ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法

要約

パーキンソン病の病態を研究・理解するためには、α-シヌクレインの in vivo 生理学的モデルが必要です。ヒト化酵母モデルを用いてα-シヌクレインの細胞毒性と凝集体形成をモニターする方法を記載する。

要約

パーキンソン病は2番目に多い神経変性疾患であり、誤って折りたたまれ凝集したα-シヌクレインを含むレビー小体の形成によって引き起こされる進行性の細胞死を特徴としています。α-シヌクレインは、シナプス小胞輸送を調節する豊富なシナプス前タンパク質ですが、そのタンパク質性封入体の蓄積は神経毒性をもたらします。最近の研究では、細菌のシャペロンを含むさまざまな遺伝的要因が、in vitroでのα-シヌクレイン凝集体の形成を減少させる可能性があることが明らかになりました。しかし、これを患者の潜在的な治療法として適用するために、細胞内の抗凝集効果を監視することも重要です。神経細胞を用いるのが理想的ですが、これらの細胞は取り扱いが難しく、抗凝集表現型を示すまでに長い時間がかかります。したがって、in vivo抗凝集活性のさらなる評価のために、迅速かつ効果的なin vivoツールが必要とされる。ここで説明した方法は、ヒトα-シヌクレインを発現するヒト化酵母サッカロミセス・セレビシエにおける抗凝集表現型をモニターおよび分析するために使用されました。このプロトコルは、α-シヌクレイン誘発性細胞毒性、および細胞内でのα-シヌクレイン凝集体の形成をモニタリングするために使用できるin vivoツールを実証します。

概要

パーキンソン病(PD)は、世界中の高齢化社会にとって深刻な問題です。α-シヌクレインの凝集はPDと密接に関連しており、α-シヌクレインのタンパク質凝集体は疾患を診断するための分子バイオマーカーとして広く用いられている¹。α-シヌクレインは、N末端脂質結合αヘリックス、アミロイド結合中心ドメイン(NAC)、C末端酸性テール²の3つのドメインを持つ小さな酸性タンパク質(長さ140アミノ酸)です。α-シヌクレインのミスフォールディングは自発的に起こり、最終的にはレビー小体³と呼ばれるアミロイド凝集体の形成につながります。α-シヌクレインは、いくつかの方法でPDの病因に寄与する可能性があります。一般に、プロトフィブリルと呼ばれるその異常で可溶性オリゴマー型は、シナプス機能を含むさまざまな細胞標的に影響を与えることによって神経細胞死を引き起こす有毒種であると考えられています³。

神経変性疾患の研究に使用される生物学的モデルは、そのゲノムおよび細胞生物学に関してヒトに関連している必要があります。最良のモデルはヒト神経細胞株でしょう。しかし、これらの細胞株は、培養の維持の難しさ、トランスフェクションの効率の低さ、高額な費用など、いくつかの技術的問題と関連しています⁴。これらの理由から、この研究分野の進歩を加速するには、簡単で信頼性の高いツールが必要です。重要なのは、収集されたデータの分析に使いやすいツールであることです。これらの観点から、 ショウジョウバエ、 カエノラブディティスエレガンス、 ダニオレリオ、酵母、げっ歯類など、さまざまなモデル生物が広く使用されています⁵。その中でも酵母は遺伝子操作が容易で、他のモデル生物よりも安価であるため、最良のモデル生物です。最も重要なことは、酵母はヒトオルソログと60%の配列相同性、ヒト疾患関連遺伝子と25%の密接な相同性など、ヒト細胞と高い類似性^{を持ち6、}基本的な真核細胞生物学も共有していることです。酵母には、ヒト細胞と同様の配列と類似の機能を持つ多くのタンパク質が含まれています⁷。実際、ヒト遺伝子を発現する酵母は、細胞プロセスを解明するためのモデル系として広く用いられている⁸。この酵母株はヒト化酵母と呼ばれ、ヒト遺伝子の機能を探索するための有用なツールです⁹。ヒト化酵母は、遺伝子操作が酵母で十分に確立されているため、遺伝的相互作用を研究するためのメリットがあります。

本研究では、酵母サッカロマイセス・セレビシエをモデル生物としてPDの病態を研究し、特にα-シヌクレイン凝集体形成と細胞毒性を調べました¹⁰。出芽酵母におけるα-シヌクレインの発現のために、W303a株を、α-シヌクレインの野生型および家族性PD関連変異体をコードするプラスミドによる形質転換に使用した。W303a株はURA3に栄養要求性変異を有するため、URA3を有するプラスミドを含む細胞の選択に適用可能である。プラスミドにコードされるα-シヌクレインの発現は、GAL1プロモーターの下で調節されています。これにより、α-シヌクレインの発現量を制御することができる。さらに、α-シヌクレインのC末端領域における緑色蛍光タンパク質(GFP)の融合により、α-シヌクレイン病巣形成のモニタリングが可能になります。α-シヌクレインの家族性PD関連変異体の特徴を理解するために、酵母でもこれらの変異体を発現させ、細胞効果を調べました。このシステムは、α-シヌクレインの細胞毒性に対する保護的役割を示す化合物または遺伝子をスクリーニングするための簡単なツールです。

プロトコル

1.培地と溶液の準備

1. メディアの準備
   1. YPD培地を調製するには、50 gのYPD粉末をdH₂Oに溶解して、最終容量1 Lの滅菌用オートクレーブを作ります。室温(RT)で保管してください。
   2. YPD寒天培地を作るには、YPD粉末50gと寒天20gを1LのdH₂O.オートクレーブに溶解して滅菌します。冷やした後、ペトリ皿に注ぎます。4°Cで保存してください。
   3. ラフィノース(SRd)-Ura培地でSCを作るには、6.7 gの酵母窒素塩基を硫酸アンモニウムで、アミノ酸を含まない795 mLのdH₂O.オートクレーブに溶解して滅菌します。使用前に100 mLの20%ラフィノース、5 mLの20%グルコース、および100 mLの10x -Uraドロップアウトを追加します。.
   4. SD-Ura寒天培地を作るには、6.7 gの酵母窒素塩基を硫酸アンモニウムでアミノ酸なしで溶解し、20 gの寒天を800 mLのdH 2 Oに溶解します。 オートクレーブを₂Lを超える容量のフラスコに入れ、100 mLの20%グルコースと100 mLの10x -Uraドロップアウトを追加します。よく混ぜてペトリ皿に注ぎます。4°Cで保存してください。
   5. ガラクトース(SG)-Ura寒天培地でSCを作るには、6.7 gの酵母窒素塩基を硫酸アンモニウムでアミノ酸なしで溶解し、20 gの寒天を800 mLのdH 2 Oに溶解します。₂Lを超える容量のフラスコにオートクレーブし、100 mLの20%ガラクトースと100 mLの10x -Uraドロップアウトを追加します。よく混ぜてペトリ皿に注ぐ。4°Cで保存してください。
2. SD メディアで使用するストック ソリューション
   1. 20%の炭素源(グルコース、ガラクトース、およびラフィノース)を作るには、100 gのグルコース、ガラクトース、またはラフィノースをdH₂Oに溶解して、最終容量を500 mLにします。オートクレーブしてRTに保管します。
   2. ウラシルを含まない10倍酵母合成ドロップアウト培地サプリメント(10x-Uraドロップアウト)を作るには、19.2gの「ウラシルを含まない酵母合成ドロップアウト培地サプリメント」をdH₂Oに溶解し、最終容量1Lのオートクレーブを作り、RTで保存します。
      注:寒天を含む培地を調製するには、フラスコに磁気攪拌子を追加して、ペトリ皿に注ぐ前にすべての溶液をよく混合します。

2.酵母の形質転換

注:pRS426プラスミドは 、α-シヌクレイン 遺伝子のクローニングに使用され、選択マーカーとして URA3 遺伝子を含んでいました。重篤な疾患表現型(例えば、細胞毒性)を有するα-シヌクレインの家族性PD関連変異体がある。これらの変異体は、それらの細胞毒性および凝集病巣形成をモニターするためにここでも使用された。一貫した結果を得るために、すべての実験に酵母形質転換体の同じコロニーを使用してください。

1. 酵母発現プラスミドの形質転換には、コントロールおよびαシヌクレイン含有プラスミドとして空のベクター(pRS426)を使用する。標準酢酸リチウム(LiAc)法¹¹を参照して、6個のコンピテントセルと0.5 μgの各プラスミドを調製し、形質転換を行う。
2. プラスミドを含む酵母形質転換体を選択するには、ウラシルを含まない合成規定培地(SD培地)(SD-Ura)を使用し、プレートを30°Cで2〜3日間インキュベートします。
3. 3つのシングルコロニーをSD-Ura寒天プレートにパッチして、プラスミドを含む細胞を選択し、さらなる実験を行います。
   注:正確で信頼性の高い結果を生成するために、菌株ごとに少なくとも3つの生物学的複製を調べました。

3. スポッティングアッセイ

注:高コピー数プラスミドにおけるGFPタグ付きα-シヌクレインの発現は、酵母¹⁰の細胞毒性と関連していることが知られています。

1. GAL1プロモーターおよび0.1%グルコース下でのα-シヌクレインの誘導を阻害するための2%ラフィノースを含む酵母の選択的増殖のために、1株ごとに3つのパッチされた酵母形質転換体を3 mLのSRd-Uraに接種します。細胞培養物を30°Cで200rpmで撹拌しながらインキュベートする。
   注:異なるコロニーですべての実験を繰り返すことが重要です。3つ以上の独立したコロニーから同じ結果が得られることは、結果が信頼できることを意味します。
2. 翌日、一晩培養した細胞を_OD600 が0.2となるように新鮮なSRd-Ura3 mLに植菌し、200rpmで撹拌しながら30°Cで6時間インキュベートした。
3. OD₆₀₀ が0.6〜0.8に達したら、以下のようにスポッティングアッセイのために96ウェルプレートで細胞を希釈します。
   1. すべてのサンプルのOD₆₀₀を測定し、96ウェルプレートのレーン1で滅菌dH₂O(混合容量は100 μL)でサンプルをOD₆₀₀ 0.5に希釈して、各培養の細胞数を均等にします。
   2. 次の5レーンに160 μLの滅菌dH₂Oを加えて、酵母細胞の5倍段階希釈を行います。各レーンで細胞を連続希釈する場合は、総容量40 μLを確保してください。
      注:希釈係数が低いと、サンプル間の差が大きくなる可能性があります。段階希釈を行う際に均一な混合を確保するには、十分なピペッティングが必要です。ピペットチップは、希釈ポイントごとに交換する必要があります。そうしないと、先端の表面に付着した細胞が次のウェルに移され、細胞数に影響を与える可能性があります。
4. マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから10 μLを移し、コントロール用のSD-Ura寒天プレートとSG-Ura寒天プレート上のサンプルを見つけて毒性をモニタリングします。
   注意: 斑点を付けられたサンプルがプレートに完全に吸収されるまで、プレートを乾燥させる必要があります。
5. 斑点を付けたプレートを逆さまにして30°Cで4日間インキュベートします。
6. 4日目まで24時間ごとにプレートの画像を撮り、目で発見した株間の成長差を比較することによってデータを分析します。最も希釈されたサンプル中の個々のコロニーをカウントするか、各株の元の培養における生細胞の数を計算するか、または単一のコロニーのサイズを比較します。

4. マイクロプレートリーダーを用いた酵母増殖測定

1. 1株あたり3つのパッチを貼った酵母形質転換体を3 mLのSRd-Uraに接種し、200rpmで一晩撹拌しながら30°Cでインキュベートします。
   注:α-シヌクレインを発現するヒト化酵母株の各コロニー表現型を理解するには、すべての実験に同じ形質転換体を使用します。
2. 翌日、一晩培養した細胞を96ウェルプレートで合計200 μLの新鮮なSD-UraとSG-Uraに接種します。細胞を含む最終容量を200 μLに調整し、初期細胞外径₆₀₀ を0.05に調整します。
   1. マイクロタイタープレートのプログラム設定を次のように調整します:目標温度を30°Cに設定し、振とう(線形)持続時間を890秒に設定し、振とう(線形)振幅を5 mmに設定し、間隔時間を00:15:00に設定し、測定を600nmの吸光度として設定します。
   2. すべての菌株がマイクロプレートリーダーの固定相に到達するまで、プレートを2〜3日間インキュベートします。
3. 成長曲線をプロットしてデータを分析します(ワークブックを使用するなど)。3つの生物学的反復からの吸光度の値を平均してデータポイントを取得し、エラーバーを示します。培地のみの吸光度の値をコントロールとして使用し、培養細胞の値からこれを差し引きます(オプション)。

5. 蛍光顕微鏡

1. パッチした酵母形質転換体を3 mLのSRd-Uraに植菌し、200 rpmで撹拌しながら30°Cで一晩培養します。
   注:表現型と細胞毒性および病巣形成との相関関係を決定するには、実験に同じコロニーを使用します。
2. 翌日、一晩培養した細胞を3 mLの新鮮なSRd-Uraに_OD600 が0.003になるように再接種します。OD₆₀₀ が0.2に達するまで培養液を30°C、200rpm(~18時間)で撹拌します。
3. OD 600が0.2に達したら、20%ガラクトースを300 μL添加し、200 rpmで攪拌しながら₃₀ °Cでさらに6時間インキュベートします。
4. 800 x g で5分間遠心分離して細胞を回収し、上清を廃棄します。
5. 細胞ペレットを30 μLの蒸留水に穏やかに再懸濁します。
6. 再懸濁した細胞5 μLをスライドグラスにロードします。アガロースゲルパッド¹² を用意し、装填したセルの上に置いて均等に広げます。
7. 明視野フィルターとGFP蛍光フィルターの両方を使用して、100倍の対物レンズで顕微鏡イメージングを実行します。
   1. まず、明視野を使用して、液浸オイルを使用して100倍の対物レンズでセルに焦点を合わせます。プログラムを使用して画像を生成するには、画面キャプチャオプションを使用します。
   2. GFP蛍光フィルターに切り替えます。画像の露出時間を50ミリ秒から300ミリ秒の間で調整し、信号対雑音比のバランスを取り、鮮明な画像を実現します。プログラムを使用して画像をスクリーンキャプチャします。
   3. 1 つではなく複数のポイントから多くのセルを画像化します。
8. 分析ソフトウェアを使用してα-シヌクレイン凝集体の病巣を含む細胞の割合をカウントすることにより、画像を分析します。可溶性GFPタンパク質シグナルと病巣形成GFPシグナルの違い、およびA30P変異体のαシヌクレインによるGFPの拡散を観察します。
   注:病巣形成は、野生型、E46K、およびA53Tバリアントで観察されます α-シヌクレインの。

結果

α-シヌクレインの高発現は、PDのモデル系における神経細胞死およびPDに関連していることが知られている。この研究では、酵母におけるα-シヌクレインの細胞毒性と凝集α-シヌクレインの病巣形成を監視する3つの方法について説明しています。ここでは、酵母でα-シヌクレインの過剰発現を行い、野生型α-シヌクレインの表現型とPDの家族性変異体として知られるα-シヌクレインの3つの変?...

ディスカッション

ヒトにおける様々な細胞系の複雑さを考えると、ヒトの神経変性疾患を研究するためのモデルとして酵母を使用することは有利である。酵母を用いてヒトの脳の複雑な細胞間相互作用を調べることはほぼ不可能ですが、単一細胞の観点からは、酵母細胞はゲノム配列の相同性および基本的な真核細胞プロセスの点でヒト細胞と高いレベルの類似性を持っています^8,13<...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00