Niedrigdosis-Gammastrahlen-Sterilisation für dezellularisierte Trachealtransplantate

Zusammenfassung

Die Sterilisation ist für die Transplantation von Trachealgewebe unerlässlich. Hier stellen wir ein Sterilisationsprotokoll mit niedrig dosierter Gammastrahlung vor, das von den Organen voll verträglich ist.

Zusammenfassung

Einer der wichtigsten Schlüsselaspekte, um sicherzustellen, dass sich ein Transplantat korrekt entwickelt, ist die Sterilität des Mediums. Bei der dezellularisierten Trachealtransplantation wird ein Organ implantiert, das ursprünglich mit der Umwelt in Kontakt stand und somit nicht von vornherein steril war. Während das Dezellularisierungsprotokoll (durch Detergenzienexposition [2% Natriumdodecylsulfat], kontinuierliches Rühren und osmotische Schocks) im Einklang mit aseptischen Maßnahmen durchgeführt wird, sieht es keine Sterilisation vor. Eine der größten Herausforderungen besteht daher darin, die Sterilität vor der In-vivo-Implantation sicherzustellen. Obwohl es etablierte Gammastrahlungs-Sterilisationsprotokolle für anorganische Materialien gibt, gibt es keine solchen Maßnahmen für organische Materialien. Darüber hinaus können die für anorganische Materialien geltenden Protokolle nicht auf organische Materialien angewendet werden, da die festgelegte Strahlendosis (25 kGy) das Implantat vollständig zerstören würde. In dieser Arbeit wird die Wirkung einer erhöhten Strahlendosis in einer dezellularisierten Kaninchenluftröhre untersucht. Wir behielten den Dosisbereich (kGy) bei und testeten eskalierte Dosen, bis wir die minimale Dosis gefunden hatten, bei der die Sterilisation erreicht wird. Nachdem wir die Dosis bestimmt hatten, untersuchten wir die Auswirkungen auf das Organ, sowohl histologisch als auch biomechanisch. Wir stellten fest, dass 0,5 kGy zwar keine Sterilität erreichten, Dosen von 1 kGy und 2 kGy jedoch schon, wobei 1 kGy daher die minimale Dosis war, die für die Sterilisation erforderlich war. Mikroskopische Untersuchungen zeigten keine relevanten Veränderungen im Vergleich zu nicht sterilisierten Organen. Die axialen biomechanischen Eigenschaften wurden überhaupt nicht verändert, und es wurde nur eine geringe Verringerung der Kraft pro Längeneinheit beobachtet, die das Organ radial tolerieren kann. Wir können daher schlussfolgern, dass 1 kGy eine vollständige Sterilisation der dezellularisierten Kaninchenluftröhre mit minimalen, wenn überhaupt, Auswirkungen auf das Organ erreicht.

Einleitung

Die Sterilisation eines Implantats ist eine Grundvoraussetzung für seine Lebensfähigkeit. Tatsächlich haben sich Prothesen bewährt, die in sterilen Bereichen (Blutgefäße, Herz, Knochen usw.) implantiert wurden. ¹. Die Luftröhre hat zwei Oberflächen: eine Oberfläche in Kontakt mit der äußeren Umgebung, die daher nicht steril ist, und eine Oberfläche zum Mediastinum hin, die steril ist. Daher ist die Luftröhre ab dem Moment, in dem sie entnommen wird, kein steriles Organ. Obwohl der anschließende Dezellularisierungsprozess unter maximal sterilen Bedingungen durchgeführt wird, handelt es sich nicht um einen Sterilisationsschritt². Die Implantation von Fremdmaterial an sich birgt aufgrund der probakteriellen Mikroumgebung, die^{es erzeugt,}ein Infektionsrisiko 3 und ein Risiko von bis zu 0,014 % der Krankheitsübertragung vom Spender auf den Empfänger, selbst wenn das Material sterilisiert wurde⁴. Um eine korrekte Vaskularisierung der Luftröhre zu gewährleisten, wird sie in fast allen experimentellen Transplantationsprotokollen zunächst einer heterotopen Implantation ^5,6,7 in einen sterilen Bereich (Muskel, Faszien, Omentum, subkutan usw.) unterzogen. Dies liegt daran, dass die Implantation eines nicht sterilen Elements in dieses Medium zu einer Infektion des Bereichs³ führen würde.

Es gibt eine Reihe möglicher Strategien, um ein steriles Implantat zu erhalten. Durch die Verwendung von überkritischem_CO2wurde eine terminale Sterilisation ^8,9 erreicht. Andere Methoden, wie z. B. ultraviolette Strahlung oder die Behandlung mit Substanzen wie Peressigsäure, Ethanol, Sauerstoffperoxid und elektrolysiertem Wasser, haben unterschiedliche Erfolgsraten bei der Sterilisation erzielt, die fast immer von ihrer Dosierung abhängen, aber es hat sich gezeigt, dass sie die biomechanischen Eigenschaften von Implantaten beeinflussen. In der Tat können einige Substanzen, wie z. B. Ethylenoxid, die Struktur der implantierten Matrix erheblich verändern und sogar unerwünschte immunogene Wirkungen hervorrufen. Aus diesem Grund können viele dieser Strategien nicht auf biologische Modelle 2,10,11,12,13 angewendet werden.

Die am weitesten untersuchte und akzeptierte Sterilisationsstrategie ist die in der Norm ISO 11737-1:2006 festgelegte Sterilisationsstrategie für die Sterilisation von Medizinprodukten, die in Menschen implantiert wurden, mit einer Gammastrahlendosis von 25 kGy. Diese Vorschrift konzentriert sich jedoch nur auf die Sterilisation von inerten, nicht-biologischen Elementen^14,15. Darüber hinaus sind die Strahlentherapiedosen bei der radikalen Behandlung von Karzinomen um drei Größenordnungen niedriger als bei der Sterilisation von Medizinprodukten¹. Vor diesem Hintergrund können wir schlussfolgern, dass diese Dosis nicht nur die Mikrobiota abtöten, sondern auch die biologische Struktur des Implantats zerstören und radikal verändern würde. Es besteht auch die Möglichkeit, dass es beim Abbau Restlipide erzeugt, die potenziell zytotoxisch sein und den enzymatischen Abbau des Gerüsts^{beschleunigen können 13,14,15,16,17}, selbst wenn Dosen von nur ^1,9 kGy verwendet werden und die Schädigung direkt proportional zur erhaltenen Strahlendosis ist ¹⁷.

Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, zu versuchen, die Strahlendosis zu identifizieren, die es ermöglicht, ein steriles Implantat mit minimalen schädlichen Auswirkungen durch Bestrahlung zu erhalten 2,18,19. Die Strategie, die wir verfolgten, beinhaltete die Bestrahlung von dezellularisierten und bestrahlten Luftröhren mit unterschiedlich eskalierten Dosen innerhalb eines Bereichs von Kilogray (0,5, 1, 2, 3 kGy usw.), bis eine negative Kultur erreicht wurde. Für die Dosen, die negative Kulturen erreichten, wurden zusätzliche Tests durchgeführt, um die Sterilisation zu bestätigen. Nach der Bestimmung der Mindestdosis für die Sterilisation wurden die strukturellen und biomechanischen Auswirkungen der Bestrahlung auf die Luftröhre überprüft. Alle Metriken wurden mit den kontrollierten einheimischen Kaninchentracheen verglichen. Die Sterilisation des Konstrukts wurde dann in vivo getestet, indem die Luftröhren in neuseeländische weiße Kaninchen implantiert wurden.

Protokoll

Die europäische Richtlinie 20170/63/EU für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren wurde eingehalten und das Prüfprotokoll wurde von der Ethikkommission der Universität Valencia genehmigt (Gesetz 86/609/EWG und 214/1997 und Code 2018/VSC/PEA/0122 Typ 2 der Regierung von Valencia, Spanien).

1. Dezellularisierung der Trachea

ANMERKUNG: Über die Dezellularisierungsmethode wurde an anderer Stelle^{berichtet 20}.

1. Männliche erwachsene neuseeländische weiße Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) mit einem Gewicht von 3,5 bis 4,1 kg mit 133 mg/kg Pentobarbital-Natrium mit einer Injektion von 200 mg/ml durch die marginale Ohrvene einschläfern.
2. Führen Sie unter aseptischen Bedingungen eine zentrale Längszervikotomie durch, präparieren Sie die Halsmuskulatur und nähern Sie sich der Luftröhre. Präparieren Sie das Organ in Umfangs- und Längsrichtung. Zum Schluss transekten Sie unter dem ersten Ring und knapp über der Carina.
3. Schneiden Sie die Luftröhren mit einem Skalpell in 2 cm große Stücke. Entfernen Sie mit einer Schere das umliegende Bindegewebe und die innere Schleimhautschicht⁶.
4. Tauchen Sie die Proben in 12 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 5 % Penicillin-Streptomycin und 5 % Amphotericin B enthält.
5. Setzen Sie die Luftröhren 5 Wochen lang bei Raumtemperatur einem ständigen Rühren mit einem Magnetrührer bei 400 U/min aus. Ersetzen Sie die Dezellularisierungslösung wöchentlich nach einem 2-stündigen osmotischen Schock durch Eintauchen der Luftröhre in destilliertes Wasser.
6. Kryogene Sie die Proben mit einer 12-ml-Mischung aus 80 % fötalem Kälberserum (FBS) und 20 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Gefrierbehälter bei -80 °C.
7. Wenn die Luftröhren verwendet werden sollen (nach 13-15 Tagen), tauen Sie sie in einem Wasserbad bei 37 °C auf und waschen Sie sie, indem Sie sie nach dem Auftauen in PBS tauchen.

2. Sterilisation

1. Bestrahlung
   1. Chargen von vier Trachealstücken mit einer Größe von jeweils 2 cm in einen 20 ml Methacrylat in einen mit PBS gefüllten T25-Kulturkolben geben, bis ein Gesamtvolumen von 30 ml erreicht ist. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen bilden, die zu einer Energiediffusion in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche führen könnten.
   2. Führen Sie die Bestrahlung mit einem Linearbeschleuniger mit Photonen mit einer Nennenergie von 10 MV durch, die filterfreie Strahlen abflachen. Wenden Sie eine Dosisleistung von 2.400 Monitoreinheiten pro Minute am Isozentrum an, wobei die Luftröhren in einem Abstand von 100 cm zwischen Quelle und Oberfläche platziert werden, mit einer Schärfentiefe von 2,5 cm für ein Strahlungsfeld von 10 cm x 10 cm, um den gesamten Behälter abzudecken, was einer Dosis von 24 Gy/min entspricht.
   3. Eskalieren Sie die Dosen mit jeder vierteiligen Charge; vier Stücke werden 0,5 kGy, vier bis 1 kGy, vier bis 2 kG usw. ausgesetzt, bis die Sterilisation erreicht ist.
2. Kultur
   1. Geben Sie die Stücke in 30 ml Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM) mit inaktivierten 10% FBS ohne Antibiotika oder Antimykotika.
   2. In einem handelsüblichen Gewebeinkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ kultivieren und alle 24 h inspizieren.
      HINWEIS: Die Kontaminationsparameter sind Änderungen des pH-Werts des Nährmediums und dementsprechend Änderungen der Farbe und Trübung des Mediums. Die Luftröhren wurden von keimfreien Hasenartigen geerntet, die nicht krank waren und daher frei von anaeroben Bakterien in ihren Luftröhren waren.

3. Histologische Analyse

Anmerkungen: Färben Sie die Stücke mit Hämatoxylin und Eosin²¹, Massons Trichrom und Orcein²².

1. DAPI-Färbung
   1. Bestimmung der Gewebeviabilität mittels DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol). Diese blau fluoreszierende Färbung bindet stark an Adenin- und Thymin-reiche Regionen in DNA-Sequenzen und ermöglicht daher die Betrachtung der DNA mittels Fluoreszenzmikroskopie.
   2. Betten Sie die Gewebeproben in eine Mischung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) ein.
   3. Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostaten.
   4. Waschen Sie die zu färbende Probe dreimal in destilliertem Wasser, um die OG zu entfernen. Legen Sie sie in ein Eindeckmedium, das eine 30-nM-DAPI-Lösung enthält.
   5. Visualisierung der Fluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskopie.
2. Analyse des DNA-Gehalts
   1. Schneiden Sie mit einem Skalpell etwa 3 mm lange Luftröhrensegmente ab.
   2. 2 h in Proteinase K (Materialtabelle) inkubieren.
   3. Extrahieren Sie die DNA mit einem DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   4. Mittels Spektralphotometrie wird die DNA-Konzentration bestimmt, indem die Absorption bei 260/280 mit einem Spektralphotometer gemessen wird.
   5. Messen Sie die Größe der extrahierten DNA-Proben mittels Kapillarchromatographie mit einem Bioanalysator.

4. Biomechanische Studie

ANMERKUNG: Der Trachealwiderstand gegen Längs- und Querkräfte wird durch axiale Zug- und Radialdruckversuche²³ gemessen.

1. Trachealmessung
   1. Messen Sie die Tracheallänge, die Wandstärke und den Außendurchmesser mit einem Messschieber.
   2. Berechnen Sie die Durchschnittswerte aus drei zufälligen Messungen jeder der Variablen.
   3. Berechnen Sie bei den radialen Druckversuchen den anteroposterioren Durchmesser, indem Sie den Punkt ermitteln, an dem die Platte mit der Probe in Kontakt kommt.
   4. Führen Sie alle Tests bei Raumtemperatur durch.
2. Zugversuche
   1. Führen Sie Zugversuche an einer Traktions-Desktop-Universalprüfmaschine (UTM) durch, die mit einer Last von 100 N (0,1 N Kraftauflösung, 0,001 mm Position und 0,1 s) ausgestattet ist. Die Prüfmaschine ist mit Kraft- und Positionssensoren ausgestattet und mit einer speziell vom Hersteller entwickelten Software an einen Computer angeschlossen²³.
   2. Zeichnen Sie Daten alle 0,4 s auf und exportieren Sie sie in eine Tabelle.
   3. Aus reinen einlagigen, ungiftigen Kristall-Polyvinylchlorid (PVC)-Hohlrohren mit einem Außendurchmesser von 1 cm und einer Wandstärke von 1,5 mm werden an das mittlere Kaliber der Kaninchentracheen angepasste Zugbacken konstruiert.
   4. Schneiden Sie die Leitungen in 3 cm lange Segmente.
   5. Bohren Sie 12 vorgeformte Löcher für die Termino-Terminal-Naht, 2 mm von der Kante der Backen entfernt und mit einem Abstand von 2,5 mm, um eine Verzerrung durch die Nähte zu vermeiden.
   6. Befestigen Sie die PVC-Glasröhrchen durch terminoterminale Anastomose mit einer durchgehenden Naht durch abwechselnde vorgeformte Löcher (alle 5 mm), 2 mm vom Rand der Luftröhre entfernt und mit einer monofilen 6-0-Nylonnaht an der Kaninchenluftröhre.
   7. Dehnen Sie alle Teile mit einer Verdrängungsrate von 5,0 mm/min.
   8. Erfassen Sie die Variablen maximale Spannung (σ max, in N/mm²) und Dehnung (ε_max, ohne Einheiten) zusammen mit der gespeicherten Energie pro Einheit des Luftröhrenvolumens (W/Vol, in mJ/mm) und dem Elastizitätsmodul (E, in MPa).
3. Radiale Druckversuche
   1. Führen Sie radiale Drucktests auf einem Kompressions-Desktop-UTM durch, das mit einer 15-N-Wägezelle (Kraftauflösung 0,001 N, Position 0,001 mm und Zeit 0,1 s) ausgestattet ist, um Kraftdaten (N), Position (mm) und Zeit (s) zu erhalten. Zeichnen Sie Daten auf und exportieren Sie sie in Intervallen von 0,5 Sekunden in eine Tabelle.
   2. Platzieren Sie die Luftröhren so, dass der membranöse Bereich auf der unteren Platte aufliegt. Die Platte steigt mit einer konstanten Geschwindigkeit von 5 mm/min allmählich in Richtung der oberen Platte an.
   3. Berechnen Sie jede Einheit pro Einheit der Länge der Probe (f in N/mm), der Steifigkeit (R in Mpa·mm) und der Energie pro Oberflächeneinheit (W / S in mJ/mm²), die erforderlich ist, um die Luftröhre vollständig zu verschließen.

5. Operationstechnik

ANMERKUNG: Über die Operationstechnik wurde an anderer Stelle ausführlich berichtet²⁰.

1. Setzen Sie einen sterilen intraluminalen PVC-Stent der Größe 14 Fr ein (der es ermöglicht, frei zu gleiten, ohne die Wände zu komprimieren), mit einem Rand von 3-4 mm an jedem Ende.
2. Fixieren Sie den Stent mit einem einzigen 6-0 Nylon-Monofilamentstich durch den Knorpelfall des ersten Knorpels.
3. Fahren Sie mit der Betäubung der Kaninchen fort.
   1. Die Probanden (3,65-4,05 kg männliche weiße neuseeländische Kaninchen) werden mit intramuskulären Analgetika (35 mg/kg Ketamin) mit einem Beruhigungsmittel, einem Muskelrelaxans und einem Analgetikum (2,5 mg/kg Xylazin) vorbehandelt.
   2. Rasieren Sie die Schnittzone aus der Operationszone heraus und reinigen Sie den Operationsbereich, um die Haare zu entfernen.
   3. Verabreichung von Analgetika plus Antibiotikaprophylaxe: 0,05 mg/kg intramuskuläres Buprenorphin und 10 mg/kg Enrofloxacin.
   4. Legen Sie bei jedem Kaninchen einen Venenkatheter in die marginale Ohrvene.
   5. Induktion der Anästhesie mit einem intravenösen Bolus von 10 mg/kg Propofol.
   6. Überwachen Sie die Vitalfunktionen des Tieres mit einem Dreikanal-Elektrokardiogramm, Pulsoximetrie und nicht-invasiver Druckmessung. Tragen Sie alle 30 Minuten ein physiologisches Serum auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
   7. Überprüfen Sie die Anästhesieebene mit der Zehenklemmmethode.
   8. Halten Sie die Anästhesie mit inhalativem Isofluran bei 1,5 % bis 2 % der minimalen Alveolarkonzentration aufrecht, ohne die spontane Belüftung zu verlieren, und unterstützen Sie das Kaninchen mit einem Heizkissen thermisch.
4. Desinfizieren Sie die Einschnittzone mehrmals in kreisenden Bewegungen mit einem jodhaltigen Peeling. Machen Sie unter aseptischen Bedingungen und mit sterilem Material einen 3 cm langen zentralen Thoraxschnitt und ernten Sie bilaterale gestielte Lappen, die aus Brustfaszie und einer Muskelkomponente bestehen.
5. Wickeln Sie die Luftröhren mit dem Lappen in vier Kaninchen ein, eines auf jedem Hemithorax (also insgesamt acht Luftröhren).
6. Wenn die Operation abgeschlossen ist, machen Sie die Anästhesie rückgängig, indem Sie die Verabreichung von Isofluran unterbrechen.
7. Postoperative Phase
   1. Behalten Sie die Tiere im Operationssaal, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben. Wenn sie sich vollständig erholt haben, bringen Sie sie mit anderen Kaninchen in ihre Umgebung zurück.
   2. Behandeln Sie die Kaninchen 5 Tage lang alle 24 h mit Antibiotika (0,5 ml/kg 2,5 % Enrofloxacin) und Analgetika (5 mg/ml Meloxicam; 0,05 ml/kg Metacam).
   3. Lassen Sie die Implantate für die gewünschte Zeit an Ort und Stelle .
   4. Vor der Euthanasie werden die Kaninchen mit intramuskulären Analgetika (35 mg/kg Ketamin) und einem Beruhigungsmittel, Muskelrelaxans und Analgetikum (2,5 mg/kg Xylazin) behandelt. Dann werden die Kaninchen mit 133 mg/kg Pentobarbitalnatrium mit einer 200 mg/ml-Injektion durch die marginale Ohrvene eingeschläfert und die Luftröhren entnommen.
   5. Führen Sie biomechanische und histologische Tests an den Luftröhren durch.

6. Statistische Analyse

1. Passen Sie alle Modelle mit der Bayes'schen Methode in der R-Software, Version 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019) an.
2. Analysieren Sie die Studienvariablen mit Ausnahme von f und R mithilfe mehrerer linearer Regressionsmodelle.
3. Wenden Sie für die f - und R-Variablen gemischte lineare Regressionsmodelle an. In diesen Modellen wird zusätzlich zu den interessierenden Variablen, die sich auf die Behandlung und den Zustand jeder Luftröhre beziehen, der Prozentsatz der Okklusion als monotoner Effekt und ein unabhängiger Term pro Luftröhre als Zufallsfaktor eingeführt.

Ergebnisse

Dezellularisierung
Die DAPI-Färbung zeigt das Fehlen von DNA, und durch Elektrophorese wurden in keiner der Tracheen DNA-Werte über 50 ng nachgewiesen, wobei alle Fragmente kleiner als 200 bp²⁰ waren.

Mikrobielle Kultur
Zwei der acht Stücke, die 0,5 kGy ausgesetzt wurden, zeigten eine Farbveränderung in weniger als 1 Woche. Keines der mit 1 kGy und 2 kGy bestrahlten Stücke zeigte eine Farbveränderung (Ab...

Diskussion

Es gibt verschiedene Sterilisationsstrategien. Überkritisches CO₂dringt vollständig in das Gewebe ein, säuert das Medium an und dekonstruiert die zelluläre Phospholipiddoppelschicht mit einfacher Eliminierung durch Druckentlastung des Implantats ^8,14,25. Ultraviolette Strahlung wurde ebenfalls verwendet, und ihre Wirksamkeit in der Luftröhre von Nagetieren wurde veröffentlicht, obwohl es nur wenige Berichte in d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-0 nylon monofilament suture	Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA	SN-5698G
Amphotericin B 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15290018
Bioanalyzer	Agilent, Santa Clara, CA, USA	G2939BA
Buprenorphine	Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido	N02AE01
Compression desktop UTM	Microtest, Madrid, Spain	EM1/10/FR
Cryostate	Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania	CM3059
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)	DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich; MO, USA	D2650
DMEM	Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA	11965084
DNA extraction kit	DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany	4368814
Enrofloxacin, 2.5%	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	0035-0002
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain	SH20898.03IR
Fluorescence microscope	Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany)	DM2500??
Freezing Container	Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain	5100-0001
Isofluorane	Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain	8.43603E+12
Ketamin	Imalgene. Merial; Toulouse, Francia	BOE127823
Linear accelerator	"True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA	H191001
Magnetic stirrer	Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia	BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml	Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany	6283-MV
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)	Fischer Scientific, Madrid, Spain	12678646
Penicillin-streptomycin 5%	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA	15140122
Pentobarbital sodium	Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España	3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	P2272
Propofol	Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania	G 151030
Proteinase K	Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA	S3020
PVC hollow tubes	Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy	hhdddyyZ
PVC stent	ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey	019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core	R Foundation for Statistical Computing	R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich; MO, USA	8,17,034
Spectrophotometer	Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands	ND-ONEC-W
Spreadsheet	Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA	2864993241
Traction Universal Testing Machine	Testing Machines, Veenendaal, Netherlands	84-01
UTM Software	TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA	100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Labs, Burlingame; CA; USA	H-1000-10
Xylacine	Xilagesic. Calier; Barcelona, España	20102-003