Un metodo per studiare la tossicità e l'aggregazione della α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato

Riepilogo

È necessario un modello fisiologico in vivo di α-sinucleina per studiare e comprendere la patogenesi della malattia di Parkinson. Descriviamo un metodo per monitorare la citotossicità e la formazione di aggregati di α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato.

Abstract

La malattia di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerativa più comune ed è caratterizzata da una progressiva morte cellulare causata dalla formazione di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina mal ripiegata e aggregata. α-sinucleina è un'abbondante proteina presinaptica che regola il traffico delle vescicole sinaptiche, ma l'accumulo delle sue inclusioni proteiche provoca neurotossicità. Studi recenti hanno rivelato che vari fattori genetici, tra cui gli chaperoni batterici, potrebbero ridurre la formazione di aggregati di α-sinucleina in vitro. Tuttavia, è anche importante monitorare l'effetto anti-aggregazione nella cellula per applicarlo come potenziale trattamento per i pazienti. Sarebbe ideale utilizzare cellule neuronali, ma queste cellule sono difficili da gestire e richiedono molto tempo per mostrare il fenotipo anti-aggregazione. Pertanto, è necessario uno strumento in vivo rapido ed efficace per l'ulteriore valutazione dell'attività antiaggregazione in vivo. Il metodo qui descritto è stato utilizzato per monitorare e analizzare il fenotipo anti-aggregazione nel lievito umanizzato Saccharomyces cerevisiae, che esprimeva α-sinucleina umana. Questo protocollo dimostra strumenti in vivo che potrebbero essere utilizzati per monitorare la tossicità cellulare indotta da α-sinucleina, nonché la formazione di aggregati di α-sinucleina nelle cellule.

Introduzione

La malattia di Parkinson (PD) è un problema serio per le società che invecchiano in tutto il mondo. L'aggregazione della α-sinucleina è strettamente associata alla malattia di Parkinson e gli aggregati proteici della α-sinucleina sono ampiamente utilizzati come biomarcatore molecolare per diagnosticare la malattia¹. α-sinucleina è una piccola proteina acida (140 amminoacidi di lunghezza) con tre domini, vale a dire la α-elica legante i lipidi N-terminale, il dominio centrale legante l'amiloide (NAC) e la coda acida C-terminale². Il misfolding della α-sinucleina può verificarsi spontaneamente e alla fine porta alla formazione di aggregati amiloidi chiamati corpi di Lewy³. α-sinucleina può contribuire alla patogenesi della malattia di Parkinson in diversi modi. In generale, si pensa che le sue forme oligomeriche anormali e solubili chiamate protofibrille siano specie tossiche che causano la morte delle cellule neuronali colpendo vari bersagli cellulari, inclusa la funzione sinaptica³.

I modelli biologici utilizzati per studiare le malattie neurodegenerative devono essere rilevanti per l'uomo per quanto riguarda il loro genoma e la biologia cellulare. I migliori modelli sarebbero linee cellulari neuronali umane. Tuttavia, queste linee cellulari sono associate a diversi problemi tecnici, come difficoltà nel mantenimento delle colture, bassa efficienza della trasfezione e spese elevate⁴. Per questi motivi, è necessario uno strumento semplice e affidabile per accelerare i progressi in questo settore di ricerca. È importante sottolineare che lo strumento dovrebbe essere facile da usare per analizzare i dati raccolti. Da questi punti di vista, vari organismi modello sono stati ampiamente utilizzati, tra cui Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, lievito e roditori⁵. Tra questi, il lievito è il miglior organismo modello perché la manipolazione genetica è facile ed è più economico degli altri organismi modello. Ancora più importante, il lievito ha elevate somiglianze con le cellule umane, come il 60% di omologia di sequenza con ortologhi umani e il 25% di stretta omologia con geni correlati alla malattia umana⁶, e condividono anche la biologia cellulare eucariotica fondamentale. Il lievito contiene molte proteine con sequenze simili e funzioni analoghe a quelle delle cellule umane⁷. In effetti, il lievito che esprime geni umani è stato ampiamente utilizzato come sistema modello per chiarire i processi cellulari⁸. Questo ceppo di lievito è chiamato lievito umanizzato ed è uno strumento utile per esplorare la funzione dei geni umani⁹. Il lievito umanizzato ha il merito di studiare le interazioni genetiche perché la manipolazione genetica è ben consolidata nel lievito.

In questo studio, abbiamo utilizzato il lievito Saccharomyces cerevisiae come organismo modello per studiare la patogenesi della malattia di Parkinson, in particolare per studiare la formazione di aggregati di α-sinucleina e la citotossicità¹⁰. Per l'espressione della α-sinucleina nel lievito in erba, il ceppo W303a è stato utilizzato per la trasformazione con plasmidi che codificano per le varianti wild-type e familiari associate al PD della α-sinucleina. Poiché il ceppo W303a ha una mutazione auxotrofica su URA3, è applicabile per la selezione di cellule contenenti plasmidi con URA3. L'espressione della α-sinucleina codificata in un plasmide è regolata dal promotore GAL1. Pertanto, il livello di espressione della α-sinucleina può essere controllato. Inoltre, la fusione della proteina fluorescente verde (GFP) nella regione C-terminale della α-sinucleina consente il monitoraggio della formazione di focolai di α-sinucleina. Per comprendere le caratteristiche delle varianti familiari associate alla PD della α-sinucleina, abbiamo anche espresso queste varianti nel lievito e esaminato i loro effetti cellulari. Questo sistema è uno strumento semplice per lo screening di composti o geni che mostrano ruoli protettivi contro la citotossicità della α-sinucleina.

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Protocollo

1. Preparazione di supporti e soluzioni

1. Preparazione dei supporti
   1. Per preparare il mezzo YPD, sciogliere 50 g di polvere YPD in dH₂O per ottenere un volume finale di 1 L. Autoclave per la sterilizzazione. Conservare a temperatura ambiente (RT).
   2. Per rendere YPD agar medio, sciogliere 50 g di polvere YPD e 20 g di agar in 1 L di dH₂O. Autoclave per la sterilizzazione. Dopo aver raffreddato, versare sulle piastre di Petri. Conservare a 4 °C.
   3. Per fare SC con raffinosio (SRd)-Ura mezzo, sciogliere 6,7 g di lievito azotato base con solfato di ammonio e senza amminoacidi in 795 ml di dH₂O. Autoclave per la sterilizzazione. Aggiungere 100 ml di raffinosio al 20%, 5 ml di glucosio al 20% e 100 ml di drop-out di 10x -Ura prima dell'uso.
   4. Per ottenere un mezzo di agar SD-Ura, sciogliere 6,7 g di azoto base di lievito con solfato di ammonio e senza amminoacidi e 20 g di agar in 800 mL di dH 2 O. Autoclave in un matraccio con un volume superiore a₂L. Aggiungere 100 ml di glucosio al 20% e 100 ml di drop-out 10x -Ura. Mescolare bene e versare sulle piastre di Petri. Conservare a 4 °C.
   5. Per fare SC con galattosio (SG)-Ura agar medium, sciogliere 6,7 g di lievito azotato base con solfato di ammonio e senza amminoacidi e 20 g di agar in 800 mL di dH 2 O. Autoclave in un matraccio con un volume superiore a₂L. Aggiungere 100 mL di galattosio al 20% e 100 mL di drop-out 10x -Ura. Mescolare bene e versare sulle piastre di Petri. Conservare a 4 °C.
2. Soluzioni stock da utilizzare con supporti SD
   1. Per ottenere una fonte di carbonio al 20% (glucosio, galattosio e raffinosio), sciogliere 100 g di glucosio, galattosio o raffinosio in dH₂O per ottenere un volume finale di 500 ml. Autoclave e deposito presso RT.
   2. Per fare 10x integratori di lievito sintetico drop-out medio senza uracile (10x-Ura drop-out), sciogliere 19,2 g di "lievito sintetico drop-out medium integratori senza uracile" in dH₂O per ottenere un volume finale di 1 L. Autoclave e conservare a RT.
      NOTA: Per la preparazione di un mezzo contenente agar, aggiungere una barra di agitazione magnetica al pallone per mescolare bene tutte le soluzioni prima di versare sulle piastre di Petri.

2. Trasformazione del lievito

NOTA: Il plasmide pRS426 è stato utilizzato per clonare il gene della α-sinucleina e conteneva il gene URA3 come marcatore selezionabile. Esistono varianti familiari associate alla malattia di α-sinucleina che hanno fenotipi di malattia gravi (ad esempio, citotossicità). Queste varianti sono state utilizzate anche qui per monitorare la loro citotossicità e la formazione di focolai aggregati. Utilizzare la stessa colonia di trasformanti di lievito per tutti gli esperimenti per ottenere risultati coerenti.

1. Per la trasformazione dei plasmidi di espressione del lievito, utilizzare un vettore vuoto (pRS426) come plasmidi di controllo e contenenti α-sinucleina. Facendo riferimento al metodo standard di acetato di litio (LiAc)¹¹, preparare sei cellule competenti e 0,5 μg di ciascun plasmide ed eseguire la trasformazione.
2. Per selezionare i trasformanti di lievito contenenti plasmidi, utilizzare il mezzo sintetico definito (mezzo SD) senza uracile (SD-Ura) e incubare le piastre a 30 °C per 2-3 giorni.
3. Applicare tre singole colonie su una piastra di agar SD-Ura per la selezione di cellule contenenti plasmidi per ulteriori esperimenti.
   NOTA: Per generare risultati accurati e affidabili, abbiamo esaminato almeno tre repliche biologiche per ceppo.

3. Saggio di spotting

NOTA: È noto che l'espressione della α-sinucleina marcata con GFP nei plasmidi ad alto numero di copie è associata alla citotossicità nel lievito¹⁰.

1. Inoculare i tre trasformanti di lievito patchati per ceppo in 3 ml di SRd-Ura per la crescita selettiva del lievito contenente i plasmidi con il 2% di raffinosio per inibire l'induzione della α-sinucleina sotto il promotore GAL1 e lo 0,1% di glucosio. Incubare la coltura cellulare a 30 °C sotto agitazione a 200 giri/min.
   NOTA: Ripetere tutti gli esperimenti con diverse colonie è importante. Ottenere gli stessi risultati da oltre tre colonie indipendenti significa che il risultato è affidabile.
2. Il giorno successivo, inoculare le cellule coltivate durante la notte in 3 ml di SRd-Ura fresco a un OD 600 di 0,2 e incubare per 6 ore a 30 °C sotto agitazione a₂₀₀ giri/min.
3. Quando l'OD₆₀₀ raggiunge 0,6-0,8, diluire le cellule in piastre a 96 pozzetti per il test spotting come segue.
   1. Misurare l'OD 600 di tutti i campioni e diluire i campioni a un OD 600 di 0,5 con dH₂O sterile (il volume misto è₁₀₀ μL) nella corsia 1 di una piastra a 96 pozzetti per equalizzare il numero di cellule in ciascuna coltura.
   2. Eseguire diluizioni seriali cinque volte delle cellule di lievito aggiungendo 160 μL di dH₂O sterile alle cinque corsie successive. Garantire un volume totale di 40 μL quando si diluiscono in serie le celle in ciascuna corsia.
      NOTA: Bassi fattori di diluizione possono produrre differenze maggiori tra i campioni. È necessario un pipettaggio sufficiente per garantire una miscelazione uniforme durante l'esecuzione delle diluizioni seriali. La punta della pipetta deve essere sostituita ad ogni punto di diluizione. Altrimenti, le cellule attaccate alla superficie della punta potrebbero essere trasferite al pozzetto successivo e influenzare il numero di celle.
4. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 10 μL da ciascun pozzetto per individuare i campioni sulle piastre di agar SD-Ura per i controlli e sulle piastre di agar SG-Ura per monitorare la tossicità.
   NOTA: Le piastre devono essere asciugate fino a quando i campioni maculati non sono completamente assorbiti sulle piastre.
5. Incubare le placche maculate capovolte a 30 °C per 4 giorni.
6. Scatta immagini delle lastre ogni 24 ore fino al giorno 4, quindi analizza i dati confrontando le differenze di crescita tra i ceppi individuati ad occhio. Contare le singole colonie nel campione più diluito, calcolare il numero di cellule vitali nella coltura originale per ciascun ceppo o confrontare le dimensioni delle singole colonie.

4. Misurazione della crescita del lievito utilizzando un lettore di micropiastre

1. Inoculare i tre trasformatori di lievito rattoppati per ceppo in 3 ml di SRd-Ura e incubare a 30 °C sotto agitazione a 200 giri/min durante la notte.
   NOTA: Per comprendere ogni fenotipo di colonia del ceppo di lievito umanizzato che esprime α-sinucleina, utilizzare gli stessi trasformanti per tutti gli esperimenti.
2. Il giorno successivo, inoculare le cellule coltivate durante la notte in un totale di 200 μL di SD-Ura e SG-Ura freschi in piastre da 96 pozzetti. Regolare il volume finale, comprese le celle, a 200 μL e regolare la cella iniziale OD₆₀₀ su 0,05.
   1. Regolare le impostazioni del programma nella piastra di microtitolazione come segue: impostare la temperatura target su 30 ° C, impostare la durata dello scuotimento (lineare) su 890 s, impostare l'ampiezza di agitazione (lineare) su 5 mm, impostare il tempo di intervallo su 00: 15:00 e impostare la misurazione come assorbanza a 600 nm.
   2. Incubare la piastra per 2-3 giorni affinché tutti i ceppi raggiungano la fase stazionaria in un lettore di micropiastre.
3. Analizzare i dati tracciando la curva di crescita (ad esempio, utilizzando Cartella di lavoro). Acquisire i punti dati facendo la media dei valori di assorbanza delle tre repliche biologiche e indicare le barre di errore. Utilizzare il valore di assorbanza dal solo supporto come controllo e sottrarlo dai valori delle cellule coltivate (facoltativo).

5. Microscopia a fluorescenza

1. Inoculare i trasformanti di lievito rattoppati in 3 ml di SRd-Ura e coltivarli per una notte a 30 °C sotto agitazione a 200 giri/min.
   NOTA: Per determinare la correlazione del fenotipo con la citotossicità e la formazione di focolai, utilizzare le stesse colonie per l'esperimento.
2. Il giorno successivo, reinoculare le cellule coltivate durante la notte in 3 ml di SRd-Ura fresco a un OD_{600 di 0,003} . Incubare la coltura fino a quando l'OD 600 raggiunge 0,2 a 30 °C sotto agitazione a₂₀₀ rpm (~18 h).
3. Quando si ottiene un OD 600 di 0,2, aggiungere 300 μL di galattosio al 20%, quindi incubare per altre 6 ore a 30 °C agitando a₂₀₀ giri/min.
4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 800 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
5. Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 30 μL di acqua distillata.
6. Caricare 5 μL delle celle risospese su un vetro vetrino. Preparare un tampone di gel di agarosio¹² e metterlo sulle cellule caricate per farlo distribuire uniformemente.
7. Esegui l'imaging microscopico con un obiettivo 100x utilizzando filtri a campo chiaro e a fluorescenza GFP.
   1. Innanzitutto, utilizzare il campo luminoso per focalizzare la cella con un obiettivo 100x utilizzando olio ad immersione. Utilizzare l'opzione di cattura dello schermo per generare le immagini utilizzando il programma.
   2. Passare a un filtro a fluorescenza GFP. Regolare il tempo di esposizione dell'immagine tra 50 ms e 300 ms per ottenere un'immagine chiara bilanciando il rapporto segnale/rumore. Cattura l'immagine dello schermo utilizzando il programma.
   3. Immagina molte celle da più punti piuttosto che da uno solo.
8. Analizzare le immagini contando la percentuale di cellule contenenti focolai di aggregati di α-sinucleina utilizzando software analitico. Osservare le differenze tra il segnale della proteina GFP solubile e il segnale GFP formato da focolai, nonché la diffusione della GFP con la forma variante A30P della α-sinucleina.
   NOTA: La formazione di focolai sarà osservata con le varianti wild-type, E46K e A53T della α-sinucleina.

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Risultati

L'alta espressione di α-sinucleina è nota per essere collegata alla morte delle cellule neuronali e alla malattia di Parkinson in sistemi modello di PD. Questo studio descrive tre metodi per monitorare la citotossicità della α-sinucleina e la formazione di focolai di α-sinucleina aggregata nel lievito. Qui, la α-sinucleina è stata sovraespressa nel lievito e sono stati esaminati i fenotipi della α-sinucleina wild-type e tre varianti della α-sinucleina note come mutanti familiari della malattia di Parkinson (

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Discussione

Data la complessità dei vari sistemi cellulari nell'uomo, è vantaggioso utilizzare il lievito come modello per lo studio delle malattie neurodegenerative umane. Sebbene sia quasi impossibile studiare le complesse interazioni cellulari del cervello umano usando il lievito, da una prospettiva monocellulare, le cellule di lievito hanno un alto livello di somiglianza con le cellule umane in termini di omologia della sequenza genomica e processi cellulari eucariotici fondamentali ^8,13

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00