שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

Summary

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

Abstract

מחלת פרקינסון היא ההפרעה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה ומאופיינת במוות תאי מתקדם הנגרם על ידי היווצרות גופי לוי המכילים α-סינוקלאין מקופלים ומצטברים. α-סינוקלאין הוא חלבון קדם-סינפטי בשפע המווסת את הסחר בשלפוחית הסינפטית, אך הצטברות התכלילים החלבניים שלו גורמת לרעילות עצבית. מחקרים אחרונים גילו כי גורמים גנטיים שונים, כולל מלווים חיידקיים, עשויים להפחית את היווצרותם של אגרגטים α-סינוקלאין במבחנה. עם זאת, חשוב גם לעקוב אחר אפקט אנטי צבירה בתא כדי ליישם את זה כטיפול פוטנציאלי עבור החולים. זה יהיה אידיאלי להשתמש בתאים עצביים, אבל תאים אלה קשה לטפל ולוקח הרבה זמן להציג את הפנוטיפ נגד צבירה. לכן, נדרש כלי in vivo מהיר ויעיל להערכה נוספת של פעילות אנטי-צבירה in vivo . השיטה המתוארת כאן שימשה לניטור וניתוח הפנוטיפ האנטי-צבירה בשמרים האנושיים Saccharomyces cerevisiae, שביטאו α-סינוקלאין אנושיים. פרוטוקול זה מדגים כלי in vivo שיכולים לשמש לניטור רעילות תאית הנגרמת על-ידי α-סינוקלאין, כמו גם להיווצרות אגרגטים α-סינוקלאין בתאים.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD) היא בעיה רצינית עבור חברות מזדקנות ברחבי העולם. הצבירה של α-סינוקלאין קשורה קשר הדוק למחלת פרקינסון, ואגרגטים חלבוניים של α-סינוקלאין נמצאים בשימוש נרחב כסמן ביולוגי מולקולרי לאבחון המחלה¹. α-סינוקלאין הוא חלבון חומצי קטן (140 חומצות אמינו באורך) בעל שלושה תחומים, כלומר סליל α קושר שומנים N, התחום המרכזי קושר עמילואיד (NAC) והזנב החומצי C-terminal². קיפול שגוי של α-סינוקלאין יכול להתרחש באופן ספונטני ובסופו של דבר מוביל להיווצרות של אגרגטים עמילואידים הנקראים גופי לוי³. α-סינוקלאין עשוי לתרום לפתוגנזה של מחלת פרקינסון במספר דרכים. באופן כללי, הוא חשב כי צורות אוליגומריות חריגות ומסיסות הנקראות פרוטופיברילים הן מינים רעילים הגורמים למוות של תאי עצב על ידי השפעה על מטרות תאיות שונות, כולל תפקוד סינפטי³.

המודלים הביולוגיים המשמשים לחקר מחלות נוירודגנרטיביות חייבים להיות רלוונטיים לבני אדם ביחס לגנום ולביולוגיה התאית שלהם. המודלים הטובים ביותר יהיו קווי תאים עצביים אנושיים. עם זאת, קווי תאים אלה קשורים למספר בעיות טכניות, כגון קשיים בתחזוקת תרביות, יעילות נמוכה של טרנספקציה והוצאות גבוהות⁴. מסיבות אלה נדרש כלי קל ואמין להאצת ההתקדמות בתחום מחקר זה. חשוב לציין, הכלי צריך להיות קל לשימוש לניתוח הנתונים שנאספו. מנקודות מבט אלה, אורגניזמי מודל שונים היו בשימוש נרחב, כולל דרוזופילה, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, שמרים ומכרסמים⁵. ביניהם, שמרים הוא אורגניזם המודל הטוב ביותר כי מניפולציה גנטית היא קלה, וזה זול יותר מאשר אורגניזמים מודל אחרים. והכי חשוב, לשמרים יש קווי דמיון גבוהים לתאים אנושיים, כגון 60% הומולוגיה של רצף לאורתולוגים אנושיים ו-25% הומולוגיה קרובה עם גנים הקשורים למחלות אנושיות⁶, והם גם חולקים ביולוגיה בסיסית של התא האאוקריוטי. שמרים מכילים חלבונים רבים בעלי רצפים דומים ותפקודים מקבילים לאלה שבתאים אנושיים⁷. ואכן, שמרים המבטאים גנים אנושיים נמצאים בשימוש נרחב כמערכת מודל להבהרת תהליכים תאיים⁸. זן שמרים זה נקרא שמרים אנושיים והוא כלי שימושי לחקר תפקודם של גנים אנושיים⁹. לשמרים אנושיים יש יתרון בחקר אינטראקציות גנטיות מכיוון שמניפולציה גנטית מבוססת היטב בשמרים.

במחקר זה השתמשנו בשמרים Saccharomyces cerevisiae כאורגניזם מודל לחקר הפתוגנזה של מחלת פרקינסון, במיוחד לחקר היווצרות אגרגטים α-סינוקלאין וציטוטוקסיות¹⁰. לביטוי של α-סינוקלאין בשמרים הניצנים, זן W303a שימש לטרנספורמציה עם קידוד פלסמידים עבור גרסאות PD מסוג בר ומשפחתיות של α-סינוקלאין. מכיוון שלזן W303a יש מוטציה אוקסוטרופית ב-URA3, הוא ישים לבחירת תאים המכילים פלסמידים עם URA3. הביטוי של α-סינוקלאין המקודד בפלסמיד מוסדר תחת מקדם GAL1. לפיכך, ניתן לשלוט ברמת הביטוי של α-סינוקלאין. בנוסף, היתוך של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) באזור C-terminal של α-סינוקלאין מאפשר ניטור של היווצרות מוקדי α-סינוקלאין. כדי להבין את המאפיינים של הווריאנטים המשפחתיים הקשורים ל-PD של α-סינוקלאין, ביטאנו את הווריאנטים האלה גם בשמרים ובחנו את ההשפעות התאיות שלהם. מערכת זו היא כלי פשוט לסינון תרכובות או גנים המציגים תפקידי הגנה מפני ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין.

Protocol

1. הכנת מדיה ופתרונות

1. היערכות למדיה
   1. כדי להכין מדיום YPD, יש להמיס 50 גרם של אבקת YPD ב-dH₂O כדי ליצור נפח סופי של 1 ליטר. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
   2. כדי להפוך את האגר של YPD לבינוני, יש להמיס 50 גרם אבקת YPD ו-20 גרם אגר ב-1 ליטר של dH₂O. Autoclave לעיקור. לאחר שהתקרר, יוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   3. כדי ליצור SC עם רפינוז (SRd)-Ura בינוני, להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום סולפט וללא חומצות אמינו ב 795 מ"ל של dH₂O. Autoclave לעיקור. לפני השימוש יש להוסיף 100 מ"ל של 20% רפינוז, 5 מ"ל של 20% גלוקוז ו-100 מ"ל של 10x -Ura לפני השימוש.
   4. כדי להפוך את SD-Ura אגר למדיום, להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום גופרתי וללא חומצות אמינו ו 20 גרם של אגר ב 800 מ"ל של dH 2 O. Autoclave בבקבוק עם נפח מעל₂L. להוסיף 100 מ"ל של 20% גלוקוז ו 100 מ"ל של 10x -Ura נשירה. מערבבים היטב ויוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. כדי ליצור SC עם מדיום גלקטוז (SG)-Ura agar, יש להמיס 6.7 גרם של בסיס חנקן שמרים עם אמוניום גופרתי וללא חומצות אמינו ו-20 גרם אגר ב-800 מ"ל של dH 2 O. Autoclave בבקבוק עם נפח מעל₂L. הוסף 100 מ"ל של 20% גלקטוז ו-100 מ"ל של 10x -Ura נשירה. מערבבים היטב ויוצקים על צלחות פטרי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. מלאי פתרונות לשימוש עם מדיית SD
   1. כדי ליצור מקור פחמן של 20% (גלוקוז, גלקטוז ורפינוז), יש להמיס 100 גרם של גלוקוז, גלקטוז או רפינוז ב-dH₂O כדי ליצור נפח סופי של 500 מ"ל. אוטוקלאב וחנות ב-RT.
   2. כדי להכין 10x שמרים סינתטיים שנשרו תוספים בינוניים ללא אורציל (נשירה של 10x-Ura), יש להמיס 19.2 גרם של "שמרים סינתטיים שנשרים מתוספי תזונה בינוניים ללא אורציל" ב-dH₂O כדי ליצור נפח סופי של 1 ל' אוטוקלאב ולאחסן ב-RT.
      הערה: להכנת אגר בינוני, הוסיפו לבקבוקון מוט ערבוב מגנטי כדי לערבב את כל התמיסות היטב לפני שאתם מוזגים על צלחות פטרי.

2. טרנספורמציה של שמרים

הערה: פלסמיד pRS426 שימש לשכפול הגן α-סינוקלאין והכיל את הגן URA3 כסמן הניתן לבחירה. ישנן גרסאות משפחתיות הקשורות ל-PD של α-סינוקלאין שיש להן פנוטיפים של מחלות קשות (למשל, ציטוטוקסיות). גרסאות אלה שימשו כאן גם כדי לעקוב אחר הציטוטוקסיות שלהם והיווצרות מוקדים מצטברים. השתמש באותה מושבה של טרנספורמנטים של שמרים עבור כל הניסויים כדי לקבל תוצאות עקביות.

1. לטרנספורמציה של פלסמידי ביטוי השמרים, השתמש בווקטור ריק (pRS426) כבקרה ופלסמידים המכילים α סינוקלאין. בהתייחס לשיטת ליתיום אצטט סטנדרטית (LiAc)¹¹, הכינו שישה תאים מוכשרים ו-0.5 מיקרוגרם מכל פלסמיד, ובצעו את הטרנספורמציה.
2. כדי לבחור עבור טרנספורמנטים של שמרים המכילים פלסמידים, השתמש במדיום המוגדר הסינתטי (מדיום SD) ללא אורציל (SD-Ura), ודגר את הצלחות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים.
3. תיקון שלוש מושבות בודדות על צלחת אגר SD-Ura לבחירת תאים המכילים פלסמידים לניסויים נוספים.
   הערה: כדי להפיק תוצאות מדויקות ואמינות, בחנו לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים לכל זן.

3. בדיקת איתור

הערה: הביטוי של α-סינוקלאין המתויג כ-GFP בפלסמידים בעלי מספר עותקים גבוה ידוע כקשור לציטוטוקסיות בשמרים¹⁰.

1. יש לחסן את שלושת הטרנספורמנטים המתוקנים של שמרים לכל זן ל-3 מ"ל של SRd-Ura לצמיחה סלקטיבית של שמרים המכילים את הפלסמידים עם 2% רפינוז לעיכוב השראת α-סינוקלאין תחת מקדם GAL1 ו-0.1% גלוקוז. לדגום את תרבית התאים ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד.
   הערה: חשוב לחזור על כל הניסויים עם מושבות שונות. קבלת אותן תוצאות מיותר משלוש מושבות עצמאיות פירושה שהתוצאה אמינה.
2. למחרת, יש לחסן את התאים בתרבית לילה ל-3 מ"ל של SRd-Ura טרי_{ל-OD 600} של 0.2, ולדגירה במשך 6 שעות ב-30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד.
3. כאשר OD₆₀₀ מגיע ל-0.6-0.8, דילל את התאים בלוחות 96-well לצורך בדיקת התצפית באופן הבא.
   1. מדוד את OD 600 של כל הדגימות, ודלל את הדגימות ל- OD 600 של 0.5 עם dH₂O סטרילי (הנפח המעורב הוא₁₀₀ μL) בנתיב 1 של צלחת 96 באר כדי להשוות את מספר התאים בכל תרבית.
   2. בצע דילול סדרתי של פי חמישה של תאי השמרים על ידי הוספת 160 μL של dH₂O סטרילי לחמשת הנתיבים הבאים. ודא נפח כולל של 40 μL בעת דילול סדרתי של התאים בכל נתיב.
      הערה: גורמי דילול נמוכים יכולים ליצור הבדלים גדולים יותר בין הדגימות. נדרש פיפטינג מספיק כדי להבטיח ערבוב אחיד בעת ביצוע דילולים סדרתיים. יש להחליף את קצה הפיפטה בכל נקודת דילול. אחרת, התאים המחוברים לפני השטח של הקצה יכולים להיות מועברים לבאר הבאה ולהשפיע על מספר התא.
4. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 10 μL מכל באר כדי לאתר את הדגימות על לוחות אגר SD-Ura עבור הבקרות ולוחות אגר SG-Ura כדי לנטר רעילות.
   הערה: יש לייבש את הצלחות עד שהדגימות המנומרות נספגות במלואן על הצלחות.
5. לדגום את הלוחות המנומרים הפוך ב 30 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים.
6. צלם תמונות של הצלחות כל 24 שעות עד יום 4, ולאחר מכן נתח את הנתונים על ידי השוואת הבדלי הצמיחה בין זנים שזוהו על ידי העין. ספרו את המושבות הבודדות בדגימה המדוללת ביותר, חשבו את מספר התאים בני הקיימא בתרבית המקורית עבור כל זן, או השוו את גודל המושבות הבודדות.

4. מדידת צמיחת שמרים באמצעות קורא מיקרו-פלטות

1. יש לחסן את שלושת הטרנספורמטורים של השמרים המתוקנים לכל זן ל-3 מ"ל של SRd-Ura, ולדגור בטמפרטורה של 30°C תחת תסיסה ב-200 סל"ד למשך הלילה.
   הערה: כדי להבין כל פנוטיפ מושבה של זן השמרים האנושי המבטא α-סינוקלאין, השתמש באותם טרנספורמנטים עבור כל הניסויים.
2. למחרת, יש לחסן את התאים בתרבית לילה ל-200 מיקרו-ליטר של SD-Ura ו-SG-Ura טריים ב-96 צלחות באר. התאם את עוצמת הקול הסופית, כולל התאים, ל- 200 μL, וכוונן את OD₆₀₀ של התא הראשוני ל- 0.05.
   1. התאם את הגדרות התוכנית בלוח המיקרוטיטר באופן הבא: הגדר את טמפרטורת היעד ל -30 ° צלזיוס, הגדר את משך הניעודה (ליניארי) ל -890 שניות, הגדר את משרעת הרעד (ליניארית) ל -5 מ"מ, הגדר את זמן המרווח ל- 00:15:00 והגדר את המדידה כספיגה ב- 600 ננומטר.
   2. דגירה של הצלחת במשך 2-3 ימים כדי שכל הזנים יגיעו לשלב הנייח בקורא מיקרו-לוחות.
3. נתח את הנתונים על-ידי התוויית עקומת הצמיחה (לדוגמה, באמצעות חוברת עבודה). השג את נקודות הנתונים על ידי ממוצע ערכי הספיגה משלושת המשכפלים הביולוגיים, וציין את פסי השגיאה. השתמש בערך הספיגה ממדיה בלבד כפקד, והפחת זאת מהערכים מתאים בתרבית (אופציונלי).

5. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. לחסן את השמרים המתוקנים ל-3 מ"ל של SRd-Ura, ולתרבת אותם במשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב-200 סל"ד.
   הערה: כדי לקבוע את המתאם של הפנוטיפ עם ציטוטוקסיות והיווצרות מוקדים, השתמש באותן מושבות לניסוי.
2. למחרת, יש לחסן מחדש את התאים בתרבית לילה ל-3 מ"ל של SRd-Ura טרי ל-OD_{600 של 0.003} . לדגור את התרבות עד OD 600 מגיע 0.2 ב 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה ב₂₀₀ סל"ד (~ 18 שעות).
3. כאשר OD 600 של 0.2 מושגת, להוסיף 300 μL של 20% גלקטוז, ולאחר מכן דגירה במשך 6 שעות נוספות ב 30 °C תחת תסיסה ב₂₀₀ סל"ד.
4. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant.
5. יש למרוח את כדור התא בעדינות ב-30 μL של מים מזוקקים.
6. טען 5 μL של התאים המחיים על זכוכית שקופית. הכינו פד ג'ל אגרוז¹² והניחו אותו על התאים הטעונים כדי לגרום לו להתפשט באופן שווה.
7. בצע הדמיה מיקרוסקופית עם מטרה של פי 100 באמצעות מסנני שדה בהיר ו-GFP-פלואורסצנטי.
   1. ראשית, השתמש ב-brightfield כדי למקד את התא עם מטרה של פי 100 באמצעות שמן טבילה. השתמש באפשרות לכידת המסך ליצירת התמונות באמצעות התוכנית.
   2. עבור למסנן GFP-פלואורסצנציה. התאם את זמן החשיפה של התמונה ל-50 אלפיות השנייה עד 300 אלפיות השנייה כדי להשיג תמונה ברורה על-ידי איזון יחס האות לרעש. לכידת מסך את התמונה באמצעות התוכנית.
   3. צלם תאים רבים מנקודות מרובות ולא רק מנקודה אחת.
8. נתח את התמונות על ידי ספירת אחוז התאים המכילים מוקדים של אגרגטים α-סינוקלאין באמצעות תוכנה אנליטית. שימו לב להבדלים בין אות החלבון המסיס של GFP לבין אות ה-GFP שנוצר על ידי מוקדים, כמו גם את הדיפוזיה של GFP עם הצורה של גרסת A30P של α-סינוקלאין.
   הערה: היווצרות מוקדים תיצפה עם גרסאות מסוג בר, E46K ו-A53T של α-סינוקלאין.

תוצאות

הביטוי הגבוה של α-סינוקלאין ידוע כקשור למוות תאי עצב ולפרקינסון במערכות מודל של מחלת פרקינסון. מחקר זה מתאר שלוש שיטות לניטור ציטוטוקסיות של α-סינוקלאין והיווצרות מוקדים של α-סינוקלאין מצטברים בשמרים. כאן, הסינוקלאין α התבטא יתר על המידה בשמרים, ונבחנו הפנוטיפים של α-סינוקלאין מסוג בר ושל...

Discussion

בהתחשב במורכבות של מערכות תאיות שונות בבני אדם, כדאי להשתמש בשמרים כמודל לחקר מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות. למרות שכמעט בלתי אפשרי לחקור את האינטראקציות התאיות המורכבות של המוח האנושי באמצעות שמרים, מנקודת מבט של תא בודד, לתאי שמרים יש רמה גבוהה של דמיון לתאים אנושיים במונחים של הומולוג...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well plate	SPL	30096
Agarose	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Gas permeable sealing membrane for microtiter plates
cover glasses	Marienfeld		24 x 60 mm
Culture tube	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galactose	sigma	G0625
D-(+)-Glucose	sigma	G8270
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Daejung	6638-4105
Incubator (shaking)	Labtron		model: SHI1
Incubator (static)	Vision scientific		model: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Microplate reader	Tecan	30050303 01	Model: Infinite 200 pro
multichannel pipette 20-200 µL	gilson	FA10011
multichannel pipette 2-20 µL	gilson	FA10009
Olympus microscope	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	average mol wt 3,350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Reservoir	SPL	23050
Spectrophotometer	eppendorf	6131 05560
W303a			Present from James Bardwell
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00