts der Komplexität verschiedener zellulärer Systeme beim Menschen ist es vorteilhaft, Hefe als Modell für die Untersuchung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen zu verwenden. Obwohl es nahezu unmöglich ist, die komplexen zellulären Interaktionen des menschlichen Gehirns mit Hilfe von Hefe zu untersuchen, weisen Hefezellen aus Einzelzellperspektive eine hohe Ähnlichkeit mit menschlichen Zellen in Bezug auf die genomische Sequenzhomologie und grundlegende eukaryotische zelluläre Prozesse auf

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00