Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Zusammenfassung

Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Zusammenfassung

Die Parkinson-Krankheit ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung und ist gekennzeichnet durch einen fortschreitenden Zelltod, der durch die Bildung von Lewy-Körperchen verursacht wird, die fehlgefaltetes und aggregiertes α-Synuclein enthalten. α-Synuclein ist ein reichlich vorhandenes präsynaptisches Protein, das den synaptischen Vesikeltransport reguliert, aber die Anhäufung seiner proteinartigen Einschlüsse führt zu Neurotoxizität. Neuere Studien haben gezeigt, dass verschiedene genetische Faktoren, einschließlich bakterieller Chaperone, die Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in vitro reduzieren könnten. Es ist jedoch auch wichtig, den Anti-Aggregationseffekt in der Zelle zu überwachen, um dies als mögliche Behandlung für die Patienten anzuwenden. Es wäre ideal, neuronale Zellen zu verwenden, aber diese Zellen sind schwer zu handhaben und brauchen lange, um den Anti-Aggregations-Phänotyp zu zeigen. Daher ist ein schnelles und effektives In-vivo-Tool für die weitere Bewertung der In-vivo-Antiaggregationsaktivität erforderlich. Die hier beschriebene Methode wurde verwendet, um den Anti-Aggregationsphänotyp in der humanisierten Hefe Saccharomyces cerevisiae zu überwachen und zu analysieren, der humanes α-Synuclein exprimierte. Dieses Protokoll demonstriert In-vivo-Werkzeuge, die zur Überwachung der α-Synuclein-induzierten zellulären Toxizität sowie der Bildung von α-Synuclein-Aggregaten in Zellen verwendet werden könnten.

Einleitung

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist ein ernstes Problem für alternde Gesellschaften weltweit. Die Aggregation von α-Synuclein ist eng mit Parkinson verbunden, und Proteinaggregate von α-Synuclein werden häufig als molekularer Biomarker für die Diagnose der Krankheit verwendet¹. α-Synuclein ist ein kleines saures Protein (140 Aminosäuren lang) mit drei Domänen, nämlich der N-terminalen Lipid-bindenden α-Helix, der Amyloid-bindenden zentralen Domäne (NAC) und dem C-terminalen sauren Schwanz². Die Fehlfaltung von α-Synuclein kann spontan auftreten und führt schließlich zur Bildung von Amyloid-Aggregaten, ....

Protokoll

1. Aufbereitung von Medien und Lösungen

1. Medienaufbereitung
   1. Zur Herstellung des YPD-Mediums werden 50 g YPD-Pulver in dH₂O gelöst, um ein Endvolumen von 1 L zu erhalten. Bei Raumtemperatur (RT) lagern.
   2. Um YPD-Agarmedium herzustellen, lösen Sie 50 g YPD-Pulver und 20 g Agar in 1 L dH₂O. Autoklav zur Sterilisation. Nach dem Abkühlen auf Petrischalen gießen. Bei 4 °C lagern.
   3. Zur Herstellung von SC mit Raffinose (SRd)-Ura-Medium werden 6,7 g Hefestickstoffbase mit Ammoniumsulfat und ohne Aminosäuren in 795 ml_dH2O. Autoklav zur Sterilisation gelöst. Fügen Sie vor Gebrauch 100 ml 20% Raf....

Ergebnisse

Es ist bekannt, dass die hohe Expression von α-Synuclein mit dem neuronalen Zelltod und der Parkinson-Krankheit in Modellsystemen der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht wird. Diese Studie beschreibt drei Methoden zur Überwachung der Zytotoxizität von α-Synuclein und der Bildung von aggregiertem α-Synuclein in Hefe. Hier wurde das α-Synuclein in Hefe überexprimiert, und die Phänotypen von Wildtyp-α-Synuclein und drei Varianten von α-Synuclein, die als familiäre Mutanten von PD bekannt sind, wurden unter.......

Diskussion

Angesichts der Komplexität verschiedener zellulärer Systeme beim Menschen ist es vorteilhaft, Hefe als Modell für die Untersuchung menschlicher neurodegenerativer Erkrankungen zu verwenden. Obwohl es nahezu unmöglich ist, die komplexen zellulären Interaktionen des menschlichen Gehirns mit Hilfe von Hefe zu untersuchen, weisen Hefezellen aus Einzelzellperspektive eine hohe Ähnlichkeit mit menschlichen Zellen in Bezug auf die genomische Sequenzhomologie und grundlegende eukaryotische zelluläre Prozesse auf

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00