İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Özet

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

Özet

Parkinson hastalığı ikinci en sık görülen nörodejeneratif hastalıktır ve yanlış katlanmış ve agrega olmuş α-sinüklein içeren Lewy cisimlerinin oluşumunun neden olduğu ilerleyici hücre ölümü ile karakterizedir. α-sinüklein, sinaptik vezikül kaçakçılığını düzenleyen bol miktarda presinaptik bir proteindir, ancak proteinli inklüzyonların birikmesi nörotoksisiteye neden olur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bakteriyel şaperonlar da dahil olmak üzere çeşitli genetik faktörlerin, in vitro α-sinüklein agregalarının oluşumunu azaltabileceğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bunu hastalar için potansiyel bir tedavi olarak uygulamak için hücredeki anti-agregasyon etkisini izlemek de önemlidir. Nöronal hücreleri kullanmak ideal olacaktır, ancak bu hücrelerin ele alınması zordur ve anti-agregasyon fenotipini sergilemek uzun zaman alır. Bu nedenle, in vivo anti-agregasyon aktivitesinin daha fazla değerlendirilmesi için hızlı ve etkili bir in vivo araç gereklidir. Burada açıklanan yöntem, insan α-sinükleini ifade eden insanlaştırılmış maya Saccharomyces cerevisiae'deki anti-agregasyon fenotipini izlemek ve analiz etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, α-sinüklein kaynaklı hücresel toksisiteyi ve ayrıca hücrelerde α-sinüklein agregalarının oluşumunu izlemek için kullanılabilecek in vivo araçları göstermektedir.

Giriş

Parkinson hastalığı (PH) tüm dünyada yaşlanan toplumlar için ciddi bir sorundur. α-sinükleinin agregasyonu PD ile yakından ilişkilidir ve α-sinükleinin protein agregaları, hastalığın teşhisi için moleküler bir biyobelirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır¹. α-sinüklein, N-terminal lipit bağlayıcı α-sarmal, amiloid bağlayıcı merkezi alan (NAC) ve C-terminal asidik kuyruk² olmak üzere üç alana sahip küçük bir asidik proteindir (140 amino asit uzunluğunda). α-sinükleinin yanlış katlanması kendiliğinden ortaya çıkabilir ve sonunda Lewy cisimleri³ adı verilen amiloid agregala....

Protokol

1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması

1. Medya hazırlama
   1. YPD ortamını hazırlamak için, sterilizasyon için 1 L. Otoklav nihai hacmi yapmak üzere 50 g YPD tozunu dH₂O'da çözün. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.
   2. YPD agar ortamı yapmak için, sterilizasyon için 50 g YPD tozu ve 20 g agar'ı 1 L dH₂O. Otoklav içinde çözün. Soğuduktan sonra Petri bulaşıklarının üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.
   3. SC'yi rafinoz (SRd)-Ura ortamı ile yapmak için, 6.7 g maya azot bazını amonyum sülfatla ve amino asitler olmadan sterilizasyon için 795 mL dH₂O. Otoklav içinde çözün. Kullanmadan önce 100 mL% 20 rafinoz,....

Sonuçlar

α-sinükleinin yüksek ekspresyonunun, PD'nin model sistemlerinde nöronal hücre ölümü ve PD ile bağlantılı olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, α-sinükleinin sitotoksisitesini ve mayada agrega α-sinükleinin odak oluşumunu izlemek için üç yöntem açıklanmaktadır. Burada, α-sinüklein mayada aşırı eksprese edildi ve vahşi tip α-sinükleinin fenotipleri ve PD'nin ailesel mutantları olarak bilinen üç α-sinüklein varyantı incelendi (Şekil 1 ve Malzeme T.......

Tartışmalar

İnsanlardaki çeşitli hücresel sistemlerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, mayayı insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanmak avantajlıdır. İnsan beyninin karmaşık hücresel etkileşimlerini maya kullanarak araştırmak neredeyse imkansız olsa da, tek hücreli bir bakış açısıyla, maya hücreleri, genomik dizi homolojisi ve temel ökaryotik hücresel süreçler açısından insan hücrelerine yüksek düzeyde benzerliğe sahiptir

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00