Stérilisation par rayonnement gamma à faible dose pour les greffes trachéales décellularisées

Résumé

L’obtention de la stérilisation est essentielle pour la greffe de tissu trachéal. Nous présentons ici un protocole de stérilisation utilisant une irradiation gamma à faible dose qui est entièrement tolérée par les organes.

Résumé

L’un des principaux aspects clés pour assurer l’évolution correcte d’une greffe est la stérilité du milieu. La transplantation trachéale décellularisée consiste à implanter un organe qui était à l’origine en contact avec l’environnement, n’étant donc pas stérile dès le départ. Bien que le protocole de décellularisation (par exposition au détergent [dodécylsulfate de sodium à 2%), agitation continue et chocs osmotiques) soit effectué conformément aux mesures aseptiques, il ne permet pas la stérilisation. Par conséquent, l’un des principaux défis est d’assurer la stérilité avant l’implantation in vivo . Bien qu’il existe des protocoles établis de stérilisation par rayonnement gamma pour les matières inorganiques, il n’existe pas de telles mesures pour les matières organiques. De plus, les protocoles en place pour les matières inorganiques ne peuvent pas être appliqués aux matières organiques, car la dose de rayonnement établie (25 kGy) détruirait complètement l’implant. Cet article étudie l’effet d’une dose de rayonnement accrue dans une trachée de lapin décellularisée. Nous avons maintenu la plage de doses (kGy) et testé les doses croissantes jusqu’à ce que nous trouvions la dose minimale à laquelle la stérilisation est réalisée. Après avoir déterminé la dose, nous en avons étudié les effets sur l’organe, à la fois histologiquement et biomécaniquement. Nous avons déterminé que même si 0,5 kGy n’atteignait pas la stérilité, des doses de 1 kGy et de 2 kGy l’étaient, 1 kGy étant donc la dose minimale nécessaire pour obtenir la stérilisation. Les études microscopiques n’ont montré aucun changement pertinent par rapport aux organes non stérilisés. Les caractéristiques biomécaniques axiales n’ont pas été modifiées du tout, et seule une légère réduction de la force par unité de longueur que l’organe peut tolérer radialement a été observée. Nous pouvons donc conclure que 1 kGy permet une stérilisation complète de la trachée de lapin décellularisée avec des effets minimes, voire nuls, sur l’organe.

Introduction

La stérilisation d’un implant est une condition de base pour sa viabilité; En fait, les prothèses qui ont fait leurs preuves sont celles implantées dans des zones stériles (vaisseaux sanguins, cœur, os, etc.) ¹. La trachée a deux surfaces : une surface en contact avec le milieu extérieur, qui n’est donc pas stérile, et une surface vers le médiastin, qui est stérile. Par conséquent, à partir du moment où la trachée est extraite, ce n’est pas un organe stérile. Bien que le processus de décellularisation ultérieur soit effectué dans des conditions stériles maximales, il ne s’agit pas d’une étape de stérilisation². L’implantation de corps étrangers entraîne en soi un risque d’infection en raison du microenvironnement probactérien qu’elle produit³et un risque de transmission de la maladie allant jusqu’à 0,014% du donneur au receveur, même si le matériel a été stérilisé⁴. Pour assurer une vascularisation correcte de la trachée, dans presque tous les protocoles de transplantation expérimentale, elle subit d’abord un implant hétérotopique ^5,6,7 dans une zone stérile (muscle, fascia, épiploon, sous-cutané^, etc.); En effet, l’implantation d’un élément non stérile dans ce milieu entraînerait une infection de la zone³.

Il existe une gamme de stratégies possibles pour obtenir un implant stérile. L’utilisation du CO₂supercritique a permis d’obtenir une stérilisation terminale ^8,9. D’autres méthodes, telles que le rayonnement ultraviolet ou le traitement avec des substances telles que l’acide peracétique, l’éthanol, le peroxyde d’oxygène et l’eau électrolysée, ont obtenu des taux de réussite différents dans la stérilisation, presque toujours en fonction de leurs dosages, mais il a été démontré qu’elles affectent les caractéristiques biomécaniques des implants. En effet, certaines substances, comme l’oxyde d’éthylène, peuvent modifier substantiellement la structure de la matrice implantée et peuvent même provoquer des effets immunogènes indésirables. Pour cette raison, bon nombre de ces stratégies ne peuvent pas être appliquées aux modèles biologiques 2,10,11,12,13.

La stratégie de stérilisation la plus étudiée et acceptée est celle établie par la norme ISO 11737-1:2006 pour la stérilisation des dispositifs médicaux implantés chez l’homme, avec une dose de rayonnement gamma de 25 kGy. Cependant, ce règlement se concentre uniquement sur la stérilisation des éléments inertes et non biologiques^14,15. De plus, les doses de radiothérapie dans le traitement radical du carcinome sont inférieures de trois ordres de grandeur à celles utilisées pour stériliser les dispositifs médicaux¹. Dans cette optique, nous pouvons conclure que ladite dose tuerait non seulement le microbiote, mais détruirait et modifierait radicalement la structure biologique de l’implant. Il est également possible qu’il génère des lipides résiduels lors de la dégradation, ce qui peut potentiellement être cytotoxique et accélérer la dégradation enzymatique de l’échafaudage 13,14,15,16,17, même en utilisant des doses aussi faibles que ^1,9 kGy et avec des dommages directement proportionnels à la dose de rayonnement reçue ¹⁷.

Ainsi, l’objectif de cet article est d’essayer d’identifier la dose de rayonnement qui permet d’obtenir un implant stérile avec un minimum d’effets nocifs causés par l’irradiation 2,18,19. La stratégie que nous avons suivie impliquait l’irradiation de trachées décellularisées et irradiées à différentes doses accrues dans une gamme de kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.), jusqu’à obtenir une culture négative. Des tests supplémentaires ont été effectués pour les doses qui ont obtenu des cultures négatives, afin de confirmer la stérilisation. Après avoir déterminé la dose minimale pour obtenir la stérilisation, l’impact structurel et biomécanique de l’irradiation sur la trachée a été vérifié. Tous les paramètres ont été comparés avec les trachées de lapin indigènes témoins. La stérilisation de la construction a ensuite été testée in vivo en implantant les trachées dans des lapins blancs néo-zélandais.

Protocole

La directive européenne 20170/63/UE pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire a été respectée et le protocole d’étude a été approuvé par le Comité d’éthique de l’Université de Valence (loi 86/609/CEE et 214/1997 et Code 2018/VSC/PEA/0122 Type 2 du gouvernement de Valence, Espagne).

1. Décellularisation trachéale

NOTE: La méthode de décellularisation a été signalée ailleurs²⁰.

1. Euthanasier des lapins blancs de Nouvelle-Zélande mâles mâles adultes (Oryctolagus cuniculus) pesant de 3,5 à 4,1 kg avec 133 mg/kg de pentobarbital sodique, en injectant 200 mg/mL par la veine marginale de l’oreille.
2. Tout en assurant des conditions d’asepsie, effectuez une cervicotomie longitudinale centrale, disséquez les muscles cervicaux et approchez la trachée. Disséquer l’organe circonférentiellement et longitudinalement. Enfin, transectez sous le premier anneau et juste au-dessus de la carène.
3. Avec un scalpel, couper les trachées en morceaux de 2 cm. Avec des ciseaux, retirez le tissu conjonctif environnant et la couche⁶ de la muqueuse interne.
4. Immerger les échantillons dans 12 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 2 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), 5 % de pénicilline-streptomycine et 5 % d’amphotéricine B.
5. Soumettre les trachées à une agitation constante à l’aide d’un agitateur magnétique à 400 tr/min pendant 5 semaines à température ambiante. Remplacer la solution de décellularisation chaque semaine après un choc osmotique de 2 h, par immersion de la trachée dans de l’eau distillée.
6. Cryogéniser les échantillons à l’aide d’un mélange de 12 mL de sérum fœtal bovin (FBS) à 80 % et de 20 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un contenant congelé à -80 °C.
7. Lorsque les trachées vont être utilisées (après 13-15 jours), décongelez-les au bain-marie à 37 °C et lavez-les en les immergeant dans du PBS une fois la décongélation terminée.

2. Stérilisation

1. Irradiation
   1. Placer des lots de quatre morceaux trachéaux de 2 cm chacun dans un 20 mL de méthacrylate dans une fiole de culture T25 remplie de PBS jusqu’à ce qu’un volume total de 30 mL soit atteint. Veillez à éviter la formation de bulles qui pourraient provoquer une diffusion d’énergie dans l’interface air-liquide.
   2. Effectuer l’irradiation à l’aide d’un accélérateur linéaire, avec des photons d’une énergie nominale de 10 MV aplatissant les faisceaux sans filtre. Appliquer un débit de dose de 2 400 unités de surveillance par minute à l’isocentre, en plaçant les trachées à une distance source-surface de 100 cm à irradier, avec une profondeur de champ de 2,5 cm pour un champ de rayonnement de 10 cm x 10 cm - de manière à couvrir tout le récipient - correspondant à une dose de 24 Gy/min.
   3. Augmenter les doses avec chaque lot de quatre pièces; quatre pièces seront soumises à 0,5 kGy, quatre à 1 kGy, quatre à 2 kG, etc., jusqu’à ce que la stérilisation soit atteinte.
2. Culture
   1. Introduire les morceaux dans 30 ml du milieu Eagle’s Medium modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% FBS inactivé sans antibiotiques ni antifongiques.
   2. Cultivez-les dans un incubateur de tissus standard à 37 °C et 5% de CO 2 pendant₂ semaines et inspectez-les toutes les 24 heures.
      REMARQUE : Les paramètres de contamination sont les changements dans le pH du milieu de culture et, par conséquent, les changements dans la couleur et la turbidité du milieu. Les trachées ont été récoltées sur des lagomorphes exempts de germes, qui n’étaient pas malades et devaient donc être dépourvus de bactéries anaérobies dans leurs trachées.

3. Analyse histologique

NOTE: Colorer les morceaux avec de l’hématoxyline et de l’éosine²¹, le trichrome de Masson et l’orcéine²².

1. Coloration DAPI
   1. Déterminer la viabilité tissulaire à l’aide du DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole). Cette coloration bleu-fluorescente se lie fortement aux régions riches en adénine et en thymine dans les séquences d’ADN, et permet donc de visualiser l’ADN par microscopie à fluorescence.
   2. Incorporer les échantillons de tissus dans un composé à température de coupe optimale (OCT).
   3. Couper les échantillons à l’aide d’un cryostat.
   4. Lavez l’échantillon à teindre trois fois dans de l’eau distillée pour éliminer l’OCT. Placer dans un support de montage comprenant une solution de DAPI à 30 nM.
   5. Visualisez la fluorescence à l’aide de la microscopie à fluorescence.
2. Analyse du contenu de l’ADN
   1. Couper des segments de trachée mesurant environ 3 mm de long à l’aide d’un scalpel.
   2. Incuber pendant 2 h dans la protéinase K (Table of Materials).
   3. Extrayez l’ADN avec un kit d’extraction d’ADN, en suivant les instructions du fabricant.
   4. Au moyen de la spectrophotométrie, déterminer la concentration d’ADN en mesurant l’absorbance à 260/280 à l’aide d’un spectrophotomètre.
   5. Mesurer la taille des échantillons d’ADN extraits par chromatographie capillaire avec un bioanalyseur.

4. Étude biomécanique

NOTA: La résistance trachéale aux forces longitudinales et transversales est mesurée par des essais de traction axiale et de compression radiale²³.

1. Mesure trachéale
   1. Mesurez la longueur trachéale, l’épaisseur de paroi et le diamètre extérieur à l’aide d’un étrier Vernier.
   2. Calculez les valeurs moyennes à partir de trois mesures aléatoires de chacune des variables.
   3. Dans les essais de compression radiale, calculer le diamètre antéropostérieur en détectant le point auquel la plaque entre en contact avec l’échantillon.
   4. Effectuer tous les tests à température ambiante.
2. Essais de traction
   1. Effectuer des essais de traction sur une machine d’essai universelle (UTM) de bureau de traction, équipée d’une charge de 100 N (résolution de force de 0,1 N, 0,001 mm de position et 0,1 s). La machine d’essai est équipée de capteurs de force et de position, et est connectée à un ordinateur avec un logiciel spécialement conçu par le fabricant²³.
   2. Enregistrez les données toutes les 0,4 s et exportez-les vers une feuille de calcul.
   3. Construire des mâchoires tendues adaptées au calibre moyen des trachées de lapin à partir de tubes creux en polychlorure de vinyle (PVC) cristallins monocouches purs et non toxiques d’un diamètre extérieur de 1 cm et d’une épaisseur de paroi de 1,5 mm.
   4. Couper les conduites en segments de 3 cm de long.
   5. Percez 12 trous préformés pour la suture termino-terminale, à 2 mm du bord des mâchoires et séparés par une distance de 2,5 mm, pour éviter les biais dus aux sutures.
   6. Fixer les tubes de verre PVC à la trachée de lapin par anastomose termino-terminale avec une suture continue à travers des trous préformés alternés (tous les 5 mm), à 2 mm du bord de la trachée et avec une suture monofilament en nylon 6-0.
   7. Étirer toutes les pièces à une vitesse de déplacement de 5,0 mm/min.
   8. Enregistrer les variables contrainte maximale (σ max, en N/mm²) et déformation (ε_max, sans unités), ainsi que l’énergie stockée par unité de volume de trachée (W/Vol, en mJ/mm) et le module de Young (E, en MPa).
3. Essais de compression radiale
   1. Effectuer des tests de compression radiale sur un UTM de bureau de compression, équipé d’un capteur de pesage de 15 N (résolution de force 0,001 N, position 0,001 mm et temps 0,1 s) pour obtenir des données de force (N), position (mm) et temps (s). Enregistrez les données et exportez-les vers une feuille de calcul à intervalles de 0,5 s.
   2. Placez les trachées avec la zone membraneuse reposant sur la plaque inférieure. La plaque monte progressivement vers la plaque supérieure à une vitesse constante de 5 mm/min.
   3. Calculez chaque unité par unité de longueur de l’échantillon (f en N/mm), de rigidité (R en Mpa·mm) et d’énergie par unité de surface (W / S en mJ/mm²) nécessaire pour obstruer complètement la trachée.

5. Technique chirurgicale

NOTE: La technique chirurgicale a été largement rapportée ailleurs²⁰.

1. Placez un stent en PVC intraluminal stérile, taille 14 Fr (ce qui lui permet de glisser librement sans comprimer les parois), avec une marge de 3-4 mm à chaque extrémité.
2. Fixez l’endoprothèse avec un seul point de monofilament en nylon 6-0 à travers l’espace intercartilagineux du premier cartilage.
3. Procéder à l’anesthésie des lapins.
   1. Prémédiquer les sujets (3,65-4,05 kg de lapins blancs néo-zélandais mâles) avec des analgésiques intramusculaires (35 mg / kg de kétamine) avec un sédatif, un relaxant musculaire et un analgésique (2,5 mg / kg de xylazine).
   2. Rasez la zone d’incision hors de la zone opératoire et nettoyez la zone chirurgicale pour enlever les poils.
   3. Administrer des analgésiques plus une antibioprophylaxie : 0,05 mg/kg de buprénorphine intramusculaire et 10 mg/kg d’enrofloxacine.
   4. Placez un cathéter veineux dans la veine marginale de l’oreille de chaque lapin.
   5. Inducter l’anesthésie avec un bolus intraveineux de 10 mg/kg de propofol.
   6. Surveillez les signes vitaux de l’animal à l’aide d’un électrocardiogramme à trois dérivations, d’une oxymétrie de pouls et d’une mesure de pression non invasive. Toutes les 30 minutes, appliquez du sérum physiologique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
   7. Vérifiez le plan anesthésique à l’aide de la méthode du pincement des orteils.
   8. Maintenir l’anesthésie avec de l’isoflurane inhalé à 1,5% -2% de la concentration alvéolaire minimale sans perdre la ventilation spontanée et fournir un soutien thermique au lapin avec un coussin chauffant.
4. Désinfectez la zone d’incision plusieurs fois dans un mouvement circulaire avec un gommage à base d’iode. Dans des conditions aseptiques en tout temps et avec du matériel stérile, pratiquer une incision thoracique centrale longitudinale de 3 cm et prélever des lambeaux pédiculaires bilatéraux composés d’un fascia pectoral et d’un composant musculaire.
5. Enveloppez les trachées avec le lambeau dans quatre lapins, un sur chaque hémithorax (soit un total de huit trachées).
6. Lorsque la chirurgie est terminée, inversez l’anesthésie en interrompant l’administration d’isoflurane.
7. Période postopératoire
   1. Gardez les animaux dans la salle d’opération jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis de l’anesthésie. Lorsqu’ils se sont complètement rétablis, retournez-les dans leur environnement avec d’autres lapins.
   2. Traiter les lapins avec des antibiotiques (0,5 mL/kg d’enrofloxacine à 2,5 %) et des analgésiques (5 mg/mL de méloxicam; 0,05 mL/kg de métacam) toutes les 24 heures pendant 5 jours.
   3. Laissez les implants in situ pendant la durée souhaitée.
   4. Avant l’euthanasie, prémédiquer les lapins avec des analgésiques intramusculaires (35 mg/kg de kétamine) et un sédatif, un relaxant musculaire et un analgésique (2,5 mg/kg de xylazine). Ensuite, euthanasier les lapins avec 133 mg/kg de pentobarbital sodique en injectant 200 mg/mL par la veine marginale de l’oreille et récolter les trachées.
   5. Effectuer des tests biomécaniques et histologiques sur les trachées.

6. Analyse statistique

1. Ajustez tous les modèles par la méthode bayésienne sur le logiciel R, version 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
2. Analyser les variables de l’étude, à l’exception de f et R, à l’aide de modèles de régression linéaire multiples.
3. Pour les variables f et R , appliquer des modèles de régression linéaire mixte. Dans ces modèles, en plus des variables d’intérêt liées au traitement et à l’état de chaque trachée, introduisez le pourcentage d’occlusion comme effet monotone et un terme indépendant par trachée comme facteur aléatoire.

Résultats

Décellularisation
La coloration DAPI montre l’absence d’ADN, et aucune valeur d’ADN supérieure à 50 ng n’a été détectée dans aucune des trachées par électrophorèse, tous les fragments étant inférieurs à 200 bp²⁰.

Culture microbienne
Deux des huit pièces soumises à 0,5 kGy ont montré un changement de couleur en moins de 1 semaine. Aucune des pièces irradiées à 1 kGy et 2 kGy n’a montré de changement de...

Discussion

Il existe plusieurs stratégies de stérilisation. Le_CO2supercritique pénètre complètement dans les tissus, acidifiant le milieu et déconstruisant la bicouche phospholipide cellulaire par simple élimination par dépressurisation de l’implant ^8,14,25. Le rayonnement ultraviolet a également été utilisé et son efficacité dans la trachée de rongeurs a été publiée, bien qu’il n’y ait que quelques rappor...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 nylon monofilament suture	Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA	SN-5698G
Amphotericin B 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15290018
Bioanalyzer	Agilent, Santa Clara, CA, USA	G2939BA
Buprenorphine	Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido	N02AE01
Compression desktop UTM	Microtest, Madrid, Spain	EM1/10/FR
Cryostate	Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3059
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)	DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich; MO, USA	D2650
DMEM	Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA	11965084
DNA extraction kit	DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany	4368814
Enrofloxacin, 2.5%	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain	SH20898.03IR
Fluorescence microscope	Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)	DM2500??
Freezing Container	Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain	5100-0001
Isofluorane	Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain	8.43603E+12
Ketamin	Imalgene. Merial; Toulouse, Francia	BOE127823
Linear accelerator	"True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA	H191001
Magnetic stirrer	Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia	BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	6283-MV
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Fischer Scientific, Madrid, Spain	12678646
Penicillin-streptomycin 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15140122
Pentobarbital sodium	Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España	3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	P2272
Propofol	Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania	G 151030
Proteinase K	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA	S3020
PVC hollow tubes	Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy	hhdddyyZ
PVC stent	ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey	019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core	R Foundation for Statistical Computing	R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	8,17,034
Spectrophotometer	Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands	ND-ONEC-W
Spreadsheet	Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA	2864993241
Traction Universal Testing Machine	Testing Machines, Veenendaal, Netherlands	84-01
UTM Software	TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA	100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Labs, Burlingame; CA; USA	H-1000-10
Xylacine	Xilagesic. Calier; Barcelona, España	20102-003