Esterilização por radiação gama de baixa dose em enxertos traqueais descelularizados

Resumo

A obtenção da esterilização é essencial para o transplante de tecido traqueal. Apresentamos um protocolo de esterilização utilizando irradiação gama em baixas doses que é totalmente tolerada pelos órgãos.

Resumo

Um dos principais aspectos fundamentais para garantir que um transplante evolua corretamente é a esterilidade do meio. O transplante traqueal descelularizado envolve a implantação de um órgão que originalmente estava em contato com o meio ambiente, não sendo estéril desde o início. Embora o protocolo de descelularização (por exposição a detergente [dodecil sulfato de sódio a 2%), agitação contínua e choques osmóticos) seja conduzido de acordo com medidas assépticas, ele não prevê esterilização. Portanto, um dos principais desafios é garantir a esterilidade antes da implantação in vivo . Embora existam protocolos estabelecidos de esterilização por radiação gama para materiais inorgânicos, não existem tais medidas para materiais orgânicos. Além disso, os protocolos em vigor para materiais inorgânicos não podem ser aplicados a materiais orgânicos, pois a dose de radiação estabelecida (25 kGy) destruiria completamente o implante. Este trabalho estuda o efeito de uma dose de radiação aumentada em uma traqueia de coelho decelularizada. Mantivemos a faixa de dose (kGy) e testamos doses escalonadas até encontrar a dose mínima na qual a esterilização é alcançada. Após a determinação da dose, estudaram-se os efeitos da mesma no órgão, tanto histologicamente quanto biomecanicamente. Determinamos que, enquanto 0,5 kGy não atingiu esterilidade, doses de 1 kGy e 2 kGy atingiram, sendo 1 kGy, portanto, a dose mínima necessária para atingir a esterilização. Estudos microscópicos não mostraram alterações relevantes em comparação com órgãos não esterilizados. As características biomecânicas axiais não foram alteradas, e apenas uma pequena redução na força por unidade de comprimento que o órgão pode tolerar radialmente foi observada. Podemos, portanto, concluir que 1 kGy alcança a esterilização completa da traqueia de coelhos descelularizados com um mínimo, se houver, efeito sobre o órgão.

Introdução

A esterilização de um implante é um requisito básico para sua viabilidade; Na verdade, as próteses que têm se mostrado bem-sucedidas são aquelas implantadas em áreas estéreis (vasos sanguíneos, coração, osso, etc.) ¹. A traqueia possui duas superfícies: uma superfície em contato com o meio externo, portanto não estéril, e uma superfície em direção ao mediastino, que é estéril. Portanto, a partir do momento em que a traqueia é extraída, ela não é um órgão estéril. Apesar do processo de descelularização subsequente ser realizado em condições estéreis máximas, não se trata de uma etapa de esterilização². A implantação de material estranho por si só acarreta risco de infecção devido ao microambiente pró-bacteriano que^produz3e risco de até 0,014% de transmissão de doença do doador para o receptor, mesmo que o material tenha sido esterilizado⁴. Para garantir a correta vascularização da traqueia, em quase todos os protocolos experimentais de transplante, ela é primeiramente submetida a implante heterotópico ^5,6,7 em uma área estéril (músculo, fáscia, omento, subcutâneo^, etc.); Isso porque a implantação de um elemento não estéril nesse meio levaria à infecção da área³.

Existe uma gama de estratégias possíveis para a obtenção de um implante estéril. O uso do CO₂supercrítico tem alcançado esterilização terminal ^8,9. Outros métodos, como radiação ultravioleta ou tratamento com substâncias como ácido peracético, etanol, peróxido de oxigênio e água eletrolisada, têm obtido diferentes taxas de sucesso na esterilização, quase sempre dependendo de suas dosagens, mas têm demonstrado afetar as características biomecânicas dos implantes. De fato, algumas substâncias, como o óxido de etileno, podem alterar substancialmente a estrutura da matriz implantada e até causar efeitos imunogênicos indesejáveis. Por essa razão, muitas dessas estratégias não podem ser aplicadas a modelos biológicos 2,10,11,12,13.

A estratégia de esterilização mais estudada e aceita é a estabelecida pela norma ISO 11737-1:2006 para esterilização de produtos médicos implantados em humanos, com dose de radiação gama de 25 kGy. No entanto, essa regulamentação enfoca apenas a esterilização de elementos inertes não biológicos^14,15. Além disso, as doses de radioterapia no tratamento radical do carcinoma são três ordens de grandeza menores do que as utilizadas para esterilizar produtos^médicos1. Com isso em mente, podemos concluir que tal dose não apenas mataria a microbiota, mas também destruiria e alteraria radicalmente a estrutura biológica do implante. Existe também a possibilidade de gerar lipídios residuais no momento da degradação, que podem ser potencialmente citotóxicos e acelerar a degradação enzimática do arcabouço 13,14,15,16,17, mesmo quando se utilizam doses tão baixas quanto ^1,9 kGy e com danos diretamente proporcionais à dose de radiação recebida ¹⁷.

Assim, o objetivo deste trabalho é tentar identificar a dose de radiação que permite a obtenção de um implante estéril com o mínimo de efeitos deletérios causados pela irradiação 2,18,19. A estratégia seguida envolveu a irradiação de traqueias decelularizadas e irradiadas em diferentes doses escalonadas dentro de uma faixa de quilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.), até a obtenção de uma cultura negativa. Testes adicionais foram realizados para as doses que obtiveram culturas negativas, a fim de confirmar a esterilização. Após a determinação da dose mínima para obtenção da esterilização, foi verificado o impacto estrutural e biomecânico da irradiação na traqueia. Todas as métricas foram comparadas com as traqueias de coelhos nativos controle. A esterilização do construto foi então testada in vivo, implantando-se as traqueias em coelhos brancos da Nova Zelândia.

Protocolo

A diretiva europeia 20170/63/EU para o cuidado e uso de animais de laboratório foi cumprida e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Valência (Lei 86/609/CEE e 214/1997 e Código 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 do Governo de Valência, Espanha).

1. Decelularização traqueal

NOTA: O método de decelularização foi relatado em outra publicação²⁰.

1. Eutanásia de coelhos brancos (Oryctolagus cuniculus) adultos adultos doadores de eutanásia, pesando 3,5-4,1 kg com 133 mg/kg de pentobarbital sódico, usando uma injeção de 200 mg/mL através da veia marginal da orelha.
2. Ao mesmo tempo em que garante condições assépticas, realize uma cervicotomia longitudinal central, disseque os músculos cervicais e aproxime-se da traqueia. Dissecar o órgão circunferencial e longitudinalmente. Finalmente, transecto sob o primeiro anel e logo acima da carina.
3. Com um bisturi, corte as traqueias em pedaços de 2 cm. Com tesoura, remova o tecido conjuntivo circundante e a camada mucosa interna⁶.
4. Submergir os espécimes em 12 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) a 2%, penicilina-estreptomicina a 5% e anfotericina B a 5%.
5. Submeter as traqueias a agitação constante com um agitador magnético a 400 rpm durante 5 semanas à temperatura ambiente. Substituir a solução de descelularização semanalmente após 2 h de choque osmótico, por imersão da traqueia em água destilada.
6. Criogenizar os espécimes usando uma mistura de 12 mL de soro fetal bovino (FBS) e 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) em um recipiente de congelamento a -80 °C.
7. Quando as traqueias forem usadas (após 13-15 dias), descongele-as em banho-maria a 37 °C e lave-as submergindo-as em PBS após o descongelamento estar completo.

2. Esterilização

1. Irradiação
   1. Colocar lotes de quatro peças traqueais de 2 cm cada em um frasco de 20 mL de metacrilato em frasco de cultura T25 preenchido com PBS até atingir um volume total de 30 mL. Tome cuidado para evitar a formação de bolhas, o que poderia causar difusão de energia na interface ar-líquido.
   2. Realizar irradiação utilizando um acelerador linear, com fótons de energia nominal de 10 MV achatando feixes livres de filtros. Aplicar uma taxa de dose de 2.400 unidades monitoras por minuto no isocentro, colocando as traqueias a uma distância fonte-superfície de 100 cm a ser irradiada, com uma profundidade de campo de 2,5 cm para um campo de radiação de 10 cm x 10 cm, de modo a cobrir todo o recipiente - correspondendo a uma dose de 24 Gy/min.
   3. Escalonar as doses a cada lote de quatro peças; quatro peças serão submetidas a 0,5 kGy, quatro a 1 kGy, quatro a 2 kG, etc., até que a esterilização seja atingida.
2. Cultura
   1. Introduzir as peças em 30 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com SFB inativado a 10%, sem antibióticos ou antifúngicos.
   2. Cultivá-los em uma incubadora de tecidos padrão a 37 °C e 5% CO 2 por₂ semanas e inspecioná-los a cada 24 h.
      OBS: Os parâmetros de contaminação são alterações no pH do meio de cultura e, consequentemente, alterações na cor e turbidez do meio. As traqueias foram colhidas de lagomorfos livres de germes, que não estavam doentes e, portanto, esperava-se que estivessem desprovidos de bactérias anaeróbias em suas traqueias.

3. Análise histológica

OBS: Coloração das peças com hematoxilina e eosina²¹, tricrômico de Masson e orceína²².

1. Coloração DAPI
   1. Determinar a viabilidade tecidual utilizando DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol). Essa coloração azul-florida liga-se fortemente a regiões ricas em adenina e timina em sequências de DNA e, portanto, permite que o DNA seja visualizado por microscopia de fluorescência.
   2. Incorpore as amostras de tecido em composto de temperatura de corte ideal (OCT).
   3. Corte as amostras usando um criostato.
   4. Lavar a amostra a ser tingida três vezes em água destilada para remover o OCT. Coloque em meio de montagem que inclua uma solução de 30 nM de DAPI.
   5. Visualize a fluorescência usando microscopia de fluorescência.
2. Análise de conteúdo de DNA
   1. Segmentos cortados da traqueia medindo aproximadamente 3 mm de comprimento com bisturi.
   2. Incubar por 2 h em proteinase K (Tabela de Materiais).
   3. Extraia o DNA com um kit de extração de DNA, seguindo as instruções do fabricante.
   4. Por meio de espectrofotometria, determinar a concentração de DNA medindo a absorbância a 260/280 usando um espectrofotômetro.
   5. Medir o tamanho das amostras de DNA extraídas usando cromatografia capilar com um bioanalisador.

4. Estudo biomecânico

MOTIVO: A resistência traqueal às forças longitudinais e transversais é medida através de ensaios de tração axial e compressão radial²³.

1. Medida traqueal
   1. Meça o comprimento traqueal, a espessura da parede e o diâmetro externo usando um paquímetro Vernier.
   2. Calcule os valores médios a partir de três medidas aleatórias de cada uma das variáveis.
   3. Nos ensaios de compressão radial, calcular o diâmetro anteroposterior detectando o ponto em que a placa entra em contato com o corpo de prova.
   4. Realizar todos os testes à temperatura ambiente.
2. Ensaios de tração
   1. Realize testes de tração em um controle de deslocamento UTM (máquina universal de ensaio de tração), equipado com uma carga de 100 N (resolução de força de 0,1 N, 0,001 mm de posição e 0,1 s). A máquina de ensaio está equipada com sensores de força e posição, e está conectada a um computador com software projetado especificamente pelo fabricante²³.
   2. Registre dados a cada 0,4 s e exporte para uma planilha.
   3. Construir mandíbulas de tração adaptadas ao calibre médio das traqueias de coelhos a partir de tubos ocos de policloreto de vinila (PVC) cristal puro, monocamada, atóxicos, com diâmetro externo de 1 cm e espessura de parede de 1,5 mm.
   4. Separe as condutas em segmentos de 3 cm de comprimento.
   5. Perfurar 12 orifícios pré-formados para a sutura término-terminal, a 2 mm da borda dos maxilares e separados por uma distância de 2,5 mm, para evitar viés devido às suturas.
   6. Fixar os tubos de vidro de PVC na traqueia do coelho por anastomose término-terminal com sutura contínua através de orifícios pré-formados alternados (a cada 5 mm), distantes 2 mm da borda da traqueia e com fio de náilon 6-0 monofilamentar.
   7. Esticar todas as peças a uma taxa de deslocamento de 5,0 mm/min.
   8. Registrar as variáveis tensão máxima (σ máx, em N/mm²) e deformação (ε_máx, sem unidades), juntamente com a energia armazenada por unidade de volume traqueal (W/Vol, em mJ/mm) e módulo de elasticidade (E, em MPa).
3. Ensaios de compressão radial
   1. Realize testes de compressão radial em um UTM desktop de compressão, equipado com uma célula de carga de 15 N (resolução de força 0,001 N, posição 0,001 mm e tempo 0,1 s) para obter dados de força (N), posição (mm) e tempo (s). Registre dados e exporte para planilha em intervalos de 0,5 s.
   2. Coloque as traqueias com a área membranosa apoiada na placa inferior. A placa sobe gradualmente em direção à placa superior a uma velocidade constante de 5 mm/min.
   3. Calcular cada unidade por unidade de comprimento da amostra (f em N/mm), rigidez (R em Mpa·mm) e a energia por unidade de área superficial (W / S em mJ/mm²) necessária para ocluir completamente a traqueia.

5. Técnica cirúrgica

NOTA: A técnica cirúrgica tem sido amplamente divulgada em outros^{periódicos 20}.

1. Coloque um stent de PVC intraluminal estéril, tamanho 14 Fr (que permite deslizar livremente sem comprimir as paredes), com uma margem de 3-4 mm em cada extremidade.
2. Fixar o stent com um único ponto de monofilamento de náilon 6-0 através do espaço intercartilaginoso da primeira cartilagem.
3. Proceder à anestesia dos coelhos.
   1. Pré-medicar os indivíduos (3,65-4,05 kg coelhos machos da raça Nova Zelândia brancos) com analgésicos intramusculares (35 mg/kg de cetamina) com sedativo, relaxante muscular e analgésico (2,5 mg/kg de xilazina).
   2. Raspe a zona de incisão para fora da zona de operação e limpe a área cirúrgica para remover os cabelos.
   3. Administrar analgésicos e antibioticoprofilaxia: 0,05 mg/kg de buprenorfina intramuscular e 10 mg/kg de enrofloxacina.
   4. Coloque um cateter venoso na veia marginal da orelha de cada coelho.
   5. Anestesia induzida com propofol em bolus de 10 mg/kg por via venosa.
   6. Monitorar os sinais vitais do animal por meio de eletrocardiograma de três derivações, oximetria de pulso e medida de pressão não invasiva. A cada 30 min, aplique soro fisiológico nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
   7. Verifique o plano anestésico usando o método de pinça dos dedos.
   8. Manter a anestesia com isoflurano inalatório a 1,5%-2% da concentração alveolar mínima sem perder a ventilação espontânea e fornecer suporte térmico ao coelho com uma almofada térmica.
4. Desinfete a zona de incisão várias vezes em movimento circular com uma esfoliação à base de iodo. Em condições assépticas em todos os momentos e com material estéril, realizar incisão torácica central longitudinal de 3 cm e colher retalhos pediculados bilaterais compostos por fáscia peitoral e componente muscular.
5. Envolver as traqueias com o retalho em quatro coelhos, um em cada hemitórax (totalizando oito traqueias).
6. Ao término da cirurgia, reverter a anestesia interrompendo a administração de isoflurano.
7. Período pós-cirúrgico
   1. Mantenha os animais na sala de cirurgia até que tenham se recuperado completamente da anestesia. Quando eles tiverem se recuperado completamente, devolva-os ao seu ambiente com outros coelhos.
   2. Tratar os coelhos com antibióticos (0,5 mL/kg de enrofloxacina a 2,5%) e analgésicos (5 mg/mL meloxicam; 0,05 mL/kg metacam) a cada 24 h por 5 dias.
   3. Deixe os implantes in situ pelo tempo desejado.
   4. Antes da eutanásia, pré-medicar os coelhos com analgésicos intramusculares (35 mg/kg de cetamina) e um sedativo, relaxante muscular e analgésico (2,5 mg/kg de xilazina). Em seguida, eutanasiar os coelhos com 133 mg/kg de pentobarbital sódico usando uma injeção de 200 mg/mL através da veia marginal da orelha e colher as traqueias.
   5. Realizar testes biomecânicos e histológicos nas traqueias.

6. Análise estatística

1. Ajuste todos os modelos pelo método bayesiano no software R, Versão 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
2. Analisar as variáveis do estudo, exceto f e R, utilizando modelos de regressão linear múltipla.
3. Para as variáveis f e R , aplicar modelos de regressão linear mista. Nesses modelos, além das variáveis de interesse relacionadas ao tratamento e condição de cada traqueia, introduz-se a porcentagem de oclusão como efeito monotônico e um termo independente por traqueia como fator aleatório.

Resultados

Descelularização
A coloração DAPI mostra ausência de DNA, e nenhum valor de DNA superior a 50 ng foi detectado em nenhuma das traqueias por eletroforese, com todos os fragmentos sendo menores que 200 pb²⁰.

Cultura microbiana
Duas das oito peças submetidas a 0,5 kGy apresentaram mudança de cor em menos de 1 semana. Nenhuma das peças irradiadas a 1 kGy e 2 kGy apresentou alteração de cor (Figura 1

Discussão

Existem várias estratégias de esterilização. O CO₂supercrítico penetra totalmente nos tecidos, acidificando o meio e desconstruindo a bicamada fosfolipídica celular com eliminação simples por meio da despressurização do implante 8,14,25. A radiação ultravioleta também tem sido utilizada, e sua eficácia na traqueia de roedores tem sido publicada, embora existam poucos relatos na^literatur...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 nylon monofilament suture	Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA	SN-5698G
Amphotericin B 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15290018
Bioanalyzer	Agilent, Santa Clara, CA, USA	G2939BA
Buprenorphine	Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido	N02AE01
Compression desktop UTM	Microtest, Madrid, Spain	EM1/10/FR
Cryostate	Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3059
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)	DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich; MO, USA	D2650
DMEM	Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA	11965084
DNA extraction kit	DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany	4368814
Enrofloxacin, 2.5%	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain	SH20898.03IR
Fluorescence microscope	Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)	DM2500??
Freezing Container	Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain	5100-0001
Isofluorane	Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain	8.43603E+12
Ketamin	Imalgene. Merial; Toulouse, Francia	BOE127823
Linear accelerator	"True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA	H191001
Magnetic stirrer	Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia	BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	6283-MV
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Fischer Scientific, Madrid, Spain	12678646
Penicillin-streptomycin 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15140122
Pentobarbital sodium	Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España	3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	P2272
Propofol	Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania	G 151030
Proteinase K	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA	S3020
PVC hollow tubes	Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy	hhdddyyZ
PVC stent	ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey	019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core	R Foundation for Statistical Computing	R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	8,17,034
Spectrophotometer	Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands	ND-ONEC-W
Spreadsheet	Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA	2864993241
Traction Universal Testing Machine	Testing Machines, Veenendaal, Netherlands	84-01
UTM Software	TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA	100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Labs, Burlingame; CA; USA	H-1000-10
Xylacine	Xilagesic. Calier; Barcelona, España	20102-003