Zebra Balıklarında Kardiyak Lenfatik Fonksiyonun İncelenmesi için İntramiyokard Enjeksiyonu

Özet

Mevcut protokol, floresan mikroküreciklerin (MS) ve kuantum noktalarının (QD) zaman içinde izlenebilen (izlenebilen) canlı balıkların miyokardına verimli ve istikrarlı bir şekilde iletilmesini sağlar.

Özet

Zebra balığı, embriyonik sonrası gelişim ve rejenerasyon sırasında kardiyovasküler oluşumu ve işlevi incelemek için önemli bir model olduğunu kanıtlamıştır. Mevcut protokol, kardiyak lenfatik damarlara interstisyel sıvı ve kalıntı alımını incelemek için zebra balığı miyokardına floresan izleyiciler enjekte etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bunu yapmak için, canlı zebra balığının miyokardına mikro küreler (200 nm çapında) ve kuantum noktaları (<10 nm çapında) sokulur ve bunlar ex vivo konfokal mikroskopi kullanılarak izlenebilir. Bu izleyiciler daha sonra miyokarddan kardiyak lenfatik damarlara geçişi takip etmek için birkaç saat boyunca aralıklı olarak izlenir. Kuantum noktaları, kalpten uzakta kardiyak lenfatik damarlar yoluyla taşınırken, daha büyük mikro küreler enjeksiyon bölgesinde üç haftadan fazla kalır. Bu intramiyokardiyal enjeksiyon yöntemi, kalbin hedeflenen bir bölgesine lokal olarak hücreleri, proteinleri veya ilgilenilen bileşikleri salmak için kapsüllenmiş MS veya hidrojellerin enjeksiyonu da dahil olmak üzere diğer kullanımlara genişletilebilir.

Giriş

Lenfatik sistem, doku-sıvı dengesini korumak, yaralanma sonrası bağışıklık tepkisinin modülasyonu ve bağırsaktaki lipitlerin emilmesi^{için gereklidir 1}. Biriken kanıtlar, lenfatik sistemin çeşitli hastalık ve gelişimsel bağlamlardaki geniş rollerini desteklemektedir. Bununla birlikte, lenfatik damarların görselleştirilmesi zor olabileceğinden ve işlevleri belirsiz olabileceğinden mekanik çalışmalar engellenmektedir. Erken görüntüleme teknikleri, lenfatik sistemin enjekte edilen izleyicileri interstisyel olarak absorbe etme ve daha sonra bunları lenfatik damar ağı boyunca taşıma konusundaki doğal yeteneğine dayanıyordu ve bu da tespit ve görselleştirmeye izin veriyordu¹. Bu yöntem sadece lenfatikleri görselleştirmek için değil, aynı zamanda dokudan sıvı ve makromolekülleri alma yeteneklerini ölçmek için de kullanılabilir.

Geniş lenfatik ağ, zebra balığı rejenerasyonunda ayrılmaz bir rol oynadığı gösterilen kardiyak lenfatik sistemi de kapsar ^2,3,4. Farklı türler arasında lenfatik fonksiyondaki farklılıkları ve benzerlikleri anlamak, bu bilgiyi klinik olarak kullanmak için çok önemlidir. Bu nedenle, farklı model organizmalarda lenfatik fonksiyonu ölçebilen ve görselleştirebilen teknolojilerin araştırılmasına ihtiyaç vardır ^5,6. Lenfatikler, sıvıyı dokudan uzağa tek yönde taşıyan künt uçlu damarlardır⁷. Kardiyak dokudan lenfatik drenajı gözlemlemek için floresan boyaların intramiyokardiyal enjeksiyonu gereklidir. İntramiyokardiyal enjeksiyonlar ayrıca klinik olarak ve klinik öncesi memeli modellerinde, miyokard enfarktüsünden sonra kalp fonksiyonunun iyileşmesini test etmek için kök ve progenitör hücreleri veya hidrojel gibi eksojen bileşikleri nakletmek için kullanılmıştır ^8,9,10. Zebra balığı intramiyokardiyal enjeksiyonu ayrıntılı olarak tanımlanmamıştır, bu da zebra balığı kalbine bu tür deneysel yaklaşımların kullanımını sınırlamıştır.

Zebra balığının perikardiyal boşluğuna yapılan enjeksiyonlar ve kalbin lümeni içindeki sistemik kan akışı daha önce ayrıntılı olarak tanımlanmıştır^11,12 ve yetişkin zebra balıklarında floresan izleyicilerin başarılı intramiyokardiyal enjeksiyonu bildirilmiştir². Bu makale, yetişkin zebra balıklarında intramiyokardiyal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Birkaç transgenik zebra balığı hattı lenfatik damarları tanımlayabilir; Bununla birlikte, lenfatik drenajı anlamak veya transgenik belirteçlerin yokluğunda lenfatikleri görselleştirmek için yaklaşımları araştırmaya ihtiyaç vardır. Floresan izleyiciler, mikro küreler (MS) ve kuantum noktaları (QD) burada enjeksiyon bölgesini ve kardiyak lenfatiklere sıvı akışını görselleştirmek için kullanılır. QD, optik özellikleri birçok biyomedikal uygulamaya hizmet edecek şekilde ayarlanabilen ve uyarlanabilen, <10 nm çapında floresan nanokristallerdir^13,14. QD, lenfatik damarlar tarafından kolayca alınır, ancak interstisyel olarak enjekte edildiğinde kan damar sistemi tarafından alınmaz^15,16. MS, çapı yaklaşık 200 nm olan floresan kaplı polistiren boncuklardır¹⁵. Bu nedenle, MS, QD'den önemli ölçüde daha büyüktür ve miyokard içine enjekte edildiğinde önemli ölçüde daha kalıcıdır, bu da enjeksiyon bölgesinin tutarlı bir şekilde tanımlanmasına izin verir. Bu yöntem, kardiyak rejenerasyon sırasında lenfatik fonksiyonu incelemek için yararlıdır, ancak kaplanmış boncukların, hidrojellerin veya hücre preparatlarının stabil lokalize girişini kullanarak kardiyak biyolojinin çeşitli yönlerini incelemek için uyarlanabilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Weill Cornell Medicine'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokol 2020-0027) tarafından onaylandı ve uygun yönergeleri izledi. Aşağıdaki deneyler, yetişkinler için döllenmeden 14 ila 20 ay sonra ve yavrular için döllenmeden 35 gün sonra erkek ve dişi AB yabani tip zebra balığı ile gerçekleştirildi.

1. İğne çekme ve reaktif hazırlama

1. Bir iğne çektirmesi (Şekil 1A,B) (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak 1,2 mm OD (dış çap) standart borosilikat cam kılcalını optimum ayarları kullanarak iki iğneye çekin. Bu durumda, ısı 525; 65'i çekin; hız 60; zaman 250.
2. Vorteks ticari olarak elde edilen MS (suda% 1 katılar) ve QD'nin (2 μM, Malzeme Tablosuna bakınız) stok kolloidal çözeltileri.
   NOT: MS kolloidal solüsyonu beyaz renktedir ve enjekte edildiğinde kolayca görülür.
3. İğnenin tıkanmasını en aza indirmek için 500 μL MS stok kolloidal solüsyonunu 0.45 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ( Malzeme Tablosuna bakınız).
4. Sadece MS'nin çalışma kolloidal çözeltisini hazırlamak için, filtrelenmiş MS kolloidal çözeltisinin 100 μL'sini 100 μL 1x PBS (Fosfat tamponlu salin) ile seyreltin.
5. MS ve QD'nin çalışan kolloidal çözeltisini hazırlamak için, filtrelenmiş MS kolloidal çözeltisinin 100 μL'sini 100 μL QD kolloidal çözeltisi ile karıştırın.
   NOT: Deneye bağlı olarak, MS ve QD ayrı ayrı karıştırılabilir veya enjekte edilebilir.
6. Gerekli reaktifleri ve ekipmanı hazırlayın ve düzenleyin: stereoskop, ıslak sünger, mikromanipülatör, enjektör, 20 μL pipet, tricaine solüsyonu, düz iridektomi makası, forseps, çekilmiş iğneler, mikro yükleyici femtouçları, geri kazanım tankları ve ağlar Şekil 1D'de gösterildiği gibi (bkz.
7. Enjektör hava beslemesini açın ve zamanlanmış enjeksiyon darbesi yerine kapılı enjeksiyon darbesini ayarlayın.
   NOT: Enstrümantal ayrıntılar için lütfen Malzeme Tablosuna bakın. Bazı enstrümanlar, enjeksiyon pedalının enstrümanın arka tarafındaki kapılı giriş bağlantı noktasına takılmasını gerektirir.

2. Enjeksiyon istasyonu hazırlığı ve zebra balığı hazırlama

1. Diseksiyon mikroskobunu açın ve odağı ayarlayın.
2. Mikro yükleyici pipet uçlarıyla kontrol solüsyonunu yükleyin (örn. 1x PBS'de %0,05 fenol kırmızısı).
3. İğneyi mikroenjektörün iğne tutucusuna yerleştirin.
4. Diseksiyon mikroskobu altında, çekilen iğneyi forseps kullanarak uçtan 1 mm uzakta kesin.
   NOT: İğneyi mümkün olduğunca dar kesmek, miyokardiyumu delmek için en uygunudur. Bununla birlikte, iğne çok darsa, kalp dokusuna nüfuz etmeye çalışırken bükülebilir.
5. Uygun enjeksiyon basıncını yaklaşık 0.50 kPa/7.3 psi'ye ve denge basıncını yaklaşık 0 psi'ye ayarlayın, böylece iğneye sıvı geri çekilmesi olmaz (Şekil 1C).
6. İstenen basınca ulaşıldığında, enjeksiyon kurulumunu test edin ve çapı 1 mm'den (<0,5 μL) daha küçük olan mineral yağa bir bolus çözelti enjekte etmek için geçen süreyi kaydedin.
   NOT: İdeal olarak, enjeksiyon, 5 saniyede yaklaşık 0,8 mm'lik bir bolus çapı vermek için sıvıyı yaklaşık 50 nL/s'de serbest bırakmalıdır. İğnenin uç çapına bağlı olarak, 5 saniyelik bir enjeksiyonda tek bir balığa 0.25-0.3 μL enjekte etmek için zaman ve basınçta ayarlamalar yapılabilir. Enjeksiyon sırasında yüksek interstisyel doku basıncının üstesinden gelinebilmesini sağlamak için daha uzun bir enjeksiyon süresinin aksine daha yüksek enjeksiyon basıncı arzu edilir.
7. İğneyi seçilen hacimde (örn., 10-15 μL, Şekil 1B) enjeksiyon çözeltisi ile yükleyin ve 2.5-2.6 adımlarını tekrarlayın.
   NOT: Kapılı enjeksiyonlar, ayak pedalına basıldığı sürece enjeksiyon yapılmasına izin vererek, doğru doku içi enjeksiyon bölgesi bulunana kadar uç pozisyonunun ayarlanmasına izin verir.
8. Enjeksiyon solüsyonu yüklü iğneyi mikroenjektörün iğne tutucusuna yerleştirin.

3. Enjeksiyon

1. Ortasına balık benzeri bir taslak oyarak yivli bir sünger hazırlayın.
2. Kristalleştirici bir kapta 4.2 mL stok çözeltisini (4 mg / mL) 100 mL balık tesisi suyuna (Malzeme Tablosuna bakınız) seyrelterek tricaine çalışma konsantrasyonunu hazırlayın.
3. Zebra balığını, solungaçların hareketi azalana ve yüzmeyi bırakana kadar tricaine solüsyonunda uyuşturun.
   NOT: Anestezi uygulanmış zebra balığında yanıt kaybını doğrulamak için kuyruğu sıkıştırın.
4. Zebra balığını, ventral tarafı objektif merceğe bakacak şekilde, diseksiyon mikroskobu altında nemli yivli süngere yerleştirin (Şekil 2A ve Şekil 3A).
5. Göğüs yüzgeçleri seviyesinde küçük bir enine kesim yapmak ve göğüs boşluğunu açmak için iridektomi makası kullanın (Ek Video 1).
6. Forseps ile, kalbin tepesini ortaya çıkarmak için perikardı nazikçe soyun (Şekil 3B).
7. Yüklü iğne tutucu elinizdeyken, iğneyi vücut eksenine <30°'lik dar bir açıyla ventrikülün tepesine doğru yönlendirin.
8. 0.1-0.2 mm'lik bir iğneyi ventrikülün çok derinine nüfuz etmeden kalbe sokun (Şekil 2B ve Şekil 3B).
   NOT: İğnenin uç ucu kanla dolarsa, MS ve QD'nin ventriküler lümene enjekte edilmesini önlemek için iğneyi hafifçe geri çekin.
9. İğne kalbin tepesine sokulduğunda, iğne ucunu kalbin tabanına doğru hareket ettirirken iğne ile vücut ekseni arasındaki açıyı azaltarak ventrikülü vücuttan hafifçe kaldırın (Şekil 2C ve Şekil 3C).
   NOT: İğne, miyokard duvarından hafifçe görülebilir.
10. İğneyi başa doğru itin, böylece iğne ucu miyokard yüzeyine doğru hareket eder.
11. Mikroenjeksiyon cihazının pedalına ~1-5 saniye veya kalp dokusu içinde beyaz bir nokta görünene kadar basarak enjekte edin (Şekil 2C ve Şekil 3C,D).
12. Enjeksiyon yapılırken göğüs boşluğu enjeksiyon sıvısı ile dolmaya başlarsa, iğne ucunun miyokarda tamamen nüfuz ettiğini gösterir (Şekil 2D). Doku içinde bir mikro boncuk birikimi görünene kadar iğneyi yavaşça geri çekin.
13. Sıvı ventriküler lümene enjekte edilirse ve sonraki kalp atışı ile temizlenirse iğne ucunu yeniden konumlandırın (Şekil 2E). Böyle bir durumda, iğnenin ucunu kaldırın ve enjeksiyon basıncı dokuda beyaz bir nokta oluşana kadar iğneyi başın yönüne doğru itin.
14. Beyaz bir sıvı veya nokta görünmüyorsa, enjeksiyon iğnesi tıkanır. Böyle bir durumda, iğneyi tamamen geri çekin. Deneye devam etmek için ya iğnenin ucunu hafifçe kırın ya da iğneyi değiştirin. Her iki durumda da, miyokardiyumu yeniden enjekte etmeden önce enjeksiyon akışını kontrol edin.
15. Başarılı bir enjeksiyondan sonra, iğneyi miyokarddan yavaşça çekin (Şekil 3F) ve zebra balığını hemen balık tesisi suyu ile bir geri kazanım tankına aktarın.
16. Balıkları trikainden tamamen iyileşene kadar izleyin.
17. Kurtarılan balıkları 2,8 L'lik bir tanka aktarın ve kalp ekstraksiyonu için istenen zaman noktasına kadar balık tesisine yerleştirin.

4. Kalp ekstraksiyonu ve görüntüleme

1. Kristalleştirici bir kapta 4.2 mL stok çözeltisini (4 mg / mL) 100 mL balık tesisi suyuna seyrelterek trikserin çalışma konsantrasyonunu hazırlayın.
2. Solungaçların hareketi durana ve yanıt vermeyene kadar zebra balığını tricaine solüsyonunda terminal olarak uyuşturun.
3. Zebra balığını, ventral tarafı objektif merceğe bakacak şekilde konumlandırılmış diseksiyon mikroskobu altında nemli yivli bir süngere aktarın.
4. Göğsün ventral duvarını göğüs yüzgeçleri seviyesinde iridektomi makası ile açın.
5. Perikardiyal kesesi açın ve kalbin çıkış yolunu bulun. Bulbous Arteriosus'un (BA) aort anteriorunu kavramak için forseps kullanın ve ventrikül tabanı ile dikkatlice yukarı çekin.
6. Kalbin ön kutbu kaldırılmış durumdayken, kalbi serbest bırakmak için ventral aort / sinüs venosusunu kesin ve PBS içeren 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
7. Forseps kullanarak, kan pıhtılarını çıkarın ve kalbi 15 dakika boyunca% 4 PFA (wt / vol) olarak sabitleyin.
8. Kullanılan floresan dalga boylarını elde edebilen bir mikroskop kullanarak kalpleri görüntüleyin.
   NOT: Örnek tarihte, 405, 488, 567 ve 647 lazer çizgisine sahip bir konfokal mikroskop kullanılmıştır.
9. Görüntü analizi için ImageJ/Fiji yazılımını kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
   NOT: QD veya MS zenginleştirmesinin hesaplanması, yüksek veya düşük eşikleme kullanılarak gerçekleştirildi ve önce lenfatik damarların bölgelerini ve damar sinyali olmayan bölgeleri seçmek için lenfatik damar kanalı ile seçim fonksiyonları oluşturuldu . Daha sonra, iki seçimin oranının hesaplandığı QD veya MS kanalının piksel yoğunluğunu ölçmek için Measure fonksiyonu kullanıldı.

Sonuçlar

Enjeksiyondan hemen sonra, miyokard duvarının küçük beyaz bir bölgesi görünür olmalıdır (Şekil 3F). Bu bölge, enjekte edilen MS ve QD'nin parlak floresan etiketlemesini gösterecektir (Şekil 4B, E). Ek olarak, prosedürü takiben perikardiyal boşluktaki herhangi bir QD ve MS'den kalbin dış yüzeyinde zayıf ve sporadik floresan punkta olabilir (Şekil 4B, E<...

Tartışmalar

Bu makale, zebra balığının miyokardına ekzojen materyal eklemek için bir yöntemi tanımlamıştır. Bu teknik, homeostaz ve rejenerasyonda lenfatik fonksiyonu incelemek için miyokarda QD ve MS eklemek için geliştirilmiştir ^2,18. Benzer bir yaklaşım, miyokard enfarktüsünden sonra lenfatiklerin varlığını ve işlevini araştırmak için farelerin miyokardına QD'yi sokmak için de kullanılmıştır

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water with sea salt and sodium bicarbonate added to a conductivity of 226uS and pH of 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	no filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vascular label
Sponge	any	any	(1.5 × 5 × 3 cm) with groove (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentration: 4 mg/mL