Интрамиокардиальная инъекция для изучения лимфатической функции сердца у рыбок данио

Резюме

Настоящий протокол позволяет эффективно и стабильно доставлять флуоресцентные микросферы (МС) и квантовые точки (КТ) в миокард живой рыбы, которые можно отследить (отследить) с течением времени.

Аннотация

Рыбки данио оказались важной моделью для изучения формирования и функции сердечно-сосудистой системы во время постэмбрионального развития и регенерации. В настоящем протоколе описан способ введения флуоресцентных индикаторов в миокард рыбки данио-рерио для изучения поглощения интерстициальной жидкости и мусора в сердечных лимфатических сосудах. Для этого в миокард живых рыбок данио вводят микросферы (диаметр 200 нм) и квантовые точки (диаметр <10 нм), которые можно отследить с помощью конфокальной микроскопии ex vivo . Затем эти индикаторы отслеживаются с перерывами в течение нескольких часов, чтобы проследить за выведением из миокарда в сердечные лимфатические сосуды. Квантовые точки транспортируются по лимфатическим сосудам сердца от сердца, в то время как более крупные микросферы остаются в месте инъекции более трех недель. Этот метод интрамиокардиальной инъекции может быть расширен для других применений, включая инъекцию инкапсулированного РС или гидрогелей для локального высвобождения клеток, белков или соединений, представляющих интерес, в целевую область сердца.

Введение

Лимфатическая система необходима для поддержания баланса тканей и жидкости, модуляции иммунного ответа после травмы и всасывания липидов в кишечнике¹. Накопленные фактические данные подтверждают широкую роль лимфатической системы в различных заболеваниях и условиях развития. Тем не менее, механистические исследования затруднены, потому что лимфатические сосуды может быть трудно визуализировать, а их функциональность может быть неопределенной. Ранние методы визуализации основывались на естественной способности лимфатической системы интерстициально поглощать введенные индикаторы, а затем транспортировать их через сеть лимфатических сосудов, что позволяло обнаруживать и визуализировать¹. Этот метод может быть использован не только для визуализации лимфатических сосудов, но и для количественной оценки их способности поглощать жидкость и макромолекулы из ткани.

Обширная лимфатическая сеть также охватывает сердечную лимфатическую систему, которая, как было показано, играет неотъемлемую роль в регенерации рыбок данио ^2,3,4. Понимание различий и сходств в лимфатической функции у разных видов имеет решающее значение для использования этих знаний в клинической практике. Таким образом, существует необходимость в изучении технологий, которые могут измерять и визуализировать лимфатическую функцию у различных модельных организмов ^5,6. Лимфатические сосуды представляют собой сосуды с тупым концом, которые транспортируют жидкость в одном направлении, от тканей⁷. Интрамиокардиальное введение флуоресцентных красителей требуется для наблюдения за лимфодренажем из сердечной ткани. Интрамиокардиальные инъекции также использовались в клинической практике и на доклинических моделях млекопитающих для трансплантации стволовых и прогениторных клеток или экзогенных соединений, таких как гидрогель, для тестирования на улучшение функции сердца после инфаркта миокарда ^8,9,10. Интрамиокардиальная инъекция рыбок данио не была подробно описана, что ограничило использование таких экспериментальных подходов сердцем рыбок данио.

Инъекции в перикардиальное пространство рыбок данио и системный кровоток в просвете сердца были подробно описаны ранее^11,12, а также сообщалось об успешном интрамиокардиальном введении флуоресцентных индикаторов взрослым рыбкам данио². В настоящей статье представлен подробный протокол проведения интрамиокардиальных инъекций взрослым рыбкам данио-рерио. Несколько трансгенных линий рыбок данио могут идентифицировать лимфатические сосуды; Тем не менее, существует необходимость в изучении подходов к пониманию лимфодренажа или визуализации лимфатических сосудов в отсутствие трансгенных маркеров. Флуоресцентные индикаторы, микросферы (МС) и квантовые точки (КТ) используются для визуализации места инъекции и потока жидкости в сердечные лимфатические системы. QD представляют собой флуоресцентные нанокристаллы диаметром <10 нм, оптические свойства которых могут быть настроены и адаптированы для использования во многих биомедицинских приложениях^13,14. КТ легко поглощаются лимфатическими сосудами, но не кровеносной сосудистой сетью при интерстициальном введении^15,16. MS представляют собой полистирольные шарики с флуоресцентным покрытием диаметром около 200 нм¹⁵. Таким образом, РС значительно больше, чем QD, и значительно более стойкие при введении в миокард, что позволяет последовательно идентифицировать место инъекции. Этот метод полезен для изучения лимфатической функции во время регенерации сердца, но может быть адаптирован для изучения различных аспектов биологии сердца с использованием стабильного локализованного введения покрытых гранул, гидрогелей или клеточных препаратов.

протокол

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Weill Cornell Medicine (протокол 2020-0027) и соответствовали надлежащим рекомендациям. Следующие эксперименты были проведены с самцами и самками дикого типа данио-рерио AB в возрасте от 14 до 20 месяцев после оплодотворения для взрослых особей и через 35 дней после оплодотворения для молоди.

1. Вытягивание иглы и подготовка реагента

1. Втяните стандартный капилляр из боросиликатного стекла с наружным диаметром 1,2 мм с помощью съемника игл (рис. 1A, B) (см. Таблицу материалов) в две иглы с оптимальными настройками. В этом случае используется нагрев 525; тяга 65; скорость 60; время 250.
2. Компания Vortex коммерчески получила стоковые коллоидные растворы MS (1% твердых веществ в воде) и QD (2 мкМ, см. таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коллоидный раствор МС имеет белый цвет и легко заметен при введении.
3. Отфильтруйте 500 мкл стокового коллоидного раствора MS через шприцевой фильтр 0,45 мкм (см. Таблицу материалов), чтобы свести к минимуму засорение иглы.
4. Для приготовления рабочего коллоидного раствора только МС разбавьте 100 мкл отфильтрованного коллоидного раствора МС со 100 мкл 1x PBS (фосфатно-солевой буфер).
5. Для приготовления рабочего коллоидного раствора МС и КТ смешать 100 мкл отфильтрованного коллоидного раствора МС со 100 мкл коллоидного раствора КТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от эксперимента, МС и КТ могут смешиваться или вводиться по отдельности.
6. Подготовьте и расположите необходимые реагенты и оборудование: стереоскоп, влажную губку, микроманипулятор, инжектор, пипетку на 20 мкл, раствор трикаина, прямые ножницы для иридэктомии, щипцы, вытянутые иглы, фемтотипы микропогрузчика, восстановительные баки и сетки, как показано на рисунке 1D (см. Таблицу материалов).
7. Включите подачу воздуха в форсунку и настройте стробированный импульс впрыска, а не синхронизированный импульс впрыска.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об инструменте, пожалуйста, смотрите Таблицу материалов. Некоторые инструменты требуют, чтобы педаль впрыска была вставлена в входной порт на задней стороне инструмента.

2. Подготовка станции впрыска и подготовка рыбок данио

1. Включите препарирующий микроскоп и отрегулируйте фокусировку.
2. С помощью наконечников для пипеток микрозагрузчика загрузите контрольный раствор (например, 0,05% фенолового красного в 1x PBS).
3. Вставьте иглу в иглодержатель микроинъектора.
4. Под рассекающим микроскопом разрежьте вытянутую иглу на расстоянии 1 мм от кончика с помощью щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрезание иглы как можно более узким является оптимальным для прокалывания миокарда. Однако, если игла слишком узкая, она может согнуться при попытке проникнуть в сердечную ткань.
5. Установите соответствующее давление впрыска на уровне около 0,50 кПа/7,3 фунта на квадратный дюйм, а давление баланса на уровне около 0 фунтов на квадратный дюйм, чтобы не происходило втягивания жидкости в иглу (Рисунок 1C).
6. Как только желаемое давление будет достигнуто, проверьте установку впрыска и запишите время, затраченное на впрыскивание болюса раствора в минеральное масло диаметром менее 1 мм (<0,5 мкл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале инъекция должна высвобождать жидкость со скоростью примерно 50 нл/с, чтобы получить приблизительный диаметр болюса 0,8 мм за 5 с. В зависимости от диаметра кончика иглы можно регулировать время и давление, чтобы ввести 0,25-0,3 мкл в одну рыбу в течение 5 секунд. Более высокое давление инъекции, в отличие от более длительного времени инъекции, желательно для того, чтобы гарантировать, что высокое давление в интерстициальной ткани может быть преодолено во время инъекции.
7. Загрузите иглу выбранным объемом (например, 10-15 μл, рис. 1В) раствора для инъекций и повторите шаги 2,5-2,6.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Закрытые инъекции позволяют делать инъекции до тех пор, пока нажата ножная педаль, что позволяет регулировать положение кончика до тех пор, пока не будет найдено подходящее место внутритканевой инъекции.
8. Вставьте иглу, загруженную раствором для инъекций, в иглодержатель микроинъектора.

3. Инъекция

1. Подготовьте губку с бороздками, вырезав посередине контур, похожий на рыбу.
2. Рабочую концентрацию трикаина приготовить, разбавив 4,2 мл исходного раствора (4 мг/мл) в 100 мл воды рыбохозяйственного комплекса (см. Таблицу материалов) в кристаллизующей чашке.
3. Обезболивайте рыбку данио в растворе трикаина до тех пор, пока движение жабр не уменьшится и она не перестанет плавать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Защипните хвост, чтобы подтвердить потерю реакции у рыбок данио, находящихся под наркозом.
4. Расположите рыбку данио рерио брюшной стороной к линзе объектива во влажной губке с бороздками под препарирующим микроскопом (рис. 2А и рис. 3А).
5. С помощью иридэктомических ножниц сделайте небольшой поперечный надрез на уровне грудных плавников и откройте грудную полость (Дополнительное видео 1).
6. С помощью щипцов аккуратно отклейте перикард, чтобы обнажить верхушку сердца (рисунок 3B).
7. Держа в руке заряженный иглодержатель, направьте иглу к верхушке желудочка под острым углом <30° к оси тела.
8. Введите иглу 0,1-0,2 мм в сердце, не проникая слишком глубоко в желудочек (рисунок 2Б и рисунок 3В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если кончик иглы заполнен кровью, слегка втяните иглу, чтобы избежать введения МС и КТ в просвет желудочка.
9. Вставив иглу в верхушку сердца, слегка приподнимите желудочек в сторону от тела, уменьшая угол между иглой и осью тела, одновременно перемещая кончик иглы к основанию сердца (Рисунок 2C и Рисунок 3C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Игла может быть слабо заметна через стенку миокарда.
10. Протолкните иглу дальше к головке, чтобы кончик иглы переместился к поверхности миокарда.
11. Вводите инъекцию, нажимая на педаль устройства для микроинъекций в течение ~1-5 с или до тех пор, пока в сердечной ткани не станет видно белое пятно (Рисунки 2C и Рисунок 3C, D).
12. Если грудная полость начинает заполняться инъекционной жидкостью во время инъекции, это указывает на то, что кончик иглы полностью проник в миокард (рисунок 2D). Медленно извлекайте иглу, пока в ткани не станет заметно скопление микрогранул.
13. Измените положение кончика иглы, если жидкость вводится в просвет желудочка и очищается с последующим сердцебиением (рисунок 2E). В такой ситуации поднимите кончик иглы и толкайте иглу в направлении головки до тех пор, пока давление инъекции не приведет к появлению белого пятна в ткани.
14. Если белая жидкость или пятно не видны, то игла для инъекции заблокирована. В такой ситуации полностью втяните иглу. Чтобы продолжить эксперимент, либо слегка сломайте кончик иглы, либо замените иглу. В обоих случаях проверьте поток инъекции перед повторной инъекцией миокарда.
15. После успешной инъекции осторожно извлеките иглу из миокарда (рисунок 3F) и немедленно перенесите рыбок данио в резервуар для восстановления с водой для рыб.
16. Следите за рыбой до тех пор, пока она полностью не оправится от трикаина.
17. Пересадите собранных рыб в резервуар объемом 2,8 л и поместите его в рыбный цех до желаемого момента извлечения сердца.

4. Экстракция и визуализация сердца

1. Рабочую концентрацию трикаина приготовить, разбавив 4,2 мл исходного раствора (4 мг/мл) в 100 мл воды рыбохозяйственного комплекса в кристаллизующей чашке.
2. Смертельно обезболивайте рыбку данио в растворе трикаина до тех пор, пока движение жабр не прекратится и она не перестанет реагировать.
3. Переложите рыбку данио на смоченную губку с бороздками под препарирующий микроскоп вентральной стороной к линзе объектива.
4. Вскройте брюшную стенку грудной клетки ножницами для иридэктомии на уровне грудных плавников.
5. Откройте перикардиальный мешок и найдите путь оттока сердца. С помощью щипцов захватите аорту перед луковичной артериозной артерией (БА) и осторожно подтяните их вверх вместе с основанием желудочка.
6. Приподняв передний полюс сердца, разрежьте вентральную аорту/венозный синус, чтобы освободить сердце, и поместите в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую PBS.
7. С помощью щипцов удалите сгустки крови и зафиксируйте сердце в 4% PFA (масс./об.) на 15 минут.
8. Визуализируйте сердца с помощью микроскопа, способного регистрировать используемые длины флуоресцентных волн.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном примере дате использовался конфокальный микроскоп с 405, 488, 567 и 647 лазерными линиями.
9. Используйте программное обеспечение ImageJ/Fiji (см. Таблицу материалов) для анализа изображений.
   Примечание: Расчет обогащения QD или MS проводили с использованием функций высокого или низкого порога и создания селекции с каналом лимфатических сосудов для первого выбора областей лимфатических сосудов и участков с отсутствующим сосудистым сигналом. Затем функция Measure использовалась для измерения интенсивности пикселей канала QD или MS, из которого было вычислено отношение двух выборок.

Результаты

Сразу после инъекции должен быть виден небольшой белый участок стенки миокарда (рисунок 3F). В этой области будет видна яркая флуоресцентная маркировка введенных МС и КС (рис. 4B, E). Кроме того, после процедуры на внешней поверхно?...

Обсуждение

В настоящей статье описан способ введения экзогенного материала в миокард рыбок данио. Эта методика была разработана для введения QD и MS в миокард для изучения лимфатической функции в гомеостазе и регенерации ^2,18. Аналогичный подход так?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water with sea salt and sodium bicarbonate added to a conductivity of 226uS and pH of 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	no filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vascular label
Sponge	any	any	(1.5 × 5 × 3 cm) with groove (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentration: 4 mg/mL