Méthode pour étudier la toxicité et l’agrégation de la α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisée

Résumé

Un modèle physiologique in vivo de la α-synucléine est nécessaire pour étudier et comprendre la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Nous décrivons une méthode pour surveiller la cytotoxicité et la formation agrégée de α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisé.

Résumé

La maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente et se caractérise par une mort cellulaire progressive causée par la formation de corps de Lewy contenant de la α-synucléine mal repliée et agrégée. α-synucléine est une protéine présynaptique abondante qui régule le trafic des vésicules synaptiques, mais l’accumulation de ses inclusions protéiques entraîne une neurotoxicité. Des études récentes ont révélé que divers facteurs génétiques, y compris les chaperons bactériens, pourraient réduire la formation d’agrégats de α-synucléine in vitro. Cependant, il est également important de surveiller l’effet anti-agrégation dans la cellule pour l’appliquer comme traitement potentiel pour les patients. Il serait idéal d’utiliser des cellules neuronales, mais ces cellules sont difficiles à manipuler et prennent beaucoup de temps à présenter le phénotype anti-agrégation. Par conséquent, un outil in vivo rapide et efficace est nécessaire pour une évaluation plus approfondie de l’activité anti-agrégation in vivo. La méthode décrite ici a été utilisée pour surveiller et analyser le phénotype anti-agrégation de la levure humanisée Saccharomyces cerevisiae, qui exprimait la α-synucléine humaine. Ce protocole démontre des outils in vivo qui pourraient être utilisés pour surveiller la toxicité cellulaire induite par la α-synucléine, ainsi que la formation d’agrégats de α-synucléine dans les cellules.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP) est un problème grave pour les sociétés vieillissantes du monde entier. L’agrégation de la α-synucléine est étroitement associée à la MP, et les agrégats protéiques de α-synucléine sont largement utilisés comme biomarqueur moléculaire pour diagnostiquer la maladie¹. α-synucléine est une petite protéine acide (140 acides aminés de longueur) avec trois domaines, à savoir la α-hélice de liaison lipidique N-terminale, le domaine central de liaison amyloïde (NAC) et la queue acide C-terminale². Le mauvais repliement de la α-synucléine peut se produire spontanément et conduit éventuellement à la formation d’agrégats amyloïdes appelés corps de Lewy³. α-synucléine peut contribuer à la pathogenèse de la MP de plusieurs façons. En général, on pense que ses formes oligomères anormales et solubles appelées protofibrilles sont des espèces toxiques qui provoquent la mort des cellules neuronales en affectant diverses cibles cellulaires, y compris la fonction synaptique³.

Les modèles biologiques utilisés pour étudier les maladies neurodégénératives doivent être pertinents pour les humains en ce qui concerne leur génome et leur biologie cellulaire. Les meilleurs modèles seraient des lignées cellulaires neuronales humaines. Cependant, ces lignées cellulaires sont associées à plusieurs problèmes techniques, tels que des difficultés dans le maintien des cultures, une faible efficacité de la transfection et des dépenses élevées⁴. Pour ces raisons, un outil simple et fiable est nécessaire pour accélérer les progrès dans ce domaine de recherche. Il est important de noter que l’outil doit être facile à utiliser pour analyser les données collectées. De ce point de vue, divers organismes modèles ont été largement utilisés, notamment la drosophile, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, la levure et les rongeurs⁵. Parmi eux, la levure est le meilleur organisme modèle car la manipulation génétique est facile et moins chère que les autres organismes modèles. Plus important encore, la levure présente de grandes similitudes avec les cellules humaines, telles que 60% d’homologie de séquence avec les orthologues humains et 25% d’homologie étroite avec les gènes liés à la maladie humaine⁶, et elles partagent également la biologie fondamentale des cellules eucaryotes. La levure contient de nombreuses protéines avec des séquences similaires et des fonctions analogues à celles des cellules humaines⁷. En effet, la levure exprimant des gènes humains a été largement utilisée comme système modèle pour élucider les processus cellulaires⁸. Cette souche de levure est appelée levure humanisée et est un outil utile pour explorer la fonction des gènes humains⁹. La levure humanisée a le mérite d’étudier les interactions génétiques parce que la manipulation génétique est bien établie dans la levure.

Dans cette étude, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiae comme organisme modèle pour étudier la pathogenèse de la MP, en particulier pour étudier la formation d’agrégats de α-synucléine et la cytotoxicité¹⁰. Pour l’expression de la α-synucléine dans la levure bourgeonnante, la souche W303a a été utilisée pour la transformation avec des plasmides codant pour les variantes de type sauvage et familiales associées à la de la α-synucléine. Comme la souche W303a a une mutation auxotrophe sur URA3, elle est applicable pour la sélection de cellules contenant des plasmides avec URA3. L’expression de la α-synucléine codée dans un plasmide est régulée par le promoteur GAL1. Ainsi, le niveau d’expression de la α-synucléine peut être contrôlé. De plus, la fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) dans la région C-terminale de la α-synucléine permet de surveiller la formation de foyers de α-synucléine. Pour comprendre les caractéristiques des variantes familiales associées à la MP de la α-synucléine, nous avons également exprimé ces variantes chez la levure et examiné leurs effets cellulaires. Ce système est un outil simple pour le criblage de composés ou de gènes présentant des rôles protecteurs contre la cytotoxicité de la α-synucléine.

Protocole

1. Préparation des supports et des solutions

1. Préparation des médias
   1. Pour préparer le milieu YPD, dissoudre 50 g de poudre YPD dans_dH2Opour obtenir un volume final de 1 L. Autoclave pour stérilisation. Conserver à température ambiante (RT).
   2. Pour fabriquer un milieu gélosé YPD, dissoudre 50 g de poudre YPD et 20 g de gélose dans 1 L de_dH2O. Autoclave pour stérilisation. Après refroidissement, verser sur des boîtes de Petri. Conserver à 4 °C.
   3. Pour faire SC avec un milieu raffinose (SRd)-Ura, dissoudre 6,7 g de levure azotée base avec du sulfate d’ammonium et sans acides aminés dans 795 mL de_dH2O. Autoclave pour stérilisation. Ajouter 100 mL de raffinose à 20 %, 5 mL de glucose à 20 % et 100 mL de goutte 10x -Ura avant utilisation.
   4. Pour fabriquer le milieu gélose SD-Ura, dissoudre 6,7 g de levure azotée base avec du sulfate d’ammonium et sans acides aminés et 20 g de gélose dans 800 mL de_dH2O. Autoclave dans une fiole d’un volume supérieur à 2 L. Ajouter 100 mL de glucose à 20 % et 100 mL de goutte 10x -Ura. Bien mélanger et verser sur les boîtes de Petri. Conserver à 4 °C.
   5. Pour faire SC avec un milieu gélosé galactose (SG)-Ura, dissoudre 6,7 g de levure azotée base avec du sulfate d’ammonium et sans acides aminés et 20 g de gélose dans 800 mL de_dH2O. Autoclave dans une fiole d’un volume supérieur à 2 L. Ajouter 100 mL de galactose à 20 % et 100 mL de goutte 10x -Ura. Bien mélanger et verser sur les boîtes de Petri. Conserver à 4 °C.
2. Solutions de stock à utiliser avec les supports SD
   1. Pour obtenir une source de carbone à 20 % (glucose, galactose et raffinose), dissoudre 100 g de glucose, de galactose ou de raffinose dans du dH₂O pour obtenir un volume final de 500 mL. Autoclave et stockage chez RT.
   2. Pour faire 10x suppléments de milieu de goutte synthétique de levure sans uracile (10x-Ura drop-out), dissoudre 19,2 g de « levure synthétique drop-out medium supplements sans uracile » dans_dH2Opour faire un volume final de 1 L. Autoclave et conserver chez RT.
      NOTE: Pour la préparation d’un milieu contenant de l’agar, ajouter une barre d’agitation magnétique dans la fiole pour bien mélanger toutes les solutions avant de les verser sur des boîtes de Pétri.

2. Transformation de la levure

REMARQUE: Le plasmide pRS426 a été utilisé pour cloner le gène de la α-synucléine et contenait le gène URA3 comme marqueur sélectionnable. Il existe des variantes familiales de la α-synucléine associées à la MP qui ont des phénotypes de maladie graves (p. ex. cytotoxicité). Ces variantes ont également été utilisées ici pour surveiller leur cytotoxicité et la formation de foyers agrégés. Utilisez la même colonie de transformants de levure pour toutes les expériences afin d’obtenir des résultats cohérents.

1. Pour la transformation des plasmides d’expression de levure, utilisez un vecteur vide (pRS426) comme témoin et des plasmides contenant de la α-synucléine. En se référant à la méthode standard de l’acétate de lithium (LiAc)¹¹, préparer six cellules compétentes et 0,5 μg de chaque plasmide, et effectuer la transformation.
2. Pour sélectionner des transformants de levure contenant des plasmides, utilisez le milieu défini synthétique (milieu SD) sans uracile (SD-Ura) et incuber les plaques à 30 °C pendant 2-3 jours.
3. Patcher trois colonies simples sur une plaque de gélose SD-Ura pour la sélection de cellules contenant des plasmides pour d’autres expériences.
   REMARQUE : Pour générer des résultats précis et fiables, nous avons examiné au moins trois réplications biologiques par souche.

3. Dosage de repérage

REMARQUE : On sait que l’expression de la α-synucléine marquée GFP dans les plasmides à nombre élevé de copies est associée à la cytotoxicité chez la levure¹⁰.

1. Inoculer les trois transformants de levure patchés par souche dans 3 mL de SRd-Ura pour la croissance sélective de levures contenant les plasmides avec 2% de raffinose pour l’inhibition de l’induction de la α-synucléine sous le promoteur GAL1 et 0,1% de glucose. Incuber la culture cellulaire à 30 °C sous agitation à 200 rpm.
   NOTE: Il est important de répéter toutes les expériences avec différentes colonies. L’obtention des mêmes résultats de plus de trois colonies indépendantes signifie que le résultat est fiable.
2. Le lendemain, inoculer les cellules cultivées pendant la nuit dans 3 mL de SRd-Ura frais à une DO₆₀₀ de 0,2 et incuber pendant 6 h à 30 °C sous agitation à 200 tr/min.
3. Lorsque le OD₆₀₀ atteint 0,6-0,8, diluer les cellules dans des plaques de 96 puits pour le test de repérage comme suit.
   1. Mesurer la DO 600 de tous les échantillons et diluer les échantillons à une DO 600 de 0,5 avec un dH₂O stérile (le volume mélangé est de₁₀₀ μL) dans la voie 1 d’une plaque de 96 puits pour égaliser le nombre de cellules dans chaque culture.
   2. Effectuer cinq dilutions en série des cellules de levure en ajoutant 160 μL de_dH2Ostérile aux cinq voies suivantes. Assurer un volume total de 40 μL lors de la dilution en série des cellules dans chaque voie.
      NOTE: De faibles facteurs de dilution peuvent produire des différences plus importantes entre les échantillons. Un pipetage suffisant est nécessaire pour assurer un mélange uniforme lors de l’exécution des dilutions en série. L’embout de la pipette doit être remplacé à chaque point de dilution. Sinon, les cellules attachées à la surface de la pointe pourraient être transférées au puits suivant et affecter le numéro de cellule.
4. Utiliser une pipette multicanal pour transférer 10 μL de chaque puits afin de repérer les échantillons sur les plaques de gélose SD-Ura pour les témoins et les plaques de gélose SG-Ura pour surveiller la toxicité.
   NOTE: Les plaques doivent être séchées jusqu’à ce que les échantillons tachetés soient complètement absorbés sur les plaques.
5. Incuber les plaques tachetées à l’envers à 30 °C pendant 4 jours.
6. Prenez des images des plaques toutes les 24 heures jusqu’au jour 4, puis analysez les données en comparant les différences de croissance entre les souches repérées à l’œil. Compter les colonies individuelles dans l’échantillon le plus dilué, calculer le nombre de cellules viables dans la culture originale pour chaque souche ou comparer la taille des colonies individuelles.

4. Mesure de la croissance des levures à l’aide d’un lecteur de microplaques

1. Inoculer les trois transformants de levure patchés par souche dans 3 mL de SRd-Ura, et incuber à 30 °C sous agitation à 200 rpm pendant la nuit.
   NOTE: Pour comprendre chaque phénotype de colonie de la souche de levure humanisée exprimant la α-synucléine, utilisez les mêmes transformants pour toutes les expériences.
2. Le lendemain, inoculer les cellules cultivées pendant la nuit dans un total de 200 μL de SD-Ura et SG-Ura frais dans des plaques de 96 puits. Réglez le volume final, y compris les cellules, à 200 μL et réglez la cellule initiale OD₆₀₀ à 0,05.
   1. Ajustez les paramètres du programme dans la plaque de microtitrage comme suit: réglez la température cible à 30 ° C, réglez la durée d’agitation (linéaire) sur 890 s, réglez l’amplitude d’agitation (linéaire) sur 5 mm, réglez le temps d’intervalle sur 00:15:00 et réglez la mesure comme absorbance à 600 nm.
   2. Incuber la plaque pendant 2-3 jours pour que toutes les souches atteignent la phase stationnaire dans un lecteur de microplaques.
3. Analysez les données en traçant la courbe de croissance (p. ex., à l’aide de Workbook). Acquérir les points de données en faisant la moyenne des valeurs d’absorbance des trois réplicas biologiques et indiquer les barres d’erreur. Utilisez la valeur d’absorbance du milieu uniquement comme témoin et soustrayez-la des valeurs des cellules cultivées (facultatif).

5. Microscopie à fluorescence

1. Inoculer les transformants de levure rapiécés en 3 mL de SRd-Ura, et les cultiver pendant la nuit à 30 °C sous agitation à 200 rpm.
   NOTE: Pour déterminer la corrélation du phénotype avec la cytotoxicité et la formation de foyers, utilisez les mêmes colonies pour l’expérience.
2. Le lendemain, réinoculer les cellules cultivées pendant la nuit dans 3 mL de SRd-Ura frais à une DO_{600 de 0,003} . Incuber la culture jusqu’à ce que le DO₆₀₀ atteigne 0,2 à 30 °C sous agitation à 200 tr/min (~18 h).
3. Lorsqu’une DO 600 de 0,2 est atteinte, ajouter₃₀₀ μL de galactose à 20 %, puis incuber pendant encore 6 h à 30 °C sous agitation à 200 tr/min.
4. Recueillir les cellules par centrifugation à 800 x g pendant 5 min, et jeter le surnageant.
5. Remettez délicatement en suspension la pastille cellulaire dans 30 μL d’eau distillée.
6. Chargez 5 μL des cellules remises en suspension sur un verre coulissant. Préparez un tampon de gel d’agarose¹² et placez-le sur les cellules chargées pour le faire répartir uniformément.
7. Effectuez une imagerie microscopique avec un objectif 100x à l’aide de filtres à fond clair et de fluorescence GFP.
   1. Tout d’abord, utilisez le fond clair pour focaliser la cellule avec un objectif 100x en utilisant de l’huile d’immersion. Utilisez l’option de capture d’écran pour générer les images à l’aide du programme.
   2. Passez à un filtre à fluorescence GFP. Ajustez le temps d’exposition de l’image entre 50 ms et 300 ms pour obtenir une image claire en équilibrant le rapport signal/bruit. Capture d’écran de l’image à l’aide du programme.
   3. Imaginez plusieurs cellules à partir de plusieurs points plutôt qu’un seul.
8. Analysez les images en comptant le pourcentage de cellules contenant des foyers d’agrégats de α-synucléine à l’aide d’un logiciel d’analyse. Observez les différences entre le signal de la protéine GFP soluble et le signal GFP formé par des foyers, ainsi que la diffusion de la GFP avec la variante A30P de la α-synucléine.
   NOTE: La formation de foyers sera observée avec les variantes de type sauvage, E46K et A53T de la α-synucléine.

Résultats

La forte expression de la α-synucléine est connue pour être liée à la mort cellulaire neuronale et à la MP dans les systèmes modèles de MP. Cette étude décrit trois méthodes pour surveiller la cytotoxicité de la α-synucléine et la formation de foyers de α-synucléine agrégée dans la levure. Ici, la α-synucléine a été surexprimée dans la levure, et les phénotypes de la α-synucléine de type sauvage et de trois variantes de la α-synucléine connues sous le nom de mutants familiaux de la MP ont ét?...

Discussion

Compte tenu de la complexité des différents systèmes cellulaires chez l’homme, il est avantageux d’utiliser la levure comme modèle pour étudier les maladies neurodégénératives humaines. Bien qu’il soit presque impossible d’étudier les interactions cellulaires complexes du cerveau humain à l’aide de levure, d’un point de vue unicellulaire, les cellules de levure présentent un niveau élevé de similitude avec les cellules humaines en termes d’homologie de séquence génomique et de processus cellu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00