Iniezione intramiocardica per lo studio della funzione linfatica cardiaca nel pesce zebra

Riepilogo

L'attuale protocollo consente una somministrazione efficiente e stabile di microsfere fluorescenti (MS) e punti quantici (QD) nel miocardio di pesci vivi che possono essere tracciati (tracciati) nel tempo.

Abstract

Il pesce zebra ha dimostrato di essere un modello importante per lo studio della formazione e della funzione cardiovascolare durante lo sviluppo e la rigenerazione postembrionale. Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare traccianti fluorescenti nel miocardio del pesce zebra per studiare l'assorbimento del liquido interstiziale e dei detriti nei vasi linfatici cardiaci. A tal fine, microsfere (200 nm di diametro) e punti quantici (<10 nm di diametro) vengono introdotti nel miocardio di zebrafish vivo, che possono essere tracciati utilizzando la microscopia confocale ex vivo . Questi traccianti vengono quindi tracciati in modo intermittente per diverse ore per seguire la clearance dal miocardio nei vasi linfatici cardiaci. I punti quantici vengono trasportati attraverso i vasi linfatici cardiaci lontano dal cuore, mentre le microsfere più grandi rimangono nel sito di iniezione per oltre tre settimane. Questo metodo di iniezione intramiocardica può essere esteso ad altri usi, tra cui l'iniezione di MS incapsulato o idrogel per rilasciare localmente cellule, proteine o composti di interesse in una regione mirata del cuore.

Introduzione

Il sistema linfatico è essenziale per il mantenimento dell'equilibrio tissutale-fluido, la modulazione della risposta immunitaria a seguito di lesioni e l'assorbimento dei lipidi nell'intestino¹. L'accumulo di prove supporta l'ampio ruolo del sistema linfatico in vari contesti di malattia e sviluppo. Tuttavia, gli studi meccanicistici sono ostacolati perché i vasi linfatici possono essere difficili da visualizzare e la loro funzionalità può essere incerta. Le prime tecniche di imaging si basavano sulla capacità naturale del sistema linfatico di assorbire interstizialmente i traccianti iniettati e quindi di trasportarli attraverso la rete di vasi linfatici, consentendo il rilevamento e la visualizzazione¹. Questo metodo non solo può essere utilizzato per visualizzare i linfatici, ma può anche essere utilizzato per quantificare la loro capacità di assorbire liquidi e macromolecole dal tessuto.

La vasta rete linfatica comprende anche il sistema linfatico cardiaco, che ha dimostrato di svolgere un ruolo fondamentale nella rigenerazione del pesce zebra ^2,3,4. Comprendere le differenze e le somiglianze nella funzione linfatica tra le diverse specie è fondamentale per utilizzare clinicamente queste conoscenze. Pertanto, è necessario esplorare le tecnologie in grado di misurare e visualizzare la funzione linfatica in diversi organismi modello ^5,6. I linfatici sono vasi smussati che trasportano il fluido in una direzione, lontano dal tessuto⁷. L'iniezione intramiocardica di coloranti fluorescenti è necessaria per osservare il drenaggio linfatico dal tessuto cardiaco. Le iniezioni intramiocardiche sono state utilizzate anche clinicamente e in modelli preclinici di mammifero per trapiantare cellule staminali e progenitrici o composti esogeni come l'idrogel per testare il miglioramento della funzione cardiaca dopo l'infarto del miocardio ^8,9,10. L'iniezione intramiocardica di zebrafish non è stata descritta in dettaglio, il che ha limitato l'uso di tali approcci sperimentali al cuore di zebrafish.

Le iniezioni nello spazio pericardico del pesce zebra e il flusso sanguigno sistemico all'interno del lume del cuore sono stati descritti in dettaglio in precedenza^11,12 ed è stata riportata un'iniezione intramiocardica di traccianti fluorescenti in pesce zebra adulto². Il presente articolo fornisce un protocollo dettagliato per l'esecuzione di iniezioni intramiocardiche in zebrafish adulto. Diverse linee di zebrafish transgenico possono identificare i vasi linfatici; Tuttavia, è necessario esplorare approcci per comprendere il drenaggio linfatico o per visualizzare i linfatici in assenza di marcatori transgenici. Qui vengono utilizzati traccianti fluorescenti, microsfere (MS) e punti quantici (QD) per visualizzare il sito di iniezione e il flusso di fluido nei linfatici cardiaci. I QD sono nanocristalli fluorescenti di <10 nm di diametro le cui proprietà ottiche possono essere regolate e adattate per servire molte applicazioni biomediche^13,14. I QD sono prontamente assorbiti dai vasi linfatici ma non dal sistema vascolare del sangue quando iniettati per via interstiziale^15,16. Le MS sono perle di polistirene rivestite fluorescenti di circa 200 nm di diametro¹⁵. Pertanto, la SM è considerevolmente più grande della QD e significativamente più persistente quando iniettata nel miocardio, consentendo un'identificazione coerente del sito di iniezione. Questo metodo è utile per studiare la funzione linfatica durante la rigenerazione cardiaca, ma può essere adattato per studiare vari aspetti della biologia cardiaca utilizzando l'introduzione localizzata stabile di perle rivestite, idrogel o preparati cellulari.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso Weill Cornell Medicine (protocollo 2020-0027) e hanno seguito le linee guida adeguate. I seguenti esperimenti sono stati eseguiti con maschi e femmine di zebrafish AB wild-type di età compresa tra 14 e 20 mesi dopo la fecondazione per gli adulti e 35 giorni dopo la fecondazione per i giovani.

1. Estrazione dell'ago e preparazione del reagente

1. Estrarre un capillare in vetro borosilicato standard con diametro esterno di 1,2 mm (diametro esterno) utilizzando un estrattore per aghi (Figura 1A, B) (vedere la Tabella dei materiali), in due aghi utilizzando le impostazioni ottimali. In questo caso, calore 525; tirare 65; velocità 60; tempo 250.
2. Vortex ha ottenuto commercialmente soluzioni colloidali stock di MS (1% di solidi in acqua) e QD (2 μM, vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: La soluzione colloidale MS è di colore bianco e facilmente visibile quando viene iniettata.
3. Filtrare 500 μL di soluzione colloidale stock MS attraverso un filtro per siringa da 0,45 μm (vedere la Tabella dei materiali) per ridurre al minimo l'intasamento dell'ago.
4. Per preparare la soluzione colloidale di lavoro di sola MS, diluire 100 μL della soluzione colloidale MS filtrata con 100 μL di 1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
5. Per preparare la soluzione colloidale di lavoro di MS e QD, mescolare 100 μl della soluzione colloidale MS filtrata con 100 μl della soluzione colloidale QD.
   NOTA: A seconda dell'esperimento, MS e QD possono essere miscelati o iniettati singolarmente.
6. Preparare e sistemare i reagenti e le attrezzature necessarie: stereoscopio, spugna bagnata, micromanipolatore, iniettore, pipetta da 20 μl, soluzione di tricaina, forbici per iridectomia diritte, pinze, aghi tirati, femtopunte per microcaricatori, serbatoi di recupero e reti come mostrato nella Figura 1D (vedere la Tabella dei materiali).
7. Attivare l'alimentazione dell'aria dell'iniettore e impostare l'impulso di iniezione con gate anziché l'impulso di iniezione temporizzato.
   NOTA: Per i dettagli strumentali, si prega di consultare la Tabella dei Materiali. Alcuni strumenti richiedono l'inserimento del pedale di iniezione nella porta di ingresso con gate sul lato posteriore dello strumento.

2. Preparazione della stazione di iniezione e preparazione del pesce zebra

1. Accendere il microscopio da dissezione e regolare la messa a fuoco.
2. Con i puntali per pipette microloader, caricare la soluzione di controllo (ad es. rosso fenolo allo 0,05% in 1x PBS).
3. Inserire l'ago nel supporto dell'ago del microiniettore.
4. Al microscopio da dissezione, tagliare l'ago estratto a 1 mm dalla punta utilizzando una pinza.
   NOTA: Tagliare l'ago il più stretto possibile è ottimale per perforare il miocardio. Tuttavia, se l'ago è troppo stretto, potrebbe piegarsi quando si tenta di penetrare nel tessuto cardiaco.
5. Impostare la pressione di iniezione appropriata a circa 0,50 kPa/7,3 psi e la pressione di bilanciamento a circa 0 psi in modo che non vi sia retrazione di liquidi nell'ago (Figura 1C).
6. Una volta raggiunta la pressione desiderata, testare la configurazione di iniezione e registrare il tempo impiegato per iniettare un bolo di soluzione in olio minerale di diametro inferiore a 1 mm (<0,5 μl).
   NOTA: Idealmente, l'iniezione deve rilasciare il fluido a circa 50 nL/s per ottenere un diametro del bolo approssimativo di 0,8 mm in 5 s. A seconda del diametro della punta dell'ago, è possibile regolare il tempo e la pressione per iniettare 0,25-0,3 μl in un singolo pesce in un'iniezione di 5 secondi. Una pressione di iniezione più elevata, al contrario di un tempo di iniezione più lungo, è auspicabile per garantire che l'elevata pressione del tessuto interstiziale possa essere superata durante l'iniezione.
7. Caricare l'ago con il volume selezionato (ad es. 10-15 μL, Figura 1B) di soluzione iniettabile e ripetere i passaggi 2.5-2.6.
   NOTA: Le iniezioni con cancello consentiranno di iniettare per tutto il tempo in cui si preme il pedale, consentendo di regolare la posizione della punta fino a trovare il sito di iniezione intratissutale corretto.
8. Inserire l'ago caricato con soluzione iniettabile nel portaago del microiniettore.

3. Iniezione

1. Prepara una spugna scanalata incidendo al centro un contorno simile a un pesce.
2. Preparare la concentrazione di lavoro di tricaina diluendo 4,2 mL di soluzione madre (4 mg/mL) in 100 mL di acqua di allevamento per pesci (vedere la Tabella dei materiali) in un piatto di cristallizzazione.
3. Anestetizzare il pesce zebra in soluzione di tricaina fino a quando il movimento delle branchie non si riduce e smette di nuotare.
   NOTA: Pizzicare la coda per confermare la perdita di risposta nel pesce zebra anestetizzato.
4. Posizionare il pesce zebra con il lato ventrale rivolto verso la lente dell'obiettivo nella spugna scanalata inumidita sotto il microscopio da dissezione (Figura 2A e Figura 3A).
5. Usa le forbici per iridectomia per fare un piccolo taglio trasversale a livello delle pinne pettorali e aprire la cavità toracica (Video supplementare 1).
6. Con una pinza, staccare delicatamente il pericardio per esporre l'apice del cuore (Figura 3B).
7. Con il portaago carico in mano, dirigere l'ago verso l'apice del ventricolo con un angolo acuto di <30° rispetto all'asse del corpo.
8. Inserire un ago da 0,1-0,2 mm nel cuore senza penetrare troppo in profondità nel ventricolo (Figura 2B e Figura 3B).
   NOTA: Se l'estremità della punta dell'ago si riempie di sangue, ritrarre leggermente l'ago per evitare di iniettare MS e QD nel lume ventricolare.
9. Con l'ago inserito nell'apice del cuore, sollevare leggermente il ventricolo dal corpo riducendo l'angolo tra l'ago e l'asse del corpo mentre si sposta la punta dell'ago verso la base del cuore (Figura 2C e Figura 3C).
   NOTA: L'ago può essere debolmente visibile attraverso la parete miocardica.
10. Spingi l'ago più avanti verso la testa in modo che la punta dell'ago si muova verso la superficie del miocardio.
11. Iniettare premendo il pedale del dispositivo di microiniezione per ~1-5 s o fino a quando non è visibile una macchia bianca all'interno del tessuto cardiaco (Figure 2C e Figure 3C, D).
12. Se la cavità toracica inizia a riempirsi di liquido per iniezione durante l'iniezione, indica che la punta dell'ago è completamente penetrata nel miocardio (Figura 2D). Estrarre lentamente l'ago fino a quando non è visibile un accumulo di microsfere all'interno del tessuto.
13. Riposizionare la punta dell'ago se il fluido viene iniettato nel lume ventricolare e cancellato con il successivo battito cardiaco (Figura 2E). In una situazione del genere, sollevare la punta dell'ago e spingere l'ago verso la direzione della testa fino a quando la pressione di iniezione non provoca una macchia bianca nel tessuto.
14. Se non è visibile alcun fluido bianco o macchia, l'ago per iniezione è bloccato. In una situazione del genere, ritrarre completamente l'ago. Per continuare l'esperimento, rompere leggermente la punta dell'ago o sostituire l'ago. In entrambi i casi, controllare il flusso di iniezione prima di reiniettare il miocardio.
15. Dopo l'iniezione, estrarre delicatamente l'ago dal miocardio (Figura 3F) e trasferire immediatamente il pesce zebra in una vasca di recupero con acqua per pesci.
16. Monitorare il pesce fino a quando non si riprende completamente dalla tricaina.
17. Trasferire i pesci recuperati in una vasca da 2,8 L e posizionarli nella struttura ittica, fino al momento desiderato per l'estrazione del cuore.

4. Estrazione e imaging del cuore

1. Preparare la concentrazione di lavoro di tricaina diluendo 4,2 mL di soluzione madre (4 mg/mL) in 100 mL di acqua di allevamento ittico in un piatto di cristallizzazione.
2. Anestetizzare terminalmente il pesce zebra in soluzione di tricaina fino a quando il movimento delle branchie non si è fermato e non risponde.
3. Trasferire il pesce zebra in una spugna scanalata inumidita sotto il microscopio da dissezione posizionato con il lato ventrale rivolto verso la lente dell'obiettivo.
4. Aprire la parete ventrale del torace con le forbici per iridectomia a livello delle pinne pettorali.
5. Aprire il sacco pericardico e individuare la traccia di deflusso del cuore. Usa una pinza per afferrare l'aorta anteriore all'arterioso bulboso (BA) e tirali verso l'alto con cautela con la base del ventricolo.
6. Con il polo anteriore del cuore sollevato, tagliare l'aorta ventrale/seno venoso per rilasciare il cuore e metterlo in una capsula di Petri da 35 mm contenente PBS.
7. Usando una pinza, rimuovere eventuali coaguli di sangue e fissare il cuore al 4% di PFA (wt/vol) per 15 minuti.
8. Immagini dei cuori utilizzando un microscopio in grado di acquisire le lunghezze d'onda fluorescenti utilizzate.
   NOTA: Nella data di esempio, è stato utilizzato un microscopio confocale con 405, 488, 567 e 647 linee laser.
9. Utilizzare il software ImageJ/Fiji (vedere la tabella dei materiali) per l'analisi delle immagini.
   NOTA: Il calcolo dell'arricchimento QD o MS è stato eseguito utilizzando la soglia alta o bassa e creare funzioni di selezione con il canale dei vasi linfatici per selezionare prima le regioni dei vasi linfatici e quelle prive di segnale vascolare. Quindi, la funzione Misura è stata utilizzata per misurare l'intensità dei pixel del canale QD o MS da cui è stato calcolato un rapporto delle due selezioni.

Risultati

Immediatamente dopo l'iniezione, deve essere visibile una piccola regione bianca della parete miocardica (Figura 3F). Questa regione mostrerà una marcatura fluorescente brillante della MS e della QD iniettate (Figura 4B, E). Inoltre, dopo la procedura possono essere presenti punti di fluorescenza deboli e sporadici sulla superficie esterna del cuore da qualsiasi QD e MS nello spazio pericardico (

Discussione

Il presente articolo ha descritto un metodo per introdurre materiale esogeno nel miocardio del pesce zebra. Questa tecnica è stata sviluppata per introdurre QD e SM nel miocardio per studiare la funzione linfatica nell'omeostasi e nella rigenerazione ^2,18. Un approccio simile è stato utilizzato anche per introdurre la QD nel miocardio dei topi per studiare la presenza e la funzione dei linfatici dopo infarto del miocardio

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water with sea salt and sodium bicarbonate added to a conductivity of 226uS and pH of 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	no filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vascular label
Sponge	any	any	(1.5 × 5 × 3 cm) with groove (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentration: 4 mg/mL