Inyección intramiocárdica para el estudio de la función linfática cardíaca en el pez cebra

Resumen

El protocolo actual permite la entrega eficiente y estable de microesferas fluorescentes (MS) y puntos cuánticos (QD) en el miocardio de peces vivos que pueden ser rastreados (rastreados) a lo largo del tiempo.

Resumen

El pez cebra ha demostrado ser un modelo importante para estudiar la formación y función cardiovascular durante el desarrollo y la regeneración postembrionaria. El presente protocolo describe un método para inyectar trazadores fluorescentes en el miocardio del pez cebra para estudiar la absorción de líquido intersticial y desechos en los vasos linfáticos cardíacos. Para ello, se introducen microesferas (200 nm de diámetro) y puntos cuánticos (<10 nm de diámetro) en el miocardio de peces cebra vivos, que pueden rastrearse mediante microscopía confocal ex vivo . Luego, estos marcadores se rastrean de forma intermitente durante varias horas para seguir el aclaramiento desde el miocardio hasta los vasos linfáticos cardíacos. Los puntos cuánticos se transportan a través de los vasos linfáticos cardíacos lejos del corazón, mientras que las microesferas más grandes permanecen en el lugar de la inyección durante más de tres semanas. Este método de inyección intramiocárdica puede extenderse a otros usos, incluida la inyección de MS encapsulada o hidrogeles para liberar localmente células, proteínas o compuestos de interés para una región específica del corazón.

Introducción

El sistema linfático es esencial para mantener el equilibrio tejido-líquido, la modulación de la respuesta inmunitaria tras una lesión y la absorción de lípidos en el^intestino. La evidencia acumulada respalda las amplias funciones del sistema linfático en diversos contextos de enfermedad y desarrollo. Sin embargo, los estudios mecanicistas se ven obstaculizados porque los vasos linfáticos pueden ser difíciles de visualizar y su funcionalidad puede ser incierta. Las primeras técnicas de imagen se basaban en la capacidad natural del sistema linfático para absorber intersticialmente los trazadores inyectados y luego transportarlos a través de la red de vasos linfáticos, lo que permitía la detección y visualización¹. Este método no solo se puede utilizar para visualizar los linfáticos, sino que también se puede utilizar para cuantificar su capacidad para absorber líquido y macromoléculas del tejido.

La vasta red linfática también abarca el sistema linfático cardíaco, que se ha demostrado que desempeña un papel integral en la regeneración del pez cebra ^2,3,4. Comprender las diferencias y similitudes en la función linfática entre las diferentes especies es crucial para utilizar este conocimiento clínicamente. Por lo tanto, existe la necesidad de explorar las tecnologías que pueden medir y visualizar la función linfática en diferentes organismos modelo ^5,6. Los linfáticos son vasos de extremo romo que transportan líquido en una dirección, lejos del tejido⁷. Se requiere la inyección intramiocárdica de tintes fluorescentes para observar el drenaje linfático del tejido cardíaco. Las inyecciones intramiocárdicas también se han utilizado clínicamente y en modelos preclínicos de mamíferos para trasplantar células madre y progenitoras o compuestos exógenos como el hidrogel para probar la mejora de la función cardíaca después de un infarto de miocardio ^8,9,10. La inyección intramiocárdica de pez cebra no se ha descrito en detalle, lo que ha limitado el uso de tales enfoques experimentales para el corazón del pez cebra.

Las inyecciones en el espacio pericárdico del pez cebra y en el flujo sanguíneo sistémico dentro de la luz del corazón han sido descritas en detalle anteriormente^11,12, y se ha reportado la inyección intramiocárdica exitosa de trazadores fluorescentes en pez cebra adulto². El presente artículo proporciona un protocolo detallado para la realización de inyecciones intramiocárdicas en pez cebra adulto. Varias líneas de peces cebra transgénicos pueden identificar vasos linfáticos; Sin embargo, es necesario explorar enfoques para comprender el drenaje linfático o visualizar los linfáticos en ausencia de marcadores transgénicos. Aquí se utilizan trazadores fluorescentes, microesferas (MS) y puntos cuánticos (QD) para visualizar el lugar de la inyección y el flujo de líquido hacia los linfáticos cardíacos. Los QD son nanocristales fluorescentes de <10 nm de diámetro cuyas propiedades ópticas pueden ajustarse y adaptarse para servir a muchas aplicaciones biomédicas^13,14. Los QD son fácilmente absorbidos por los vasos linfáticos, pero no por la vasculatura sanguínea cuando se inyectan intersticialmente^15,16. Los MS son perlas de poliestireno recubiertas con fluorescencia de aproximadamente 200 nm de diámetro¹⁵. Como tal, las EM son considerablemente más grandes que las QD y significativamente más persistentes cuando se inyectan en el miocardio, lo que permite una identificación consistente del sitio de inyección. Este método es útil para estudiar la función linfática durante la regeneración cardíaca, pero se puede adaptar para estudiar varios aspectos de la biología cardíaca utilizando la introducción localizada estable de perlas recubiertas, hidrogeles o preparaciones celulares.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Weill Cornell Medicine (protocolo 2020-0027) y siguieron las pautas adecuadas. Los siguientes experimentos se realizaron con machos y hembras de pez cebra AB de tipo salvaje de 14 a 20 meses después de la fertilización para los adultos, y 35 días después de la fertilización para los juveniles.

1. Extracción de agujas y preparación de reactivos

1. Tire de un capilar de vidrio de borosilicato estándar de 1,2 mm de diámetro exterior (diámetro exterior) utilizando un extractor de agujas (Figura 1A, B) (consulte la Tabla de materiales), en dos agujas utilizando ajustes óptimos. En este caso, calentar 525; tirar 65; velocidad 60; tiempo 250.
2. Vortex obtuvo comercialmente soluciones coloidales de MS (1% de sólidos en agua) y QD (2 μM, ver Tabla de Materiales).
   NOTA: La solución coloidal MS es de color blanco y se ve fácilmente cuando se inyecta.
3. Filtre 500 μL de solución coloidal MS a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm (consulte la Tabla de materiales) para minimizar la obstrucción de la aguja.
4. Para preparar la solución coloidal de trabajo de solo MS, diluya 100 μL de la solución coloidal MS filtrada con 100 μL de PBS (solución salina tamponada con fosfato) 1x.
5. Para preparar la solución coloidal de trabajo de MS y QD, mezcle 100 μL de la solución coloidal MS filtrada con 100 μL de la solución coloidal QD.
   NOTA: Dependiendo del experimento, MS y QD se pueden mezclar o inyectar individualmente.
6. Prepare y disponga los reactivos y el equipo necesarios: estereoscopio, esponja húmeda, micromanipulador, inyector, pipeta de 20 μL, solución de tricaña, tijeras de iridectomía recta, fórceps, agujas extraídas, femtopuntas de microcargador, tanques de recuperación y redes como se muestra en la Figura 1D (ver Tabla de Materiales).
7. Abra el suministro de aire del inyector y configure el pulso de inyección con compuerta en lugar del pulso de inyección temporizado.
   NOTA: Para conocer los detalles instrumentales, consulte la Tabla de Materiales. Algunos instrumentos requieren que el pedal de inyección se inserte en el puerto de entrada con compuerta en la parte posterior del instrumento.

2. Preparación de la estación de inyección y preparación del pez cebra

1. Encienda el microscopio de disección y ajuste el enfoque.
2. Con las puntas de pipeta del microcargador, cargue la solución de control (p. ej., rojo de fenol al 0,05 % en 1x PBS).
3. Inserte la aguja en el soporte de la aguja del microinyector.
4. Bajo el microscopio de disección, corte la aguja extraída a 1 mm de la punta con pinzas.
   NOTA: Cortar la aguja lo más estrecha posible es óptimo para perforar el miocardio. Sin embargo, si la aguja es demasiado estrecha, puede doblarse al intentar penetrar en el tejido cardíaco.
5. Ajuste la presión de inyección adecuada a alrededor de 0,50 kPa/7,3 psi, y la presión de equilibrio a alrededor de 0 psi para que no haya retracción de líquido en la aguja (Figura 1C).
6. Una vez alcanzada la presión deseada, pruebe la configuración de inyección y registre el tiempo necesario para inyectar un bolo de solución en aceite mineral de menos de 1 mm de diámetro (<0,5 μL).
   NOTA: Lo ideal es que la inyección libere el fluido a aproximadamente 50 nL/s para dar un diámetro aproximado del bolo de 0,8 mm en 5 s. Dependiendo del diámetro de la punta de la aguja, se pueden realizar ajustes en el tiempo y la presión para inyectar 0,25-0,3 μL en un solo pez durante una inyección de 5 s. Es deseable una presión de inyección más alta, en lugar de un tiempo de inyección más largo, para garantizar que la alta presión del tejido intersticial pueda superarse durante la inyección.
7. Cargue la aguja con el volumen seleccionado (por ejemplo, 10-15 μL, Figura 1B) de solución inyectable y repita los pasos 2.5-2.6.
   NOTA: Las inyecciones con compuerta permitirán inyectarse durante todo el tiempo que se presione el pedal, lo que permite realizar ajustes en la posición de la punta hasta que se encuentre el sitio de inyección intratejido correcto.
8. Inserte la aguja cargada con solución inyectable en el soporte de la aguja del microinyector.

3. Inyección

1. Prepara una esponja acanalada tallando un contorno similar al de un pez en el medio.
2. Prepare la concentración de trabajo de tricaína diluyendo 4,2 mL de solución madre (4 mg/mL) en 100 mL de agua de las instalaciones piscícolas (ver Tabla de Materiales) en un plato de cristalización.
3. Anestesiar al pez cebra en solución de tricaína hasta que se reduzca el movimiento de las branquias y haya dejado de nadar.
   NOTA: Pellizque la cola para confirmar la pérdida de respuesta en el pez cebra anestesiado.
4. Coloque el pez cebra con su lado ventral hacia la lente del objetivo en la esponja ranurada humedecida bajo el microscopio de disección (Figura 2A y Figura 3A).
5. Utilice las tijeras de iridectomía para hacer un pequeño corte transversal a nivel de las aletas pectorales y abrir la cavidad torácica (Video complementario 1).
6. Con fórceps, retire suavemente el pericardio para exponer el ápice del corazón (Figura 3B).
7. Con el portaagujas cargado en la mano, dirija la aguja hacia el vértice del ventrículo en un ángulo agudo de <30° con respecto al eje del cuerpo.
8. Inserte una aguja de 0,1-0,2 mm en el corazón sin penetrar demasiado profundamente en el ventrículo (Figura 2B y Figura 3B).
   NOTA: Si el extremo de la punta de la aguja se llena de sangre, retraiga ligeramente la aguja para evitar inyectar la EM y la QD en la luz ventricular.
9. Con la aguja insertada en el ápex del corazón, eleve ligeramente el ventrículo lejos del cuerpo reduciendo el ángulo entre la aguja y el eje del cuerpo mientras mueve la punta de la aguja hacia la base del corazón (Figura 2C y Figura 3C).
   NOTA: La aguja puede ser débilmente visible a través de la pared miocárdica.
10. Empuje la aguja más hacia la cabeza para que la punta de la aguja se mueva hacia la superficie del miocardio.
11. Inyecte presionando el pedal del dispositivo de microinyección durante ~ 1-5 s o hasta que se vea una mancha blanca dentro del tejido cardíaco (Figuras 2C y Figura 3C, D).
12. Si la cavidad torácica comienza a llenarse de líquido inyectable durante la inyección, indica que la punta de la aguja ha penetrado completamente en el miocardio (Figura 2D). Retire la aguja lentamente hasta que se vea una acumulación de microperlas dentro del tejido.
13. Vuelva a colocar la punta de la aguja si el líquido se inyecta en la luz ventricular y se elimina con los latidos cardíacos posteriores (Figura 2E). En tal situación, levante la punta de la aguja y empuje la aguja hacia la dirección de la cabeza hasta que la presión de la inyección dé como resultado una mancha blanca en el tejido.
14. Si no se ve ningún líquido blanco o mancha, la aguja de inyección está bloqueada. En tal situación, retraiga la aguja por completo. Para continuar con el experimento, rompa ligeramente la punta de la aguja o reemplace la aguja. En ambos casos, compruebe el flujo de inyección antes de reinyectar el miocardio.
15. Después de una inyección exitosa, retire suavemente la aguja del miocardio (Figura 3F) e inmediatamente transfiera el pez cebra a un tanque de recuperación con agua de la instalación de peces.
16. Vigila al pez hasta que se recupere totalmente de la tricaína.
17. Transfiera los peces recuperados a un tanque de 2,8 L y colóquelo en la instalación de peces, hasta el punto de tiempo deseado para la extracción del corazón.

4. Extracción del corazón e imágenes

1. Prepare la concentración de trabajo de tricaína diluyendo 4,2 mL de solución madre (4 mg/mL) en 100 mL de agua de las instalaciones de peces en un plato de cristalización.
2. Anestesiar terminalmente al pez cebra en solución de tricaína hasta que el movimiento de las branquias se haya detenido y no responda.
3. Transfiera el pez cebra a una esponja ranurada humedecida debajo del microscopio de disección ubicado con el lado ventral frente a la lente del objetivo.
4. Abrir la pared ventral del tórax con unas tijeras de iridectomía a la altura de las aletas pectorales.
5. Abra el saco pericárdico y localice la vía de salida del corazón. Use fórceps para agarrar la aorta anterior a la arteriola bulbosa (BA) y tire cuidadosamente de ellas hacia arriba con la base del ventrículo.
6. Con el polo anterior del corazón levantado, corte la aorta ventral/seno venoso para liberar el corazón y colóquelo en una placa de Petri de 35 mm que contenga PBS.
7. Con fórceps, retire los coágulos de sangre y fije el corazón en PFA al 4% (peso/vol) durante 15 minutos.
8. Tome imágenes de los corazones utilizando un microscopio capaz de adquirir las longitudes de onda fluorescentes utilizadas.
   NOTA: En la fecha de ejemplo, se utilizó un microscopio confocal con líneas láser 405, 488, 567 y 647.
9. Utilice el software ImageJ/Fiji (consulte la Tabla de materiales) para el análisis de imágenes.
   NOTA: El cálculo del enriquecimiento de QD o MS se realizó utilizando el umbral alto o bajo y las funciones de selección de creación con el canal de los vasos linfáticos para seleccionar primero las regiones de los vasos linfáticos y las que carecen de señal de los vasos. A continuación, se utilizó la función Medir para medir la intensidad de píxeles del canal QD o MS, a partir de la cual se calculó una relación de las dos selecciones.

Resultados

Inmediatamente después de la inyección, debe ser visible una pequeña región blanca de la pared miocárdica (Figura 3F). Esta región mostrará un marcaje fluorescente brillante de la MS y QD inyectadas (Figura 4B, E). Además, puede haber puntos de fluorescencia débiles y esporádicos en la superficie externa del corazón debido a cualquier QD y MS en el espacio pericárdico después del procedimiento (

Discusión

En el presente artículo se describe un método para introducir material exógeno en el miocardio del pez cebra. Esta técnica fue desarrollada para introducir QD y MS en el miocardio para estudiar la función linfática en la homeostasis y la regeneración ^2,18. Un abordaje similar también se ha utilizado para introducir QD en el miocardio de ratones con el fin de investigar la presencia y función de los linfáticos después d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water with sea salt and sodium bicarbonate added to a conductivity of 226uS and pH of 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	no filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vascular label
Sponge	any	any	(1.5 × 5 × 3 cm) with groove (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentration: 4 mg/mL