Esterilización por radiación gamma de baja dosis para injertos traqueales descelularizados

Resumen

La esterilización es esencial para el trasplante de tejido traqueal. En este documento, presentamos un protocolo de esterilización utilizando irradiación gamma de baja dosis que es totalmente tolerada por los órganos.

Resumen

Uno de los principales aspectos clave para asegurar que un trasplante evoluciona correctamente es la esterilidad del medio. El trasplante traqueal descelularizado implica implantar un órgano que originalmente estaba en contacto con el medio ambiente, por lo que no es estéril desde el principio. Si bien el protocolo de descelularización (a través de la exposición con detergente [dodecil sulfato de sodio al 2%, agitación continua y choques osmóticos) se lleva a cabo de acuerdo con las medidas asépticas, no proporciona esterilización. Por lo tanto, uno de los principales desafíos es garantizar la esterilidad previa a la implantación in vivo . Aunque existen protocolos establecidos de esterilización por radiación gamma para materiales inorgánicos, no existen tales medidas para materiales orgánicos. Además, los protocolos establecidos para materiales inorgánicos no se pueden aplicar a materiales orgánicos, ya que la dosis de radiación establecida (25 kGy) destruiría completamente el implante. Este artículo estudia el efecto de una dosis de radiación escalada en una tráquea de conejo descelularizada. Mantuvimos el rango de dosis (kGy) y probamos las dosis escalonadas hasta encontrar la dosis mínima a la que se logra la esterilización. Después de determinar la dosis, estudiamos los efectos de la misma en el órgano, tanto histológica como biomecánicamente. Determinamos que mientras 0,5 kGy no alcanzaban la esterilidad, las dosis de 1 kGy y 2 kGy sí lo hacían, siendo 1 kGy, por lo tanto, la dosis mínima necesaria para lograr la esterilización. Los estudios microscópicos no mostraron cambios relevantes en comparación con los órganos no esterilizados. Las características biomecánicas axiales no se alteraron en absoluto, y solo se observó una ligera reducción en la fuerza por unidad de longitud que el órgano puede tolerar radialmente. Por lo tanto, podemos concluir que 1 kGy logra la esterilización completa de la tráquea de conejo descelularizada con un efecto mínimo, si es que tiene alguno, en el órgano.

Introducción

La esterilización de un implante es un requisito básico para su viabilidad; De hecho, las prótesis que han demostrado ser exitosas son aquellas implantadas en áreas estériles (vasos sanguíneos, corazón, hueso, etc.) ¹. La tráquea tiene dos superficies: una superficie en contacto con el ambiente externo, que por lo tanto no es estéril, y una superficie hacia el mediastino, que es estéril. Por lo tanto, desde el momento en que se extrae la tráquea, no es un órgano estéril. A pesar de que el proceso de descelularización posterior se lleva a cabo en condiciones máximas estériles, no es una etapa de esterilización². La implan....

Protocolo

Se adhirió a la directiva europea 20170/63/UE para el cuidado y uso de animales de laboratorio y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universitat de València (Ley 86/609/CEE y 214/1997 y Código 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 de la Generalitat Valenciana, España).

1. Descelularización traqueal

NOTA: El método de descelularización ha sido reportado en otra parte²⁰.

1. Eutanasia a conejos blancos adultos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus) que pesan 3.5-4.1 kg con 133 mg/kg de pentobarbital sódico, usando una inyección de 200 mg/ml ....

Resultados

Descelularización
La tinción DAPI muestra la ausencia de ADN, y no se detectaron valores de ADN superiores a 50 ng en ninguna de las tráqueas por electroforesis, siendo todos los fragmentos menores de 200 pb²⁰.

Cultivo microbiano
Dos de las ocho piezas sometidas a 0,5 kGy mostraron cambio de color en menos de 1 semana. Ninguna de las piezas irradiadas a 1 kGy y 2 kGy mostró ningún cambio de color (Figura .......

Discusión

Existen varias estrategias de esterilización. El_CO2supercrítico penetra completamente en los tejidos, acidificando el medio y deconstruyendo la bicapa de fosfolípidos celulares con eliminación simple mediante la despresurización del implante ^8,14,25. También se ha utilizado radiación ultravioleta y se ha publicado su efectividad en la tráquea de roedores, aunque hay pocos relatos en la literatura

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 nylon monofilament suture	Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA	SN-5698G
Amphotericin B 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15290018
Bioanalyzer	Agilent, Santa Clara, CA, USA	G2939BA
Buprenorphine	Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido	N02AE01
Compression desktop UTM	Microtest, Madrid, Spain	EM1/10/FR
Cryostate	Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3059
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)	DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich; MO, USA	D2650
DMEM	Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA	11965084
DNA extraction kit	DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany	4368814
Enrofloxacin, 2.5%	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain	SH20898.03IR
Fluorescence microscope	Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)	DM2500??
Freezing Container	Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain	5100-0001
Isofluorane	Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain	8.43603E+12
Ketamin	Imalgene. Merial; Toulouse, Francia	BOE127823
Linear accelerator	"True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA	H191001
Magnetic stirrer	Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia	BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	6283-MV
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Fischer Scientific, Madrid, Spain	12678646
Penicillin-streptomycin 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15140122
Pentobarbital sodium	Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España	3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	P2272
Propofol	Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania	G 151030
Proteinase K	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA	S3020
PVC hollow tubes	Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy	hhdddyyZ
PVC stent	ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey	019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core	R Foundation for Statistical Computing	R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	8,17,034
Spectrophotometer	Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands	ND-ONEC-W
Spreadsheet	Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA	2864993241
Traction Universal Testing Machine	Testing Machines, Veenendaal, Netherlands	84-01
UTM Software	TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA	100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Labs, Burlingame; CA; USA	H-1000-10
Xylacine	Xilagesic. Calier; Barcelona, España	20102-003