Um método para estudar a toxicidade e agregação da α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado

Resumo

Um modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína é necessário para estudar e entender a patogênese da doença de Parkinson. Descrevemos um método para monitorar a citotoxicidade e a formação de agregados de α-sinucleína usando um modelo de levedura humanizado.

Resumo

A doença de Parkinson é o segundo distúrbio neurodegenerativo mais comum e é caracterizada pela morte celular progressiva causada pela formação de corpos de Lewy contendo α-sinucleína mal dobrada e agregada. α-sinucleína é uma proteína pré-sináptica abundante que regula o tráfico de vesículas sinápticas, mas o acúmulo de suas inclusões proteicas resulta em neurotoxicidade. Estudos recentes revelaram que vários fatores genéticos, incluindo chaperonas bacterianas, poderiam reduzir a formação de agregados de α-sinucleína in vitro. No entanto, também é importante monitorar o efeito anti-agregação na célula para aplicá-lo como um tratamento potencial para os pacientes. Seria ideal usar células neuronais, mas essas células são difíceis de manusear e levam muito tempo para exibir o fenótipo anti-agregação. Portanto, uma ferramenta in vivo rápida e eficaz é necessária para a avaliação adicional da atividade antiagregação in vivo. O método aqui descrito foi utilizado para monitorar e analisar o fenótipo antiagregação na levedura humanizada Saccharomyces cerevisiae, que expressou α-sinucleína humana. Este protocolo demonstra ferramentas in vivo que poderiam ser usadas para monitorar a toxicidade celular induzida por α-sinucleína, bem como a formação de agregados de α-sinucleína nas células.

Introdução

A doença de Parkinson (DP) é um problema sério para as sociedades em envelhecimento em todo o mundo. A agregação de α-sinucleína está intimamente associada à DP, e agregados proteicos de α-sinucleína são amplamente utilizados como biomarcador molecular para o diagnóstico da doença¹. α-sinucleína é uma pequena proteína ácida (140 aminoácidos de comprimento) com três domínios, a saber, a α-hélice de ligação lipídica N-terminal, o domínio central de ligação a amiloide (NAC) e a cauda ácida C-terminal². O desdobramento da α-sinucleína pode ocorrer espontaneamente e, eventualmente, leva à formação de agregados amiloides chamados corpos de Lewy³. α-sinucleína pode contribuir para a patogênese da DP de várias maneiras. Em geral, pensa-se que suas formas oligoméricas anormais e solúveis chamadas protofibrilas são espécies tóxicas que causam a morte celular neuronal por afetar vários alvos celulares, incluindo a função sináptica³.

Os modelos biológicos utilizados para estudar doenças neurodegenerativas devem ser relevantes para os seres humanos no que diz respeito ao seu genoma e biologia celular. Os melhores modelos seriam linhagens celulares neuronais humanas. No entanto, essas linhagens celulares estão associadas a diversas questões técnicas, como dificuldades na manutenção das culturas, baixa eficiência da transfecção e alto gasto⁴. Por estas razões, é necessária uma ferramenta fácil e fiável para acelerar o progresso nesta área de investigação. É importante ressaltar que a ferramenta deve ser fácil de usar para analisar os dados coletados. A partir dessas perspectivas, vários organismos modelo têm sido amplamente utilizados, incluindo Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, leveduras e roedores⁵. Entre eles, a levedura é o melhor organismo modelo porque a manipulação genética é fácil e é mais barata do que os outros organismos modelo. Mais importante ainda, a levedura tem altas semelhanças com as células humanas, como 60% de homologia de sequência para ortólogos humanos e 25% de homologia próxima com genes relacionados a doenças humanas⁶, e eles também compartilham biologia celular eucariótica fundamental. A levedura contém muitas proteínas com sequências semelhantes e funções análogas às das células humanas⁷. De fato, leveduras que expressam genes humanos têm sido amplamente utilizadas como um sistema modelo para elucidar processos celulares⁸. Essa cepa de levedura é chamada de levedura humanizada e é uma ferramenta útil para explorar a função dos genes humanos⁹. A levedura humanizada tem mérito para estudar as interações genéticas porque a manipulação genética está bem estabelecida na levedura.

Neste estudo, utilizamos a levedura Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo para estudar a patogênese da DP, particularmente para investigar a formação de agregados de α-sinucleína e citotoxicidade¹⁰. Para a expressão de α-sinucleína na levedura em brotamento, a cepa W303a foi utilizada para transformação com plasmídeos codificando para as variantes de α-sinucleína associadas à DP selvagem e familiar. Como a cepa W303a tem uma mutação auxotrófica na URA3, ela é aplicável para a seleção de células contendo plasmídeos com URA3. A expressão de α-sinucleína codificada em um plasmídeo é regulada pelo promotor GAL1. Assim, o nível de expressão da α-sinucleína pode ser controlado. Além disso, a fusão da proteína verde fluorescente (GFP) na região C-terminal da α-sinucleína permite o monitoramento da formação de focos de α-sinucleína. Para entender as características das variantes familiares associadas à DP da α-sinucleína, também expressamos essas variantes em leveduras e examinamos seus efeitos celulares. Este sistema é uma ferramenta simples para a triagem de compostos ou genes que exibem papéis protetores contra a citotoxicidade da α-sinucleína.

Protocolo

1. Preparação de meios e soluções

1. Preparação para a mídia
   1. Para preparar o meio YPD, dissolver 50 g de pó de YPD em dH₂O para fazer um volume final de 1 L. Autoclave para esterilização. Armazenar à temperatura ambiente (RT).
   2. Para fazer meio de ágar YPD, dissolver 50 g de pó de YPD e 20 g de ágar em 1 L de dH₂O. Autoclave para esterilização. Depois de esfriar, despeje em placas de Petri. Conservar a 4 °C.
   3. Para fazer SC com meio de rafinose (SRd)-Ura, dissolver 6,7 g de levedura à base de nitrogênio com sulfato de amônio e sem aminoácidos em 795 mL de dH₂O. Autoclave para esterilização. Adicione 100 mL de 20% de raffinose, 5 mL de glicose a 20% e 100 mL de 10x -Ura drop-out antes do uso.
   4. Para fazer o meio de ágar SD-Ura, dissolver 6,7 g de levedura à base de nitrogênio com sulfato de amônio e sem aminoácidos e 20 g de ágar em 800 mL de dH 2 O. Autoclave em um frasco com volume superior a₂L. Adicionar 100 mL de glicose a 20% e 100 mL de 10x -Ura drop-out. Misture bem e despeje em placas de Petri. Conservar a 4 °C.
   5. Para confeccionar SC com meio ágar galactose (SG)-Ura, dissolver 6,7 g de levedura à base de nitrogênio com sulfato de amônio e sem aminoácidos e 20 g de ágar em 800 mL de dH 2 O. Autoclave em frasco com volume superior a₂L. Adicionar 100 mL de galactose a 20% e 100 mL de gota de 10x -Ura. Misture bem e despeje em placas de Petri. Conservar a 4 °C.
2. Soluções de estoque para usar com mídia SD
   1. Para fazer uma fonte de carbono a 20% (glicose, galactose e rafinose), dissolva 100 g de glicose, galactose ou rafinose em dH₂O para produzir um volume final de 500 mL. Autoclave e loja na RT.
   2. Para fazer 10x levedura sintética drop-out suplementos médios sem uracilo (10x-Ura drop-out), dissolver 19,2 g de "levedura sintética drop-out meio suplementos sem uracila" em dH₂O para fazer um volume final de 1 L. Autoclave e armazenar em RT.
      NOTA: Para a preparação de um meio contendo ágar, adicionar uma barra de agitação magnética ao balão para misturar bem todas as soluções antes de derramar sobre placas de Petri.

2. Transformação de leveduras

NOTA: O plasmídeo pRS426 foi usado para clonar o gene α-sinucleína e continha o gene URA3 como um marcador selecionável. Existem variantes familiares associadas à DP de α-sinucleína que têm fenótipos graves da doença (por exemplo, citotoxicidade). Essas variantes também foram usadas aqui para monitorar sua citotoxicidade e formação de focos agregados. Use a mesma colônia de transformadores de levedura para todos os experimentos para obter resultados consistentes.

1. Para a transformação dos plasmídeos de expressão de leveduras, use um vetor vazio (pRS426) como plasmídeos de controle e α contendo sinucleína. Referindo-se ao método padrão de acetato de lítio (LiAc)¹¹, prepare seis células competentes e 0,5 μg de cada plasmídeo e realize a transformação.
2. Para selecionar transformadores de levedura contendo plasmídeos, use o meio sintético definido (meio SD) sem uracilo (SD-Ura) e incube as placas a 30 °C por 2-3 dias.
3. Colocar três colônias únicas em uma placa de ágar SD-Ura para a seleção de células contendo plasmídeos para experimentos futuros.
   NOTA: Para gerar resultados precisos e confiáveis, examinamos pelo menos três replicações biológicas por cepa.

3. Ensaio de detecção

NOTA: Sabe-se que a expressão de α-sinucleína marcada com GFP em plasmídeos de alto número de cópias está associada à citotoxicidade em leveduras¹⁰.

1. Inocular os três transformadores de levedura remendados por cepa em 3 mL de SRd-Ura para o crescimento seletivo de leveduras contendo os plasmídeos com rafinose a 2% para inibição da indução de α-sinucleína sob o promotor GAL1 e glicose a 0,1%. Incubar a cultura celular a 30 °C sob agitação a 200 rpm.
   NOTA: Repetir todos os experimentos com diferentes colônias é importante. Obter os mesmos resultados de mais de três colônias independentes significa que o resultado é confiável.
2. No dia seguinte, inocular as células cultivadas durante a noite em 3 mL de SRd-Ura fresco a uma OD₆₀₀ de 0,2 e incubar por 6 h a 30 °C sob agitação a 200 rpm.
3. Quando a OD₆₀₀ atingir 0,6-0,8, dilua as células em placas de 96 poços para o ensaio de mancha da seguinte forma.
   1. Medir a OD 600 de todas as amostras e diluir as amostras para uma OD₆₀₀ de 0,5 com dH₂O estéril (o volume misto é de₁₀₀ μL) na faixa 1 de uma placa de 96 poços para equalizar o número de células em cada cultura.
   2. Efectuar diluições em série de cinco vezes das células de levedura adicionando 160 μL de dH₂O estéril às cinco vias seguintes. Assegurar um volume total de 40 μL ao diluir em série as células em cada faixa.
      NOTA: Baixos fatores de diluição podem produzir maiores diferenças entre as amostras. É necessária pipetagem suficiente para garantir uma mistura uniforme ao realizar as diluições em série. A ponta da pipeta deve ser substituída em cada ponto de diluição. Caso contrário, as células ligadas à superfície da ponta podem ser transferidas para o próximo poço e afetar o número de células.
4. Use uma pipeta multicanal para transferir 10 μL de cada poço para detectar as amostras em placas de ágar SD-Ura para os controles e placas de ágar SG-Ura para monitorar a toxicidade.
   NOTA: As placas devem ser secas até que as amostras manchadas sejam totalmente absorvidas pelas placas.
5. Incubar as placas manchadas de cabeça para baixo a 30 °C durante 4 dias.
6. Tire imagens das placas a cada 24 horas até o dia 4 e, em seguida, analise os dados comparando as diferenças de crescimento entre as cepas detectadas pelo olho. Conte as colônias individuais na amostra mais diluída, calcule o número de células viáveis na cultura original para cada cepa ou compare o tamanho das colônias individuais.

4. Medição do crescimento de leveduras usando um leitor de microplacas

1. Inocular os três transformadores de levedura remendados por cepa em 3 mL de SRd-Ura e incubar a 30 °C sob agitação a 200 rpm durante a noite.
   NOTA: Para entender cada fenótipo de colônia da cepa de levedura humanizada que expressa α-sinucleína, use os mesmos transformadores para todos os experimentos.
2. No dia seguinte, inocular as células cultivadas durante a noite em um total de 200 μL de SD-Ura e SG-Ura frescos em placas de 96 poços. Ajuste o volume final, incluindo as células, para 200 μL e ajuste a célula inicial OD₆₀₀ para 0,05.
   1. Ajuste as configurações do programa na placa de microtitulação da seguinte forma: defina a temperatura alvo para 30 ° C, defina a duração da agitação (linear) para 890 s, defina a amplitude de agitação (linear) para 5 mm, defina o tempo de intervalo para 00:15:00 e defina a medição como absorbância a 600 nm.
   2. Incube a placa por 2-3 dias para que todas as cepas atinjam a fase estacionária em um leitor de microplacas.
3. Analise os dados plotando a curva de crescimento (por exemplo, usando a pasta de trabalho). Adquira os pontos de dados calculando a média dos valores de absorbância das três replicações biológicas e indique as barras de erro. Use o valor da absorvância apenas de meio como um controle e subtraia-o dos valores das células cultivadas (opcional).

5. Microscopia de fluorescência

1. Inocular os transformadores de levedura remendados em 3 mL de SRd-Ura e cultivá-los durante a noite a 30 °C sob agitação a 200 rpm.
   NOTA: Para determinar a correlação do fenótipo com a citotoxicidade e a formação de focos, use as mesmas colônias para o experimento.
2. No dia seguinte, reinocule as células cultivadas durante a noite em 3 mL de SRd-Ura fresco a um OD_{600 de 0,003} . Incubar a cultura até que a OD 600 atinja 0,2 a 30 °C sob agitação a₂₀₀ rpm (~18 h).
3. Quando for alcançada uma OD₆₀₀ de 0,2, adicionar 300 μL de galactose a 20% e, em seguida, incubar por mais 6 h a 30 °C sob agitação a 200 rpm.
4. Recolher as células por centrifugação a 800 x g durante 5 min e eliminar o sobrenadante.
5. Ressuscite o pellet celular suavemente em 30 μL de água destilada.
6. Carregue 5 μL das células ressuspensas em um vidro deslizante. Prepare uma almofada de gel de agarose¹² e coloque-a nas células carregadas para que ela se espalhe uniformemente.
7. Realize imagens microscópicas com uma objetiva de 100x usando filtros de campo brilhante e fluorescência GFP.
   1. Primeiro, use o campo brilhante para focar a célula com uma objetiva de 100x usando óleo de imersão. Use a opção de captura de tela para gerar as imagens usando o programa.
   2. Alterne para um filtro de fluorescência GFP. Ajuste o tempo de exposição da imagem para entre 50 ms e 300 ms para obter uma imagem clara, equilibrando a relação sinal-ruído. Captura de tela da imagem usando o programa.
   3. Imagine muitas células de vários pontos, em vez de apenas um.
8. Analise as imagens contando a porcentagem de células contendo focos de agregados de α-sinucleína usando um software analítico. Observe as diferenças entre o sinal da proteína GFP solúvel e o sinal GFP formado por focos, bem como a difusão da GFP com a forma variante A30P de α-sinucleína.
   NOTA: A formação de focos será observada com as variantes do tipo selvagem, E46K e A53T da α-sinucleína.

Resultados

A alta expressão de α-sinucleína é conhecida por estar ligada à morte celular neuronal e à DP em sistemas modelo de DP. Este estudo descreve três métodos para monitorar a citotoxicidade da α-sinucleína e a formação de focos de α-sinucleína agregada em leveduras. Aqui, a α-sinucleína foi superexpressa em levedura, e os fenótipos de sinucleína α selvagem e três variantes de α-sinucleína conhecidas como mutantes familiares da DP foram examinados (Figura 1 e Tabela ...

Discussão

Dada a complexidade de vários sistemas celulares em humanos, é vantajoso usar levedura como modelo para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Embora seja quase impossível investigar as complexas interações celulares do cérebro humano usando leveduras, a partir de uma perspectiva unicelular, as células de levedura têm um alto nível de semelhança com as células humanas em termos de homologia da sequência genômica e processos celulares eucarióticos fundamentais ^8,13

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00