Метод изучения токсичности и агрегации α-синуклеина с использованием гуманизированной дрожжевой модели

Резюме

Физиологическая модель in vivo α-синуклеина необходима для изучения и понимания патогенеза болезни Паркинсона. Описан метод мониторинга цитотоксичности и агрегатного образования α-синуклеина с использованием гуманизированной дрожжевой модели.

Аннотация

Болезнь Паркинсона является вторым наиболее распространенным нейродегенеративным расстройством и характеризуется прогрессирующей гибелью клеток, вызванной образованием клеток Леви, содержащих неправильно свернутые и агрегированные α-синуклеин. α-синуклеин является обильным пресинаптическим белком, который регулирует торговлю синаптическими пузырьками, но накопление его белковых включений приводит к нейротоксичности. Недавние исследования показали, что различные генетические факторы, включая бактериальные шапероны, могут уменьшить образование α-синуклеиновых агрегатов in vitro. Тем не менее, также важно контролировать антиагрегационный эффект в клетке, чтобы применять его в качестве потенциального лечения для пациентов. Было бы идеально использовать нейронные клетки, но с этими клетками трудно обращаться и требуется много времени, чтобы продемонстрировать фенотип антиагрегации. Поэтому для дальнейшей оценки антиагрегационной активности in vivo требуется быстрый и эффективный инструмент in vivo . Описанный здесь метод использовался для мониторинга и анализа антиагрегационного фенотипа в гуманизированных дрожжах Saccharomyces cerevisiae, которые экспрессировали человеческий α-синуклеин. Этот протокол демонстрирует инструменты in vivo , которые могут быть использованы для мониторинга клеточной токсичности, вызванной α-синуклеином, а также образования агрегатов α-синуклеина в клетках.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) является серьезной проблемой для стареющих обществ во всем мире. Агрегация α-синуклеина тесно связана с БП, а белковые агрегаты α-синуклеина широко используются в качестве молекулярного биомаркера для диагностики заболевания¹. α-синуклеин представляет собой небольшой кислый белок (140 аминокислот в длину) с тремя доменами, а именно N-концевым липидсвязывающим α-спирали, амилоид-связывающим центральным доменом (NAC) и С-концевым кислотным хвостом². Неправильное сворачивание α-синуклеина может происходить спонтанно и в конечном итоге приводит к образованию амилоидных агрегатов, называемых тельцами Леви³. α-синуклеин может способствовать патогенезу БП несколькими способами. В целом, считается, что его аномальные, растворимые олигомерные формы, называемые протофибриллами, являются токсичными видами, которые вызывают гибель нейрональных клеток, воздействуя на различные клеточные мишени, включая синаптическую функцию³.

Биологические модели, используемые для изучения нейродегенеративных заболеваний, должны иметь отношение к людям в отношении их генома и клеточной биологии. Лучшими моделями будут клеточные линии нейронов человека. Однако эти клеточные линии связаны с несколькими техническими проблемами, такими как трудности в поддержании культур, низкая эффективность трансфекции и высокие затраты⁴. По этим причинам требуется простой и надежный инструмент для ускорения прогресса в этой области исследований. Важно отметить, что инструмент должен быть простым в использовании для анализа собранных данных. С этой точки зрения широко используются различные модельные организмы, включая Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, дрожжи и грызунов⁵. Среди них дрожжи являются лучшим модельным организмом, потому что генетические манипуляции просты, и они дешевле, чем другие модельные организмы. Самое главное, дрожжи имеют большое сходство с человеческими клетками, такие как 60% гомология последовательности для человеческих ортологов и 25% близкая гомология с генами, связанными с человеческими заболеваниями⁶, и они также разделяют фундаментальную эукариотическую клеточную биологию. Дрожжи содержат много белков с аналогичными последовательностями и аналогичными функциями в клетках человека⁷. Действительно, дрожжи, экспрессирующие человеческие гены, широко использовались в качестве модельной системы для выяснения клеточных процессов⁸. Этот штамм дрожжей называется гуманизированными дрожжами и является полезным инструментом для изучения функции генов человека⁹. Гуманизированные дрожжи имеют преимущества для изучения генетических взаимодействий, потому что генетические манипуляции хорошо известны в дрожжах.

В этом исследовании мы использовали дрожжи Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма для изучения патогенеза БП, в частности, для изучения образования агрегатов α-синуклеина и цитотоксичности¹⁰. Для экспрессии α-синуклеина в почковых дрожжах штамм W303a использовался для трансформации с плазмидами, кодирующими дикий тип и семейные PD-ассоциированные варианты α-синуклеина. Поскольку штамм W303a имеет ауксотрофную мутацию на URA3, он применим для отбора клеток, содержащих плазмиды с URA3. Экспрессия α-синуклеина, закодированного в плазмиде, регулируется промотором GAL1 . Таким образом, уровень экспрессии α-синуклеина можно контролировать. Кроме того, слияние зеленого флуоресцентного белка (GFP) в С-концевой области α-синуклеина позволяет контролировать образование α-синуклеиновых очагов. Чтобы понять характеристики семейных PD-ассоциированных вариантов α-синуклеина, мы также экспрессировали эти варианты в дрожжах и изучили их клеточные эффекты. Эта система является простым инструментом для скрининга соединений или генов, проявляющих защитные роли против цитотоксичности α-синуклеина.

протокол

1. Подготовка носителей и решений

1. Подготовка СМИ
   1. Для приготовления среды YPD растворите 50 г порошка YPD в dH_2O, чтобы получить конечный объем 1 л. Автоклав для стерилизации. Хранить при комнатной температуре (RT).
   2. Чтобы сделать агар YPD средой, растворите 50 г порошка YPD и 20 г агара в 1 л dH₂O. Автоклав для стерилизации. После остывания вылейте на чашку Петри. Хранить при температуре 4 °C.
   3. Для получения СК с рафинозной (SRd)-Ura средой растворяют 6,7 г азотистого основания дрожжей с сульфатом аммония и без аминокислот в 795 мл dH₂O. Автоклав для стерилизации. Добавьте 100 мл 20% рафинозы, 5 мл 20% глюкозы и 100 мл 10x -Ura перед использованием.
   4. Для получения агаровой среды SD-Ura растворяют 6,7 г азотистой основы дрожжей с сульфатом аммония и без аминокислот и 20 г агара в 800 мл dH₂O. Автоклав в колбе объемом свыше 2 л. Добавьте 100 мл 20% глюкозы и 100 мл 10x-ura выпадения. Хорошо перемешать и вылить на посуду Петри. Хранить при температуре 4 °C.
   5. Для получения СК с галактозой (СГ)-Ура агаровой средой растворяют 6,7 г основания дрожжевого азота с сульфатом аммония и без аминокислот и 20 г агара в 800 мл dH₂O. Автоклав в колбе объемом свыше 2 л. Добавляют 100 мл 20% галактозы и 100 мл выпадения 10х-Ура. Хорошо перемешать и вылить на чашку Петри. Хранить при температуре 4 °C.
2. Стоковые решения для использования с SD-носителями
   1. Чтобы получить 20% источник углерода (глюкоза, галактоза и рафиноза), растворите 100 г глюкозы, галактозы или рафинозы в dH_2O, чтобы получить конечный объем 500 мл. Автоклав и магазин на RT.
   2. Чтобы сделать 10-кратные дрожжевые синтетические добавки без урацила (10x-Ura drop-out), растворите 19,2 г «дрожжевых синтетических добавок без урацила» в dH₂O, чтобы сделать окончательный объем 1 л. Автоклав и хранить в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления среды, содержащей агар, добавьте магнитный перемешивание в колбу, чтобы хорошо перемешать все растворы перед выливанием на чашку Петри.

2. Трансформация дрожжей

ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида pRS426 использовалась для клонирования гена α-синуклеина и содержала ген URA3 в качестве выбираемого маркера. Существуют семейные PD-ассоциированные варианты α-синуклеина, которые имеют тяжелые фенотипы заболевания (например, цитотоксичность). Эти варианты также использовались здесь для мониторинга их цитотоксичности и образования агрегированных очагов. Используйте одну и ту же колонию дрожжевых трансформантов для всех экспериментов, чтобы получить последовательные результаты.

1. Для трансформации плазмид экспрессии дрожжей используют пустой вектор (pRS426) в качестве контрольных и α-синуклеин-содержащих плазмид. Ссылаясь на стандартный способ¹¹ ацетата лития (LiAc), получают шесть компетентных клеток и 0,5 мкг каждой плазмиды и выполняют трансформацию.
2. Чтобы выбрать дрожжевые трансформанты, содержащие плазмиды, используйте синтетическую определенную среду (SD-среду) без урацила (SD-Ura) и инкубируйте пластины при 30 °C в течение 2-3 дней.
3. Нанесите три одиночные колонии на агаровую пластину SD-Ura для отбора клеток, содержащих плазмиды, для дальнейших экспериментов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить точные и надежные результаты, мы изучили по крайней мере три биологических репликата на штамм.

3. Споттинг-анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что экспрессия GFP-меченого α-синуклеина в плазмидах с высоким числом копий связана с цитотоксичностью в дрожжах¹⁰.

1. Инокулируют три пластырных дрожжевых трансформанта на штамм в 3 мл SRd-Ura для селективного роста дрожжей, содержащих плазмиды с 2% рафинозы для ингибирования индукции α-синуклеина под промотором GAL1 и 0,1% глюкозы. Инкубируют клеточную культуру при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно повторить все эксперименты с разными колониями. Получение одинаковых результатов из более чем трех независимых колоний означает, что результат является надежным.
2. На следующий день инокулируют культивируемые на ночь клетки в 3 мл свежего SRd-Ura до OD₆₀₀ 0,2 и инкубируют в течение 6 ч при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин.
3. Когда OD₆₀₀ достигнет 0,6-0,8, разбавьте клетки в 96-луночных пластинах для анализа пятнистости следующим образом.
   1. Измерьте OD₆₀₀ всех образцов и разбавьте образцы до OD₆₀₀ 0,5 со стерильным dH₂O (смешанный объем составляет 100 мкл) в полосе 1 96-луночной пластины для выравнивания количества клеток в каждой культуре.
   2. Выполняют пятикратное последовательное разведение дрожжевых клеток путем добавления 160 мкл стерильного dH_2Oк следующим пяти полосам. Обеспечьте общий объем 40 мкл при последовательном разбавлении ячеек в каждой полосе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкие коэффициенты разбавления могут привести к большим различиям между образцами. Для обеспечения равномерного перемешивания при выполнении последовательных разбавлений требуется достаточная пипетка. Наконечник пипетки должен быть заменен в каждой точке разбавления. В противном случае клетки, прикрепленные к поверхности наконечника, могут быть перенесены в следующую лунку и повлиять на номер ячейки.
4. Используйте многоканальную пипетку для переноса 10 мкл из каждой скважины, чтобы обнаружить образцы на агаровых пластинах SD-Ura для контроля и агаровых пластинах SG-Ura для мониторинга токсичности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины следует сушить до тех пор, пока пятнистые образцы не будут полностью поглощены пластинами.
5. Инкубируйте пятнистые пластины вверх ногами при 30 °C в течение 4 дней.
6. Делайте снимки пластин каждые 24 часа до 4-го дня, а затем анализируйте данные, сравнивая различия в росте между штаммами, замеченными глазом. Подсчитайте отдельные колонии в наиболее разбавленной пробе, рассчитайте количество жизнеспособных клеток в исходной культуре для каждого штамма или сравните размер отдельных колоний.

4. Измерение роста дрожжей с помощью микропластичного считывателя

1. Инокулируют три пластырных дрожжевых трансформанта на штамм в 3 мл SRd-Ura и инкубируют при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы понять каждый колониальный фенотип гуманизированного штамма дрожжей, экспрессирующего α-синуклеин, используйте одни и те же трансформанты для всех экспериментов.
2. На следующий день привите культивируемые на ночь клетки в общей сложности 200 мкл свежих SD-Ura и SG-Ura в 96-луночных пластинах. Отрегулируйте конечный объем, включая ячейки, до 200 мкл, а начальную ячейку OD₆₀₀ до 0,05.
   1. Отрегулируйте настройки программы в микротитровой пластине следующим образом: установите целевую температуру на 30°С, установите длительность встряхивания (линейной) на 890 с, установите амплитуду встряхивания (линейной) на 5 мм, установите интервальное время на 00:15:00, а измерение как поглощение на 600 нм.
   2. Инкубируйте пластину в течение 2-3 дней, чтобы все штаммы достигли стационарной фазы в считывателе микропластин.
3. Проанализируйте данные, построив кривую роста (например, с помощью Workbook). Получите точки данных путем усреднения значений поглощения от трех биологических реплик и укажите полосы ошибок. Используйте значение поглощения только из среды в качестве элемента управления и вычтите его из значений из культивируемых ячеек (необязательно).

5. Флуоресцентная микроскопия

1. Инокулируют пластырные дрожжевые трансформанты в 3 мл SRd-Ura и культивируют их в течение ночи при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения корреляции фенотипа с цитотоксичностью и образованием очагов используют для эксперимента те же колонии.
2. На следующий день реиртулируйте ночные культивируемые клетки в 3 мл свежего SRd-Ura до OD₆₀₀ 0,003. Инкубируют культуру до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигнет 0,2 при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин (~18 ч).
3. Когда достигается OD₆₀₀ 0,2, добавляют 300 мкл 20% галактозы, а затем инкубируют еще 6 ч при 30 °C при перемешивании при 200 об/мин.
4. Соберите клетки путем центрифугирования при 800 х г в течение 5 мин и выбросьте супернатант.
5. Осторожно повторно суспендировать гранулу ячейки в 30 мкл дистиллированной воды.
6. Загрузите 5 мкл повторно суспендированных ячеек на скользящее стекло. Приготовьте агарозную гелевую прокладку¹² и нанесите ее на нагруженные ячейки, чтобы она равномерно распределялась.
7. Выполняйте микроскопическую визуализацию со 100-кратным объективом, используя как ярко-полевые, так и GFP-флуоресцентные фильтры.
   1. Во-первых, используйте brightfield для фокусировки ячейки со 100-кратным объективом с помощью погружного масла. Используйте опцию захвата экрана для создания изображений с помощью программы.
   2. Переключитесь на GFP-флуоресцентный фильтр. Отрегулируйте время экспозиции изображения от 50 до 300 мс для получения четкого изображения путем балансировки отношения сигнал/шум. Захват экрана изображения с помощью программы.
   3. Визуализируйте много ячеек из нескольких точек, а не только из одной.
8. Анализируйте изображения, подсчитывая процент клеток, содержащих очаги агрегатов α-синуклеина с помощью аналитического программного обеспечения. Наблюдать различия между сигналом растворимого белка GFP и сигналом GFP, образованным фокусами, а также диффузию GFP с вариантной формой A30P α-синуклеина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образование очагов будет наблюдаться с дикими типами E46K и A53T α-синуклеина.

Результаты

Известно, что высокая экспрессия α-синуклеина связана с гибелью нейрональных клеток и БП в модельных системах БП. В данном исследовании описаны три метода мониторинга цитотоксичности α-синуклеина и образования очагов агрегированного α-синуклеина в дрожжах. Здесь α-синуклеин был чрезм...

Обсуждение

Учитывая сложность различных клеточных систем у человека, выгодно использовать дрожжи в качестве модели для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. Хотя почти невозможно исследовать сложные клеточные взаимодействия человеческого мозга с использованием дрожжей, с точки ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00