Injeção intramiocárdica para o estudo da função linfática cardíaca em peixe-zebra

Resumo

O protocolo atual permite a entrega eficiente e estável de microesferas fluorescentes (MS) e pontos quânticos (QD) no miocárdio de peixes vivos que podem ser rastreados (rastreados) ao longo do tempo.

Resumo

O peixe-zebra provou ser um modelo importante para estudar a formação e função cardiovascular durante o desenvolvimento e regeneração pós-embrionária. O presente protocolo descreve um método para injetar traçadores fluorescentes no miocárdio do peixe-zebra para estudar a captação de líquido intersticial e detritos nos vasos linfáticos cardíacos. Para isso, microesferas (200 nm de diâmetro) e pontos quânticos (<10 nm de diâmetro) são introduzidos no miocárdio do peixe-zebra vivo, que podem ser rastreados usando microscopia confocal ex vivo . Esses traçadores são então rastreados intermitentemente por várias horas para acompanhar a depuração do miocárdio para os vasos linfáticos cardíacos. Os pontos quânticos são transportados através dos vasos linfáticos cardíacos para longe do coração, enquanto microesferas maiores permanecem no local da injeção por mais de três semanas. Este método de injeção intramiocárdica pode ser estendido a outros usos, incluindo a injeção de MS encapsulada ou hidrogéis para liberar localmente células, proteínas ou compostos de interesse para uma região específica do coração.

Introdução

O sistema linfático é essencial para manter o equilíbrio tecido-fluido, a modulação da resposta imune após a lesão e a absorção de lipídios no intestino¹. Evidências acumuladas apóiam os amplos papéis do sistema linfático em vários contextos de doenças e desenvolvimento. No entanto, os estudos mecanicistas são dificultados porque os vasos linfáticos podem ser difíceis de visualizar e sua funcionalidade pode ser incerta. As primeiras técnicas de imagem dependiam da capacidade natural do sistema linfático de absorver intersticialmente os traçadores injetados e, em seguida, transportá-los através da rede de vasos linfáticos, permitindo a detecção e visualização¹. Esse método não apenas pode ser usado para visualizar os linfáticos, mas também pode ser usado para quantificar sua capacidade de absorver fluidos e macromoléculas do tecido.

A vasta rede linfática também abrange o sistema linfático cardíaco, que demonstrou desempenhar um papel fundamental na regeneração do peixe-zebra ^2,3,4. Compreender as diferenças e semelhanças na função linfática entre diferentes espécies é crucial para utilizar esse conhecimento clinicamente. Portanto, há uma necessidade de explorar as tecnologias que podem medir e visualizar a função linfática em diferentes organismos modelo ^5,6. Os linfáticos são vasos de extremidade romba que transportam fluido em uma direção, para longe do tecido⁷. A injeção intramiocárdica de corantes fluorescentes é necessária para observar a drenagem linfática do tecido cardíaco. As injeções intramiocárdicas também têm sido utilizadas clinicamente e em modelos pré-clínicos de mamíferos para transplante de células-tronco e progenitoras ou compostos exógenos, como o hidrogel, para testar a melhora da função cardíaca após o infarto do miocárdio ^8,9,10. A injeção intramiocárdica de peixe-zebra não foi descrita em detalhes, o que limitou o uso de tais abordagens experimentais para o coração de peixe-zebra.

Injeções no espaço pericárdico do peixe-zebra e no fluxo sanguíneo sistêmico dentro do lúmen do coração foram descritas em detalhes anteriormente^11,12, e a injeção intramiocárdica bem-sucedida de marcadores fluorescentes em peixes-zebra adultos foi relatada 2. O presente artigo fornece um protocolo detalhado para a realização de injeções intramiocárdicas em peixes-zebra adultos. Várias linhagens de peixe-zebra transgênico podem identificar vasos linfáticos; no entanto, é necessário explorar abordagens para entender a drenagem linfática ou visualizar os linfáticos na ausência de marcadores transgênicos. Traçadores fluorescentes, microesferas (MS) e pontos quânticos (QD) são usados aqui para visualizar o local da injeção e o fluxo de fluido para os linfáticos cardíacos. QD são nanocristais fluorescentes de <10 nm de diâmetro cujas propriedades ópticas podem ser ajustadas e adaptadas para atender a muitas aplicações biomédicas^13,14. Os QD são prontamente absorvidos pelos vasos linfáticos^, mas não pela vasculatura sanguínea, quando injetados intersticialmente^15,16. MS são esferas de poliestireno revestidas com fluorescência de aproximadamente 200 nm de diâmetro¹⁵. Como tal, a EM é consideravelmente maior que a QD e significativamente mais persistente quando injetada no miocárdio, permitindo a identificação consistente do local da injeção. Este método é útil para estudar a função linfática durante a regeneração cardíaca, mas pode ser adaptado para estudar vários aspectos da biologia cardíaca usando a introdução localizada estável de esferas revestidas, hidrogéis ou preparações celulares.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Weill Cornell Medicine (protocolo 2020-0027) e seguiram as diretrizes adequadas. Os experimentos a seguir foram realizados com machos e fêmeas de peixe-zebra AB do tipo selvagem com idade entre 14 e 20 meses após a fertilização para adultos e 35 dias após a fertilização para juvenis.

1. Extração de agulhas e preparação de reagentes

1. Puxe um capilar de vidro borossilicato padrão de 1.2 mm OD (diâmetro externo) usando um extrator de agulha (Figura 1A,B) (consulte a Tabela de Materiais), em duas agulhas usando as configurações ideais. Neste caso, aqueça 525; puxar 65; velocidade 60; tempo 250.
2. A Vortex obteve comercialmente soluções coloidais de MS (1% de sólidos em água) e QD (2 μM, ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A solução coloidal MS é de cor branca e facilmente vista quando injetada.
3. Filtre 500 μL de solução coloidal estoque de MS através de um filtro de seringa de 0,45 μm (consulte a Tabela de Materiais) para minimizar o entupimento da agulha.
4. Para preparar a solução coloidal de trabalho apenas de MS, dilua 100 μL da solução coloidal MS filtrada com 100 μL de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato).
5. Para preparar a solução coloidal de trabalho de MS e QD, misture 100 μL da solução coloidal MS filtrada com 100 μL da solução coloidal QD.
   NOTA: Dependendo do experimento, MS e QD podem ser misturados ou injetados individualmente.
6. Prepare e organize os reagentes e equipamentos necessários: estereoscópio, esponja úmida, micromanipulador, injetor, pipeta de 20 μL, solução de tricaína, tesoura de iridectomia reta, fórceps, agulhas puxadas, microcarregadores de femtotips, tanques de recuperação e redes, conforme mostrado na Figura 1D (ver Tabela de Materiais).
7. Ligue o suprimento de ar do injetor e configure o pulso de injeção fechado em vez do pulso de injeção cronometrado.
   NOTA: Para obter os detalhes instrumentais, consulte a Tabela de Materiais. Alguns instrumentos exigem que o pedal de injeção seja inserido na porta de entrada fechada na parte de trás do instrumento.

2. Preparação da estação de injeção e preparação do peixe-zebra

1. Ligue o microscópio de dissecação e ajuste o foco.
2. Com as pontas de pipeta do microcarregador, carregue a solução de controle (por exemplo, vermelho de fenol a 0,05% em 1x PBS).
3. Insira a agulha no porta-agulha do microinjetor.
4. Sob o microscópio de dissecação, corte a agulha puxada a 1 mm da ponta usando uma pinça.
   NOTA: Cortar a agulha o mais estreito possível é ideal para perfurar o miocárdio. No entanto, se a agulha for muito estreita, ela pode dobrar ao tentar penetrar no tecido cardíaco.
5. Defina a pressão de injeção apropriada para cerca de 0.50 kPa/7.3 psi e a pressão de equilíbrio para cerca de 0 psi para que não haja retração do líquido na agulha (Figura 1C).
6. Assim que a pressão desejada for atingida, teste a configuração da injeção e registre o tempo necessário para injetar um bolus de solução em óleo mineral com menos de 1 mm de diâmetro (<0,5 μL).
   NOTA: Idealmente, a injeção deve liberar o fluido a aproximadamente 50 nL / s para obter um diâmetro aproximado de bolus de 0.8 mm em 5 s. Dependendo do diâmetro da ponta da agulha, ajustes no tempo e na pressão podem ser feitos para injetar 0,25-0,3 μL em um único peixe durante uma injeção de 5 s. Uma pressão de injeção mais alta, em oposição a um tempo de injeção mais longo, é desejável para garantir que a alta pressão do tecido intersticial possa ser superada durante a injeção.
7. Carregue a agulha com o volume selecionado (por exemplo, 10-15 μL, Figura 1B) da solução injetável e repita as etapas 2,5-2,6.
   NOTA: As injeções fechadas permitirão injetar enquanto o pedal estiver pressionado, permitindo que ajustes da posição da ponta sejam feitos até que o local correto de injeção intratecidual seja encontrado.
8. Insira a agulha carregada com solução injetável no porta-agulha do microinjetor.

3. Injeção

1. Prepare uma esponja ranhurada esculpindo um contorno semelhante a um peixe no meio.
2. Preparar a concentração de trabalho de tricaína diluindo 4,2 ml de solução-mãe (4 mg/ml) em 100 ml de água de instalação para peixes (ver Tabela de Materiais) numa placa de cristalização.
3. Anestesiar o peixe-zebra em solução de tricaína até que o movimento das brânquias seja reduzido e ele pare de nadar.
   NOTA: Aperte a cauda para confirmar a perda de resposta no peixe-zebra anestesiado.
4. Posicione o peixe-zebra com o lado ventral voltado para a lente objetiva na esponja ranhurada umedecida sob o microscópio de dissecação (Figura 2A e Figura 3A).
5. Use uma tesoura de iridectomia para fazer um pequeno corte transversal ao nível das nadadeiras peitorais e abra a cavidade torácica (Vídeo Suplementar 1).
6. Com uma pinça, retire suavemente o pericárdio para expor o ápice do coração (Figura 3B).
7. Com o porta-agulha carregado na mão, direcione a agulha em direção ao ápice do ventrículo em um ângulo agudo de <30° em relação ao eixo do corpo.
8. Insira uma agulha de 0,1-0,2 mm no coração sem penetrar muito profundamente no ventrículo (Figura 2B e Figura 3B).
   NOTA: Se a ponta da agulha se encher de sangue, retraia ligeiramente a agulha para evitar injetar o MS e o QD no lúmen ventricular.
9. Com a agulha inserida no ápice do coração, levante levemente o ventrículo para longe do corpo, reduzindo o ângulo entre a agulha e o eixo do corpo enquanto move a ponta da agulha em direção à base do coração (Figura 2C e Figura 3C).
   NOTA: A agulha pode ser fracamente visível através da parede do miocárdio.
10. Empurre a agulha mais em direção à cabeça para que a ponta da agulha se mova em direção à superfície do miocárdio.
11. Injete pressionando o pedal do dispositivo de microinjeção por ~ 1-5 s ou até que uma mancha branca seja visível dentro do tecido cardíaco (Figuras 2C e Figura 3C, D).
12. Se a cavidade torácica começar a se encher com fluido de injeção durante a injeção, isso indica que a ponta da agulha penetrou completamente no miocárdio (Figura 2D). Retire a agulha lentamente até que um acúmulo de microesferas seja visível dentro do tecido.
13. Reposicione a ponta da agulha se o fluido for injetado no lúmen ventricular e limpo com o batimento cardíaco subsequente (Figura 2E). Em tal situação, levante a ponta da agulha e empurre a agulha na direção da cabeça até que a pressão de injeção resulte em uma mancha branca no tecido.
14. Se nenhum fluido ou mancha branca for visível, a agulha de injeção está bloqueada. Em tal situação, retraia totalmente a agulha. Para continuar o experimento, quebre levemente a ponta da agulha ou substitua a agulha. Em ambos os casos, verifique o fluxo de injeção antes de reinjetar o miocárdio.
15. Após a injeção bem-sucedida, retire suavemente a agulha do miocárdio (Figura 3F) e transfira imediatamente o peixe-zebra para um tanque de recuperação com água da instalação de peixes.
16. Monitore o peixe até que ele se recupere totalmente da tricaína.
17. Transfira os peixes recuperados para um tanque de 2,8 L e coloque-o na instalação de peixes, até o ponto de tempo desejado para a extração do coração.

4. Extração e imagem do coração

1. Preparar a concentração de trabalho de tricaína diluindo 4,2 ml de solução-mãe (4 mg/ml) em 100 ml de água de instalação para peixes numa placa de cristalização.
2. Anestesiar terminalmente o peixe-zebra em solução de tricaína até que o movimento das brânquias pare e ele não responda.
3. Transfira o peixe-zebra para uma esponja ranhurada umedecida sob o microscópio de dissecação posicionado no lado ventral voltado para a lente objetiva.
4. Abra a parede ventral do tórax com uma tesoura de iridectomia ao nível das nadadeiras peitorais.
5. Abra o saco pericárdico e localize o trajeto de saída do coração. Use uma pinça para agarrar a aorta anterior ao Arterioso Bulboso (BA) e puxe-a cuidadosamente para cima com a base do ventrículo.
6. Com o pólo anterior do coração levantado, corte a aorta ventral / seio venoso para liberar o coração e coloque em uma placa de Petri de 35 mm contendo PBS.
7. Usando uma pinça, remova quaisquer coágulos sanguíneos e fixe o coração em 4% de PFA (peso / vol) por 15 min.
8. Visualize os corações usando um microscópio capaz de adquirir os comprimentos de onda fluorescentes usados.
   NOTA: Na data do exemplo, foi utilizado um microscópio confocal com linhas de laser 405, 488, 567 e 647.
9. Use o software ImageJ/Fiji (consulte a Tabela de Materiais) para análise de imagens.
   NOTA: O cálculo do enriquecimento de QD ou MS foi realizado usando o limiar alto ou baixo e criou funções de seleção com o canal dos vasos linfáticos para selecionar primeiro as regiões dos vasos linfáticos e aquelas sem sinal dos vasos. Em seguida, a função Measure foi usada para medir a intensidade do pixel do canal QD ou MS a partir do qual uma proporção das duas seleções foi calculada.

Resultados

Imediatamente após a injeção, uma pequena região branca da parede miocárdica deve ser visível (Figura 3F). Esta região mostrará a marcação fluorescente brilhante do MS e QD injetados ( Figura 4B, E ). Além disso, pode haver pontos de fluorescência fracos e esporádicos na superfície externa do coração de qualquer QD e MS no espaço pericárdico após o procedimento ( Figura 4B...

Discussão

O presente artigo descreveu um método para introduzir material exógeno no miocárdio do peixe-zebra. Essa técnica foi desenvolvida para introduzir QD e MS no miocárdio para estudar a função linfática na homeostase e regeneração ^2,18. Uma abordagem semelhante também foi usada para introduzir QD no miocárdio de camundongos para investigar a presença e função de linfáticos após infarto do miocárdio^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water with sea salt and sodium bicarbonate added to a conductivity of 226uS and pH of 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	no filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vascular label
Sponge	any	any	(1.5 × 5 × 3 cm) with groove (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentration: 4 mg/mL