Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

קבלת עיקור חיונית להשתלת רקמת קנה הנשימה. כאן אנו מציגים פרוטוקול עיקור באמצעות הקרנת גמא במינון נמוך הנסבל במלואו על ידי איברים.

Abstract

אחד ההיבטים המרכזיים העיקריים בהבטחת התפתחות נכונה של השתלה הוא הסטריליות של המדיום. השתלת קנה נשימה דה-צלולרי כרוכה בהשתלת איבר שהיה במקור במגע עם הסביבה, ולכן לא היה סטרילי מלכתחילה. בעוד פרוטוקול דה-צלולריזציה (באמצעות אקספוזיציה של חומרי ניקוי [2% נתרן דודציל סולפט], ערבוב מתמשך וזעזועים אוסמוטיים) מתבצע בהתאם לאמצעים אספטיים, הוא אינו מספק סטריליזציה. לכן, אחד האתגרים העיקריים הוא הבטחת סטריליות לפני השתלת in vivo . למרות שקיימים פרוטוקולים מבוססים לעיקור קרינת גמא עבור חומרים אנאורגניים, אין אמצעים כאלה עבור חומרים אורגניים. בנוסף, לא ניתן ליישם את הפרוטוקולים הקיימים עבור חומרים אנאורגניים על חומרים אורגניים, מכיוון שמנת הקרינה שנקבעה (25 kGy) תהרוס לחלוטין את השתל. מאמר זה בוחן את ההשפעה של מנת קרינה מוגברת בקנה הנשימה של ארנב נטול תאים. שמרנו על טווח המינונים (kGy) ובדקנו מינונים מוגברים עד שמצאנו את המינון המינימלי שבו מתבצע העיקור. לאחר קביעת המינון, חקרנו את ההשפעות שלו על האיבר, הן מבחינה היסטולוגית והן מבחינה ביומכנית. קבענו כי בעוד 0.5 kGy לא השיגו סטריליות, מינונים של 1 kGy ו 2 kGy כן, עם 1 kGy, אם כן, להיות המינון המינימלי הדרוש כדי להשיג עיקור. מחקרים מיקרוסקופיים לא הראו שינויים רלוונטיים בהשוואה לאיברים לא מעוקרים. מאפיינים ביומכניים ציריים לא השתנו כלל, ונצפתה רק ירידה קלה בכוח ליחידת אורך שהאיבר יכול לסבול רדיאלית. לפיכך אנו יכולים להסיק כי 1 kGy משיג עיקור מלא של קנה הנשימה ארנב decellularized עם השפעות מינימליות, אם בכלל, על האיבר.

Introduction

עיקור של שתל הוא תנאי בסיסי לכדאיותו; למעשה, תותבות שהוכחו כמוצלחות הן אלו שהושתלו באזורים סטריליים (כלי דם, לב, עצם וכו'). 1. לקנה הנשימה שני משטחים: משטח במגע עם הסביבה החיצונית, ולכן אינו סטרילי, ומשטח לכיוון המדיאסטינום, שהוא סטרילי. לכן, מרגע מיצוי קנה הנשימה, הוא אינו איבר סטרילי. למרות שתהליך הדה-צלולריזציה לאחר מכן מתבצע בתנאים סטריליים מקסימליים, זה לא שלבעיקור 2. השתלת חומר זר כשלעצמה כרוכה בסיכון לזיהום בשל המיקרו-סביבה הפרובקטריאלית שהיא מייצרת3וסיכון של עד 0.014% להעברת מחלות מהתורם למקבל, גם אם החומר עבר עיקור4. כדי להבטיח וסקולריזציה נכונה של קנה הנשימה, כמעט בכל פרוטוקולי ההשתלה הניסיוניים, הוא עובר תחילה שתל הטרוטופי 5,6,7 לאזור סטרילי (שריר, פאשיה, אומנטום, תת עורית וכו '); הסיבה לכך היא שהשתלת אלמנט לא סטרילי בתווך זה תוביל לזיהום של אזור3.

ישנן מגוון אסטרטגיות אפשריות להשגת שתל סטרילי. שימוש ב-CO2 סופר-קריטי השיג עיקור סופני 8,9. שיטות אחרות, כגון קרינה אולטרה סגולה או טיפול בחומרים כגון חומצה פראצטית, אתנול, חמצן חמצן ומים אלקטרוליזה, השיגו שיעורי הצלחה שונים בעיקור, כמעט תמיד בהתאם למינונים שלהם, אך הם הוכחו כמשפיעים על המאפיינים הביומכניים של שתלים. ואכן, חומרים מסוימים, כגון אתילן אוקסיד, יכולים לשנות באופן משמעותי את המבנה של המטריצה המושתלת ואף יכולים לגרום להשפעות אימונוגניות בלתי רצויות. מסיבה זו, רבות מהאסטרטגיות הללו אינן ניתנות ליישום על מודלים ביולוגיים 2,10,11,12,13.

אסטרטגיית העיקור הנחקרת והמקובלת ביותר היא זו שנקבעה על ידי תקן ISO 11737-1:2006 לעיקור מכשירים רפואיים המושתלים בבני אדם, עם מנת קרינת גמא של 25 kGy. עם זאת, תקנה זו מתמקדת רק בעיקור של יסודות אינרטיים, לא ביולוגיים14,15. בנוסף, מינוני הרדיותרפיה בטיפול רדיקלי בקרצינומה נמוכים בשלושה סדרי גודל מאלה המשמשים לעיקור מכשירים רפואיים1. בהתחשב בכך, אנו יכולים להסיק כי מינון זה לא רק יהרוג את המיקרוביוטה אלא גם יהרוס וישנה באופן קיצוני את המבנה הביולוגי של השתל. קיימת גם אפשרות שהוא ייצור שאריות שומנים בעת ההתפרקות, אשר עלולות להיות ציטוטוקסיות ולהאיץ את הפירוק האנזימטי של הפיגום 13,14,15,16,17, גם כאשר משתמשים במינונים נמוכים כמו 1.9 kGy ועם נזק ביחס ישר למנת הקרינה המתקבלת 17.

לפיכך, מטרת מאמר זה היא לנסות לזהות את מינון הקרינה המאפשר קבלת שתל סטרילי עם השפעות מזיקות מינימליות הנגרמות על ידי קרינה 2,18,19. האסטרטגיה שעקבנו אחריה כללה הקרנה של קנה נשימה נטול תאים ומוקרן במינונים מוגברים שונים בטווח של קילוגראים (0.5, 1, 2, 3 ק"ג וכו '), עד להשגת תרבית שלילית. בדיקות נוספות בוצעו עבור אותם מינונים שהשיגו תרביות שליליות, על מנת לאשר עיקור. לאחר קביעת המינון המינימלי להשגת עיקור, נבדקה ההשפעה המבנית והביומכנית של הקרינה על קנה הנשימה. כל המדדים הושוו לקנה הנשימה של הארנב הילידי של קבוצת הביקורת. העיקור של המבנה נבדק אז in vivo על ידי השתלת קנה הנשימה בארנבים לבנים בניו זילנד.

Protocol

הדירקטיבה האירופית 20170/63/EU לטיפול ושימוש בחיות מעבדה נשמרה ופרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת ולנסיה (חוק 86/609/EEC ו- 214/1997 וקוד 2018/VSC/PEA/0122 Type 2 של ממשלת ולנסיה, ספרד).

1. דה-צלולריזציה של קנה הנשימה

הערה: שיטת הדה-צלולריזציה דווחה במקום אחר20.

  1. המתת חסד של ארנבים לבנים בוגרים מתורם ניו זילנד (Oryctolagus cuniculus) במשקל 3.5-4.1 ק"ג עם 133 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל, באמצעות הזרקה של 200 מ"ג/מ"ל דרך וריד האוזן השולי.
  2. תוך הקפדה על תנאים אספטיים יש לבצע כריתת צוואר הרחם אורכית מרכזית, לנתח את שרירי צוואר הרחם ולהתקרב לקנה הנשימה. לנתח את האיבר באופן היקפי ואורכי. לבסוף, טרנסקט מתחת לטבעת הראשונה וממש מעל הקארינה.
  3. בעזרת אזמל, חותכים את קנה הנשימה לחתיכות של 2 ס"מ. בעזרת מספריים, הסירו את רקמת החיבור שמסביב ואת שכבת הרירית הפנימית6.
  4. השקיעו את הדגימות ב-12 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) המכילה 2% נתרן דודציל סולפט (SDS), 5% פניצילין-סטרפטומיצין ו-5% אמפוטריצין B.
  5. יש לערבב את קנה הנשימה באופן קבוע עם מערבל מגנטי ב-400 סל"ד למשך 5 שבועות בטמפרטורת החדר. יש להחליף את תמיסת הדה-צלולריזציה מדי שבוע לאחר הלם אוסמוטי של שעתיים, באמצעות טבילה של קנה הנשימה במים מזוקקים.
  6. הקפאת הדגימות באמצעות תערובת של 12 מ"ל של 80% סרום בקר עוברי (FBS) ו-20% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) במיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C.
  7. כאשר קנה הנשימה עומד לשמש (לאחר 13-15 ימים), להפשיר אותם באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס ולשטוף אותם על ידי טבילה אותם PBS לאחר השלמת הפשרה.

2. עיקור

  1. הקרנה
    1. מניחים אצוות של ארבע חתיכות קנה נשימה בגודל 2 ס"מ כל אחת בבקבוק תרבית T25 בנפח 20 מ"ל של מתקרילט בתרבית T25 מלא PBS עד שמגיעים לנפח כולל של 30 מ"ל. יש לדאוג למניעת היווצרות בועות, שעלולות לגרום לפיזור אנרגיה בממשק אוויר-נוזל.
    2. מוליך קרינה באמצעות מאיץ ליניארי, עם פוטונים באנרגיה נומינלית של 10 MV שיטוח אלומות ללא מסנן. יש למרוח קצב מינון של 2,400 יחידות ניטור לדקה באיזוסנטר, תוך הצבת קנה הנשימה במרחק מקור-פני שטח של 100 ס"מ להקרנה, עם עומק שדה של 2.5 ס"מ לשדה קרינה של 10 ס"מ x 10 ס"מ - כך שיכסה את כל המיכל - המתאים למינון של 24 Gy/min.
    3. להסלים את המינונים עם כל אצווה ארבע חתיכות; ארבע חתיכות יהיו חשופות 0.5 kGy, ארבע עד 1 kGy, ארבעה עד 2 kG, וכו ', עד שמגיעים עיקור.
  2. תרבות
    1. הכניסו את החתיכות לתוך 30 מ"ל של מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM) עם 10% FBS בלתי פעיל ללא אנטיביוטיקה או אנטי פטרייתיות.
    2. תרבית אותם באינקובטור רקמות סטנדרטי ב 37 ° C ו 5% CO 2 במשך2 שבועות ולבדוק אותם כל 24 שעות.
      הערה: פרמטרי הזיהום הם שינויים ב- pH של מדיום התרבית, ובהתאם, שינויים בצבע ועכירות המדיום. קנה הנשימה נקצר מלגומורפים נטולי חיידקים, שלא היו חולים, ולכן ציפו להיות נטולי חיידקים אנאירוביים בקנה הנשימה שלהם.

3. ניתוח היסטולוגי

הערה: הכתימו את החלקים באמצעות המטוקסילין ואוזין21, טריכרום של מאסון, ואורצאין22.

  1. צביעת DAPI
    1. קבע את כדאיות הרקמה באמצעות DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole). כתם כחול-פלורסנטי זה נקשר בחוזקה לאזורים עשירים באדנין ובתימין ברצפי דנ"א, ולכן מאפשר לצפות בדנ"א באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    2. הטמע את דגימות הרקמה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
    3. חותכים את הדגימות באמצעות קריוסטט.
    4. שטפו את הדגימה כדי לצבוע אותה שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר את ה-OCT. הניחו באמצעי הרכבה הכולל תמיסה של 30 ננומטר של DAPI.
    5. דמיינו פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. ניתוח תוכן DNA
    1. חתכו מקטעים של קנה הנשימה באורך של כ-3 מ"מ באמצעות אזמל.
    2. לדגור במשך 2 שעות בפרוטאינאז K (טבלת חומרים).
    3. חלץ את הדנ"א באמצעות ערכת מיצוי DNA, בהתאם להוראות היצרן.
    4. באמצעות ספקטרופוטומטריה, לקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי מדידת הספיגה ב 260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר.
    5. מדוד את גודל דגימות ה- DNA שחולצו באמצעות כרומטוגרפיה נימית עם ביואנלייזר.

4. מחקר ביומכני

הערה: התנגדות קנה הנשימה לכוחות אורכיים ורוחביים נמדדת באמצעות בדיקות מתיחה צירית ודחיסה רדיאלית23.

  1. מדידת קנה הנשימה
    1. מדדו את אורך קנה הנשימה, עובי הדופן והקוטר החיצוני באמצעות קליפר ורנייה.
    2. חשב את הערכים הממוצעים משלוש מדידות אקראיות של כל אחד מהמשתנים.
    3. בבדיקות דחיסה רדיאליות, חשב את הקוטר הקדמי על ידי זיהוי הנקודה שבה הצלחת באה במגע עם הדגימה.
    4. בצע את כל הבדיקות בטמפרטורת החדר.
  2. בדיקות מתיחה
    1. בצע בדיקות מתיחה בבקרת תזוזה של מכונת בדיקה אוניברסלית שולחנית (UTM), המצוידת בעומס של 100 N (רזולוציית כוח של 0.1 N, 0.001 מ"מ מיקום ו- 0.1 שניות). מכונת הבדיקה מצוידת בחיישני כוח ומיקום, ומחוברת למחשב עם תוכנה שתוכננה במיוחד על ידי היצרן23.
    2. רשום נתונים כל 0.4 שניות וייצא לגיליון אלקטרוני.
    3. בניית לסתות מתיחה המותאמות לקליבר הממוצע של קנה הנשימה של הארנב מצינוריות חלולות פוליוויניל כלוריד גבישי טהור ולא רעיל (PVC) בקוטר חיצוני של 1 ס"מ ועובי דופן של 1.5 מ"מ.
    4. מחלקים את המוליכים למקטעים באורך 3 ס"מ.
    5. קדח 12 חורים מוכנים לתפר הטרמינו-טרמינלי, 2 מ"מ מקצה הלסתות ומופרדים במרחק של 2.5 מ"מ, למניעת הטיה עקב התפרים.
    6. חבר את צינורות זכוכית PVC לקנה הנשימה של הארנב על ידי אנסטומוזה טרמינו-טרמינלית עם תפר רציף דרך חורים מוכנים לסירוגין (כל 5 מ"מ), במרחק של 2 מ"מ מקצה קנה הנשימה ועם תפר מונופילמנט ניילון 6-0.
    7. מתחו את כל החלקים בקצב תזוזה של 5.0 מ"מ/דקה.
    8. רשום את המשתנים מתח מרבי (σ מקסימום, ב- N/mm2) ומאמץ (εמקסימום, ללא יחידות), יחד עם האנרגיה המאוחסנת ליחידת נפח קנה הנשימה (W/Vol, ב- mJ/mm), ומודולוס יאנג (E, ב- MPa).
  3. בדיקות דחיסה רדיאליות
    1. בצע בדיקות דחיסה רדיאליות ב- UTM שולחני של דחיסה, המצויד בתא עומס של 15 N (רזולוציית כוח 0.001 N, מיקום 0.001 מ"מ וזמן 0.1 שניות) כדי לקבל נתוני כוח (N), מיקום (מ"מ) וזמן (ים). רשום נתונים וייצא לגיליון אלקטרוני במרווחי זמן של 0.5 שניות.
    2. מניחים את קנה הנשימה עם האזור הקרומי מונח על הצלחת התחתונה. הצלחת עולה בהדרגה לכיוון הצלחת העליונה במהירות קבועה של 5 מ"מ לדקה.
    3. חשב כל יחידה ליחידת אורך של הדגימה (f ב- N / mm), קשיחות (R ב- Mpa·mm) והאנרגיה ליחידת שטח פנים (W / S ב- mJ / mm2) הדרושים כדי להסתיר לחלוטין את קנה הנשימה.

5. טכניקה כירורגית

הערה: הטכניקה הכירורגית דווחה בהרחבה במקומות אחרים20.

  1. מניחים סטנט PVC אינטרלומינלי סטרילי, בגודל 14 Fr (המאפשר לו להחליק בחופשיות מבלי לדחוס את הקירות), עם שוליים של 3-4 מ"מ בכל קצה.
  2. תקן את הסטנט בתפר יחיד של 6-0 ניילון מונופילמנט דרך החלל הבין-סחוסי של הסחוס הראשון.
  3. המשך להרדים את הארנבות.
    1. טרום תרופות לנבדקים (3.65-4.05 ק"ג ארנבים לבנים ניו זילנדים זכרים) עם משככי כאבים תוך שריריים (35 מ"ג / ק"ג קטמין) עם תרופת הרגעה, מרפה שרירים ומשכך כאבים (2.5 מ"ג / ק"ג xylazine).
    2. יש לגלח את אזור החתך מחוץ לאזור הניתוח ולנקות את אזור הניתוח כדי להסיר את השיער.
    3. מתן משככי כאבים בתוספת טיפול מונע אנטיביוטי: 0.05 מ"ג / ק"ג buprenorphine תוך שרירי ו 10 מ"ג / ק"ג enrofloxacin.
    4. שים קטטר ורידי בווריד האוזן השולי של כל ארנב.
    5. השראת הרדמה עם בולוס תוך ורידי של 10 מ"ג/ק"ג פרופופול.
    6. עקוב אחר הסימנים החיוניים של בעל החיים באמצעות אלקטרוקרדיוגרמה בעלת שלושה עופרת, אוקסימטריית דופק ומדידת לחץ לא פולשנית. כל 30 דקות, יש למרוח סרום פיזיולוגי על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
    7. בדוק את מישור ההרדמה באמצעות שיטת צביטת הבוהן.
    8. לשמור על הרדמה עם איזופלורן בשאיפה ב 1.5%-2% מהריכוז המינימלי בנאדיות מבלי לאבד אוורור ספונטני ולספק תמיכה תרמית לארנב עם כרית חימום.
  4. יש לחטא את אזור החתך מספר פעמים בתנועה מעגלית בעזרת פילינג על בסיס יוד. בתנאים אספטיים בכל עת ועם חומר סטרילי, יש לבצע חתך אורכי של בית החזה המרכזי בקוטר 3 ס"מ, ולקצור דשים דו-צדדיים המורכבים מפאשיה חזה ומרכיב שרירי.
  5. לעטוף את קנה הנשימה עם הדש בארבעה ארנבים, אחד על כל hemithorax (כך, בסך הכל שמונה קנה הנשימה).
  6. עם סיום הניתוח, הפוך את ההרדמה על ידי הפסקת מתן איזופלורן.
  7. התקופה שלאחר הניתוח
    1. שמור את בעלי החיים בחדר הניתוח עד שהם התאוששו לחלוטין מההרדמה. לאחר שהחלימו לחלוטין, החזירו אותם לסביבתם עם ארנבים אחרים.
    2. טפל בארנבים עם אנטיביוטיקה (0.5 מ"ל / ק"ג של 2.5% enrofloxacin) ומשככי כאבים (5 מ"ג / מ"ל meloxicam; 0.05 מ"ל / ק"ג metacam) כל 24 שעות במשך 5 ימים.
    3. השאירו את השתלים באתרם למשך הזמן הרצוי.
    4. לפני המתת חסד, pre-medicine את הארנבים עם משככי כאבים תוך שריריים (35 מ"ג / ק"ג קטמין) וסם הרגעה, מרגיע שרירים, משכך כאבים (2.5 מ"ג / ק"ג xylazine). לאחר מכן הרדימו את הארנבים עם 133 מ"ג / ק"ג נתרן pentobarbital באמצעות הזרקה של 200 מ"ג / מ"ל דרך וריד האוזן השולי וקצרו את קנה הנשימה.
    5. לבצע בדיקות ביומכניות והיסטולוגיות על קנה הנשימה.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. התאם את כל המודלים בשיטה הבייסיאנית על תוכנת R, גרסה 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
  2. נתח את משתני המחקר, למעט f ו - R, באמצעות מודלים מרובים של רגרסיה ליניארית.
  3. עבור המשתנים f ו - R , החל מודלים מעורבים של רגרסיה ליניארית. במודלים אלה, בנוסף למשתנים המעניינים הקשורים לטיפול ולמצב של כל קנה נשימה, מציגים את אחוז החסימה כאפקט מונוטוני ומונח עצמאי לכל קנה נשימה כגורם אקראי.

תוצאות

דה-סלולריזציה
צביעת DAPI מראה היעדר DNA, ולא זוהו ערכי DNA גבוהים מ-50 ננוגרם בקנה הנשימה על ידי אלקטרופורזה, כאשר כל המקטעים קטנים מ-200 bp20.

תרבית מיקרוביאלית
שתיים מתוך שמונה החתיכות שנבדקו ב-0.5 קילו-ג'י הראו שינוי צבע תוך פחות משבוע. אף אחת מהפיסו?...

Discussion

קיימות מספר אסטרטגיות עיקור. CO2סופרקריטי חודר במלואו לרקמות, חומץ את התווך ומפרק את דו-שכבת הפוספוליפידים התאית באמצעות חיסול פשוט באמצעות דיכוי השתל 8,14,25. נעשה שימוש גם בקרינה אולטרה סגולה, ויעילותה בקנה הנשימה של מכרסם פורסמה, אם ?...

Disclosures

לאף אחד מהכותבים אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

מאמר זה נתמך על ידי מענק האגודה הספרדית לניתוחי חזה לשנת 2018 למחקר רב-צנטרי לאומי [מספר 180101 הוענק לנסטור ג'יי מרטינז-הרננדס] ו-PI16-01315 [הוענק למנואל מאטה-רויג] על ידי מכון סאלוד קרלוס השלישי. CIBERER ממומנת על ידי תוכנית המו"פ הלאומית השישית 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions והמכון של סאלוד קרלוס השלישי, בסיוע הקרן האירופית לפיתוח אזורי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6-0 nylon monofilament suture Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USASN-5698G
Amphotericin B 5%Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA15290018
BioanalyzerAgilent, Santa Clara, CA, USAG2939BA
BuprenorphineBuprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino UnidoN02AE01
Compression desktop UTMMicrotest, Madrid, SpainEM1/10/FR
CryostateLeyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, AlemaniaCM3059
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich; MO, USAD2650
DMEM Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA11965084
DNA extraction kitDNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany4368814
Enrofloxacin, 2.5%Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)GE Healthcare Hyclone; Madrid, SpainSH20898.03IR
Fluorescence microscopeLeyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)DM2500??
Freezing Container Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain 5100-0001
IsofluoraneIsoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain 8.43603E+12
KetaminImalgene. Merial; Toulouse, FranciaBOE127823
Linear accelerator "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USAH191001
Magnetic stirrerOrbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, LetoniaBS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/mlBoehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany6283-MV
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)Fischer Scientific, Madrid, Spain12678646
Penicillin-streptomycin 5%Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA15140122
Pentobarbital sodiumDolethal. Vetoquinol; Madrid, España3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich; MO, USAP2272
PropofolPropofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, AlemaniaG 151030
Proteinase KGibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USAS3020
PVC hollow tubesCristallo Extra; FITT, Sandrigo, ItalyhhdddyyZ
PVC stent ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R CoreR Foundation for Statistical ComputingR 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich; MO, USA8,17,034
SpectrophotometerNanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, NetherlandsND-ONEC-W
SpreadsheetMicrosoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA2864993241
Traction Universal Testing Machine Testing Machines, Veenendaal, Netherlands84-01
UTM SoftwareTestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA 100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium Vector Labs, Burlingame; CA; USAH-1000-10
XylacineXilagesic. Calier; Barcelona, España20102-003

References

  1. Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
  2. Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
  3. de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
  4. Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
  5. Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
  6. Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
  7. Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
  8. White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
  9. Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
  10. Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
  11. Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories. Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).
  12. Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
  13. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  14. Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
  15. AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , (2006).
  16. Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
  17. Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
  18. Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
  19. Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
  20. Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
  21. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  22. López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , 175-195 (1993).
  23. Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
  24. Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
  25. Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
  26. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved