Intramyokardiale Injektion zur Untersuchung der kardialen Lymphfunktion beim Zebrafisch

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll ermöglicht eine effiziente und stabile Abgabe von fluoreszierenden Mikrosphären (MS) und Quantenpunkten (QD) in das Myokard lebender Fische, die im Laufe der Zeit verfolgt werden können.

Zusammenfassung

Zebrafische haben sich als wichtiges Modell für die Untersuchung der kardiovaskulären Bildung und Funktion während der postembryonalen Entwicklung und Regeneration erwiesen. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Injektion von fluoreszierenden Tracern in das Myokard des Zebrafisches, um die Aufnahme von interstitieller Flüssigkeit und Trümmern in die kardialen Lymphgefäße zu untersuchen. Dazu werden Mikrosphären (200 nm Durchmesser) und Quantenpunkte (<10 nm Durchmesser) in das Myokard lebender Zebrafische eingebracht, die mittels ex vivo konfokaler Mikroskopie verfolgt werden können. Diese Tracer werden dann intermittierend über mehrere Stunden verfolgt, um die Clearance vom Myokard in die kardialen Lymphgefäße zu verfolgen. Quantenpunkte werden durch kardiale Lymphgefäße vom Herzen weg transportiert, während größere Mikrosphären über drei Wochen an der Injektionsstelle verbleiben. Diese Methode der intramyokardialen Injektion kann auf andere Anwendungen ausgeweitet werden, einschließlich der Injektion von verkapseltem MS oder Hydrogelen zur lokalen Freisetzung von Zellen, Proteinen oder Verbindungen von Interesse in einer Zielregion des Herzens.

Einleitung

Das Lymphsystem ist wichtig für die Aufrechterhaltung des Gewebe-Flüssigkeits-Gleichgewichts, die Modulation der Immunantwort nach Verletzungen und die Aufnahme von Lipiden im Darm¹. Immer mehr Beweise belegen die breite Rolle des lymphatischen Systems in verschiedenen Krankheits- und Entwicklungskontexten. Mechanistische Studien werden jedoch erschwert, da Lymphgefäße schwer zu visualisieren sind und ihre Funktionalität unsicher sein kann. Frühe bildgebende Verfahren stützten sich auf die natürliche Fähigkeit des Lymphsystems, interstitiell injizierte Tracer zu absorbieren und sie dann durch das Lymphgefäßnetzwerk zu transportieren, was eine Erkennung und Visualisierung ermöglichte¹. Mit dieser Methode lassen sich nicht nur die Lymphgefäße sichtbar machen, sondern auch ihre Fähigkeit zur Aufnahme von Flüssigkeit und Makromolekülen aus dem Gewebe quantifizieren.

Das ausgedehnte lymphatische Netzwerk umfasst auch das kardiale Lymphsystem, das nachweislich eine wesentliche Rolle bei der Regeneration von Zebrafischen spielt ^2,3,4. Das Verständnis der Unterschiede und Ähnlichkeiten in der lymphatischen Funktion zwischen verschiedenen Spezies ist entscheidend, um dieses Wissen klinisch zu nutzen. Daher besteht die Notwendigkeit, die Technologien zu erforschen, die die Lymphfunktion in verschiedenen Modellorganismen messen und visualisieren können ^5,6. Lymphgefäße sind stumpfe Gefäße, die Flüssigkeit in eine Richtung transportieren, weg vom Gewebe⁷. Eine intramyokardiale Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen ist erforderlich, um die Lymphdrainage aus dem Herzgewebe zu beobachten. Intramyokardiale Injektionen wurden auch klinisch und in präklinischen Säugetiermodellen eingesetzt, um Stamm- und Vorläuferzellen oder exogene Verbindungen wie Hydrogel zu transplantieren, um die Verbesserung der Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt zu testen ^8,9,10. Die intramyokardiale Injektion von Zebrafischen wurde nicht im Detail beschrieben, was die Verwendung solcher experimentellen Ansätze auf das Zebrafischherz eingeschränkt hat.

Injektionen in den Perikardraum des Zebrafisches und den systemischen Blutfluss im Lumen des Herzens wurden bereits ausführlich beschrieben^11,12, und es wurde über eine erfolgreiche intramyokardiale Injektion von fluoreszierenden Tracern bei adulten Zebrafischen berichtet². Der vorliegende Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Durchführung von intramyokardialen Injektionen bei adulten Zebrafischen. Mehrere transgene Zebrafischlinien können Lymphgefäße identifizieren; Es besteht jedoch Bedarf, Ansätze zum Verständnis der Lymphdrainage oder zur Visualisierung von Lymphgefäßen in Abwesenheit transgener Marker zu erforschen. Fluoreszierende Tracer, Mikrosphären (MS) und Quantenpunkte (QD) werden hier verwendet, um die Injektionsstelle und den Flüssigkeitsfluss in die Herzlymphgefäße sichtbar zu machen. QD sind fluoreszierende Nanokristalle mit einem Durchmesser von <10 nm, deren optische Eigenschaften abgestimmt und angepasst werden können, um viele biomedizinische Anwendungen zu bedienen^13,14. QD werden bei interstitieller Injektion leicht von den Lymphgefäßen, nicht aber von den Blutgefäßen aufgenommen^15,16. MS sind fluoreszenzbeschichtete Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von ca. 200 nm¹⁵. Daher ist MS erheblich größer als QD und signifikant persistenter, wenn sie in das Myokard injiziert wird, was eine konsistente Identifizierung der Injektionsstelle ermöglicht. Diese Methode ist nützlich, um die Lymphfunktion während der kardialen Regeneration zu untersuchen, kann aber angepasst werden, um verschiedene Aspekte der Herzbiologie zu untersuchen, indem die stabile lokalisierte Einführung von beschichteten Kügelchen, Hydrogelen oder Zellpräparaten verwendet wird.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Weill Cornell Medicine (Protokoll 2020-0027) genehmigt und befolgten die entsprechenden Richtlinien. Die folgenden Experimente wurden mit männlichen und weiblichen AB-Wildtyp-Zebrafischen im Alter von 14 bis 20 Monaten nach der Befruchtung für erwachsene Tiere und 35 Tage nach der Befruchtung für Jungtiere durchgeführt.

1. Nadelziehen und Reagenzienvorbereitung

1. Ziehen Sie eine Standardkapillare aus Borosilikatglas mit einem Außendurchmesser von 1,2 mm (Außendurchmesser) mit einem Nadelabzieher (Abbildung 1A,B) (siehe Materialtabelle) mit optimalen Einstellungen in zwei Nadeln. In diesem Fall Hitze 525; Zug 65; Geschwindigkeit 60; Zeit 250.
2. Vortex kommerziell hergestellte kolloidale Stammlösungen von MS (1 % Feststoffe in Wasser) und QD (2 μM, siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die kolloidale MS-Lösung hat eine weiße Farbe und ist bei der Injektion leicht zu sehen.
3. Filtrieren Sie 500 μl kolloidale MS-Stammlösung durch einen 0,45 μm Spritzenvorsatzfilter (siehe Materialtabelle), um ein Verstopfen der Nadel zu minimieren.
4. Um die funktionierende kolloidale Lösung nur von MS herzustellen, verdünnen Sie 100 μl der filtrierten kolloidalen MS-Lösung mit 100 μl 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung).
5. Zur Herstellung der kolloidalen Arbeitslösung von MS und QD mischen Sie 100 μl der filtrierten kolloidalen MS-Lösung mit 100 μl der kolloidalen QD-Lösung.
   HINWEIS: Je nach Experiment können MS und QD gemischt oder einzeln injiziert werden.
6. Bereiten Sie die erforderlichen Reagenzien und Geräte vor und ordnen Sie sie an: Stereoskop, Nassschwamm, Mikromanipulator, Injektor, 20-μl-Pipette, Tricainlösung, gerade Iridektomieschere, Pinzette, gezogene Nadeln, Mikrolader-Femtotips, Auffangtanks und Netze, wie in Abbildung 1D gezeigt (siehe Materialtabelle).
7. Schalten Sie die Luftzufuhr des Injektors ein und stellen Sie den gesteuerten Einspritzimpuls anstelle des zeitgesteuerten Einspritzimpulses ein.
   HINWEIS: Einzelheiten zu den Instrumenten finden Sie in der Materialtabelle. Bei einigen Instrumenten muss das Injektionspedal in den Gated Input auf der Rückseite des Instruments eingesteckt werden.

2. Vorbereitung der Injektionsstation und Vorbereitung der Zebrafische

1. Schalten Sie das Präpariermikroskop ein und stellen Sie den Fokus ein.
2. Laden Sie die Kontrolllösung mit Microloader-Pipettenspitzen (z. B. 0,05 % Phenolrot in 1x PBS).
3. Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter des Mikroinjektors ein.
4. Schneiden Sie unter dem Präpariermikroskop die gezogene Nadel mit einer Pinzette 1 mm von der Spitze entfernt ab.
   HINWEIS: Es ist optimal, die Nadel so schmal wie möglich zu schneiden, um das Myokard zu durchstechen. Ist die Nadel jedoch zu schmal, kann sie sich beim Versuch, in das Herzgewebe einzudringen, verbiegen.
5. Stellen Sie den entsprechenden Einspritzdruck auf etwa 0,50 kPa/7,3 psi und den Ausgleichsdruck auf etwa 0 psi ein, damit keine Flüssigkeit in die Nadel zurückgezogen wird (Abbildung 1C).
6. Sobald der gewünschte Druck erreicht ist, testen Sie die Injektionseinrichtung und notieren Sie die Zeit, die benötigt wird, um einen Bolus der Lösung in Mineralöl mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm (<0,5 μl) zu injizieren.
   HINWEIS: Im Idealfall muss die Flüssigkeit bei der Injektion mit ca. 50 nL/s freigesetzt werden, um einen ungefähren Bolusdurchmesser von 0,8 mm in 5 s zu erreichen. Abhängig vom Spitzendurchmesser der Nadel können Zeit und Druck angepasst werden, um 0,25-0,3 μl in einen einzelnen Fisch über eine 5-s-Injektion zu injizieren. Ein höherer Injektionsdruck im Gegensatz zu einer längeren Injektionszeit ist wünschenswert, um sicherzustellen, dass der hohe interstitielle Gewebedruck während der Injektion überwunden werden kann.
7. Laden Sie die Nadel mit dem ausgewählten Volumen (z. B. 10-15 μl, Abbildung 1B) Injektionslösung und wiederholen Sie die Schritte 2.5-2.6.
   HINWEIS: Gatternde Injektionen ermöglichen eine Injektion so lange, wie das Fußpedal gedrückt wird, so dass Anpassungen der Spitzenposition vorgenommen werden können, bis die richtige intragewebeinterne Injektionsstelle gefunden ist.
8. Führen Sie die mit der Injektionslösung beladene Nadel in den Nadelhalter des Mikroinjektors ein.

3. Injektion

1. Bereiten Sie einen gerillten Schwamm vor, indem Sie in der Mitte einen fischähnlichen Umriss einritzen.
2. Bereiten Sie die Arbeitskonzentration von Tricain vor, indem Sie 4,2 ml Stammlösung (4 mg/ml) in 100 ml Wasser aus der Fischanlage (siehe Materialtabelle) in einer Kristallisationsschale verdünnen.
3. Betäuben Sie den Zebrafisch in Tricainlösung, bis die Bewegung der Kiemen reduziert ist und er aufgehört hat zu schwimmen.
   HINWEIS: Kneifen Sie den Schwanz ein, um den Reaktionsverlust bei anästhesierten Zebrafischen zu bestätigen.
4. Positionieren Sie den Zebrafisch mit der Bauchseite zur Objektivlinse hin in dem angefeuchteten, gerillten Schwamm unter dem Präpariermikroskop (Abbildung 2A und Abbildung 3A).
5. Machen Sie mit einer Iridektomieschere einen kleinen Querschnitt auf Höhe der Brustflossen und öffnen Sie die Brusthöhle (Ergänzendes Video 1).
6. Ziehen Sie das Perikard vorsichtig mit einer Pinzette ab, um die Spitze des Herzens freizulegen (Abbildung 3B).
7. Mit dem geladenen Nadelhalter in der Hand richten Sie die Nadel in einem spitzen Winkel von <30° zur Körperachse auf die Spitze des Ventrikels.
8. Führen Sie eine 0,1-0,2 mm starke Nadel in das Herz ein, ohne zu tief in den Ventrikel einzudringen (Abbildung 2B und Abbildung 3B).
   HINWEIS: Wenn sich das Spitzenende der Nadel mit Blut füllt, ziehen Sie die Nadel leicht zurück, um eine Injektion von MS und QD in das Ventrikellumen zu vermeiden.
9. Heben Sie die Nadel in der Herzspitze leicht vom Körper weg, indem Sie den Winkel zwischen der Nadel und der Körperachse verringern, während Sie die Nadelspitze in Richtung der Herzbasis bewegen (Abbildung 2C und Abbildung 3C).
   HINWEIS: Die Nadel kann schwach durch die Myokardwand sichtbar sein.
10. Schiebe die Nadel weiter in Richtung Kopf, so dass sich die Nadelspitze in Richtung Myokardoberfläche bewegt.
11. Injizieren Sie, indem Sie das Pedal des Mikroinjektionsgeräts für ~1-5 s drücken oder bis ein weißer Fleck im Herzgewebe sichtbar ist (Abbildungen 2C und Abbildung 3C,D).
12. Wenn sich die Brusthöhle während der Injektion mit Injektionsflüssigkeit zu füllen beginnt, deutet dies darauf hin, dass die Nadelspitze das Myokard vollständig durchdrungen hat (Abbildung 2D). Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, bis eine Ansammlung von Mikrokügelchen im Gewebe sichtbar ist.
13. Positionieren Sie die Nadelspitze neu, wenn die Flüssigkeit in das ventrikuläre Lumen injiziert und mit dem nachfolgenden Herzschlag gereinigt wird (Abbildung 2E). Heben Sie in einer solchen Situation die Spitze der Nadel an und schieben Sie die Nadel in Richtung des Kopfes, bis der Injektionsdruck zu einem weißen Fleck im Gewebe führt.
14. Wenn keine weiße Flüssigkeit oder kein Fleck sichtbar ist, ist die Injektionsnadel verstopft. Ziehen Sie in einer solchen Situation die Nadel vollständig zurück. Um das Experiment fortzusetzen, brechen Sie entweder die Spitze der Nadel leicht ab oder setzen Sie die Nadel wieder ein. In beiden Fällen ist der Injektionsfluss vor der erneuten Injektion des Myokards zu überprüfen.
15. Ziehen Sie nach erfolgreicher Injektion die Nadel vorsichtig aus dem Myokard zurück (Abbildung 3F) und bringen Sie den Zebrafisch sofort in ein Auffangbecken mit Wasser aus der Fischanlage.
16. Überwachen Sie den Fisch, bis er sich vollständig vom Tricain erholt hat.
17. Setzen Sie die geborgenen Fische in einen 2,8-Liter-Tank und setzen Sie ihn bis zum gewünschten Zeitpunkt für die Herzextraktion in die Fischanlage.

4. Herzextraktion und Bildgebung

1. Bereiten Sie die Arbeitskonzentration von Tricain vor, indem Sie 4,2 ml Stammlösung (4 mg/ml) in 100 ml Wasser aus der Fischanlage in einer Kristallisationsschale verdünnen.
2. Betäuben Sie den Zebrafisch in Tricainlösung, bis die Bewegung der Kiemen aufgehört hat und er nicht mehr reagiert.
3. Übertragen Sie den Zebrafisch auf einen angefeuchteten, gerillten Schwamm unter dem Präpariermikroskop, der mit der Bauchseite zur Objektivlinse hin positioniert ist.
4. Öffnen Sie die Bauchwand des Brustkorbs mit einer Iridektomieschere auf Höhe der Brustflossen.
5. Öffnen Sie den Perikardsack und lokalisieren Sie die Abflussspur des Herzens. Fassen Sie mit einer Pinzette die Aorta vor dem Bulbous Arteriosus (BA) und ziehen Sie sie vorsichtig mit der Basis des Ventrikels nach oben.
6. Schneiden Sie mit dem vorderen Pol des Herzens die ventrale Aorta/Sinus venosus ab, um das Herz freizugeben, und legen Sie es in eine 35-mm-Petrischale, die PBS enthält.
7. Entfernen Sie mit einer Pinzette alle Blutgerinnsel und fixieren Sie das Herz 15 Minuten lang in 4% PFA (wt/vol).
8. Bilden Sie die Herzen mit einem Mikroskop ab, das in der Lage ist, die verwendeten Fluoreszenzwellenlängen zu erfassen.
   HINWEIS: Im Beispieldatum wurde ein konfokales Mikroskop mit 405, 488, 567 und 647 Laserlinien verwendet.
9. Verwenden Sie die ImageJ/Fiji-Software (siehe Materialtabelle) für die Bildanalyse.
   HINWEIS: Die Berechnung der QD- oder MS-Anreicherung erfolgte unter Verwendung der Funktionen für den hohen oder niedrigen Schwellenwert und die Erstellung von Selektionsfunktionen mit dem Lymphgefäßkanal, um zuerst Regionen von Lymphgefäßen und Regionen ohne Gefäßsignal auszuwählen. Anschließend wurde die Funktion "Messen" verwendet, um die Pixelintensität des QD- oder MS-Kanals zu messen, aus dem ein Verhältnis der beiden Auswahlen berechnet wurde.

Ergebnisse

Unmittelbar nach der Injektion muss ein kleiner weißer Bereich der Myokardwand sichtbar sein (Abbildung 3F). Dieser Bereich zeigt eine helle Fluoreszenzmarkierung der injizierten MS und QD (Abbildung 4B,E). Darüber hinaus kann es nach dem Eingriff zu schwachen und sporadischen Fluoreszenzpunktzahlen auf der Außenseite des Herzens von QD und MS im Perikardraum kommen (Abbildung 4B...

Diskussion

In diesem Artikel wurde eine Methode beschrieben, um exogenes Material in das Myokard von Zebrafischen einzubringen. Diese Technik wurde entwickelt, um QD und MS in das Myokard einzuführen und so die lymphatische Funktion bei Homöostase und Regeneration zu untersuchen ^2,18. Ein ähnlicher Ansatz wurde auch verwendet, um QD in das Myokard von Mäusen einzuführen, um das Vorhandensein und die Funktion von Lymphgefäßen nach ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water with sea salt and sodium bicarbonate added to a conductivity of 226uS and pH of 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	no filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vascular label
Sponge	any	any	(1.5 × 5 × 3 cm) with groove (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentration: 4 mg/mL