Injection intramyocardique pour l’étude de la fonction lymphatique cardiaque chez le poisson-zèbre

Résumé

Le protocole actuel permet une livraison efficace et stable de microsphères fluorescentes (MS) et de points quantiques (QD) dans le myocarde de poissons vivants qui peuvent être suivis (tracés) au fil du temps.

Résumé

Le poisson-zèbre s’est avéré être un modèle important pour l’étude de la formation et de la fonction cardiovasculaires au cours du développement et de la régénération postembryonnaires. Le présent protocole décrit une méthode d’injection de traceurs fluorescents dans le myocarde du poisson-zèbre afin d’étudier l’absorption de liquide interstitiel et de débris dans les vaisseaux lymphatiques cardiaques. Pour ce faire, des microsphères (200 nm de diamètre) et des points quantiques (<10 nm de diamètre) sont introduits dans le myocarde de poissons-zèbres vivants, qui peuvent être suivis à l’aide de la microscopie confocale ex vivo . Ces traceurs sont ensuite suivis par intermittence pendant plusieurs heures pour suivre la clairance du myocarde dans les vaisseaux lymphatiques cardiaques. Les points quantiques sont transportés par les vaisseaux lymphatiques cardiaques loin du cœur, tandis que les microsphères plus grandes restent au site d’injection pendant plus de trois semaines. Cette méthode d’injection intramyocardique peut être étendue à d’autres utilisations, y compris l’injection de MS encapsulée ou d’hydrogels pour libérer localement des cellules, des protéines ou des composés d’intérêt pour une région ciblée du cœur.

Introduction

Le système lymphatique est essentiel au maintien de l’équilibre tissulaire-fluide, à la modulation de la réponse immunitaire après une blessure et à l’absorption des lipides dans l’intestin¹. De plus en plus de preuves soutiennent les rôles généraux du système lymphatique dans divers contextes de maladie et de développement. Cependant, les études mécanistes sont entravées par le fait que les vaisseaux lymphatiques peuvent être difficiles à visualiser et que leur fonctionnalité peut être incertaine. Les premières techniques d’imagerie reposaient sur la capacité naturelle du système lymphatique à absorber interstitiellement les traceurs injectés, puis à les transporter à travers le réseau de vaisseaux lymphatiques, permettant la détection et la visualisation¹. Non seulement cette méthode peut être utilisée pour visualiser les lymphatiques, mais elle peut également être utilisée pour quantifier leur capacité à absorber le liquide et les macromolécules du tissu.

Le vaste réseau lymphatique englobe également le système lymphatique cardiaque, dont il a été démontré qu’il joue un rôle essentiel dans la régénération du poisson-zèbre ^2,3,4. Comprendre les différences et les similitudes dans la fonction lymphatique entre les différentes espèces est crucial pour utiliser ces connaissances cliniquement. Par conséquent, il est nécessaire d’explorer les technologies qui permettent de mesurer et de visualiser la fonction lymphatique chez différents organismes modèles ^5,6. Les lymphatiques sont des vaisseaux à extrémité émoussée qui transportent le liquide dans une direction, loin des tissus⁷. L’injection intramyocardique de colorants fluorescents est nécessaire pour observer le drainage lymphatique du tissu cardiaque. Les injections intramyocardiques ont également été utilisées cliniquement et dans des modèles précliniques de mammifères pour transplanter des cellules souches et progénitrices ou des composés exogènes tels que l’hydrogel afin de tester l’amélioration de la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde ^8,9,10. L’injection intramyocardique chez le poisson-zèbre n’a pas été décrite en détail, ce qui a limité l’utilisation de ces approches expérimentales au cœur du poisson-zèbre.

Des injections dans l’espace péricardique du poisson-zèbre et le flux sanguin systémique dans la lumière du cœur ont été décrits en détail précédemment^11,12, et une injection intramyocardique réussie de traceurs fluorescents chez le poisson-zèbre adulte a été rapportée 2. Le présent article fournit un protocole détaillé pour la réalisation d’injections intramyocardiques chez le poisson-zèbre adulte. Plusieurs lignées de poissons-zèbres transgéniques peuvent identifier les vaisseaux lymphatiques ; Cependant, il est nécessaire d’explorer des approches pour comprendre le drainage lymphatique ou pour visualiser les lymphatiques en l’absence de marqueurs transgéniques. Les traceurs fluorescents, les microsphères (MS) et les points quantiques (QD) sont utilisés ici pour visualiser le site d’injection et l’écoulement du liquide dans les lymphatiques cardiaques. Les QD sont des nanocristaux fluorescents de <10 nm de diamètre dont les propriétés optiques peuvent être ajustées et adaptées pour servir à de nombreuses applications biomédicales^13,14. Les QD sont facilement absorbés par les vaisseaux lymphatiques mais pas par le système vasculaire sanguin lorsqu’ils sont injectés par interstitiel^15,16. Les MS sont des billes de polystyrène revêtues de fluorescence d’environ 200 nm de diamètre¹⁵. En tant que telle, la SEP est considérablement plus grande que la QD et beaucoup plus persistante lorsqu’elle est injectée dans le myocarde, ce qui permet une identification cohérente du site d’injection. Cette méthode est utile pour étudier la fonction lymphatique pendant la régénération cardiaque, mais peut être adaptée pour étudier divers aspects de la biologie cardiaque en utilisant l’introduction localisée stable de billes enrobées, d’hydrogels ou de préparations cellulaires.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de Weill Cornell Medicine (protocole 2020-0027) et ont suivi les directives appropriées. Les expériences suivantes ont été réalisées avec des poissons-zèbres sauvages de type AB mâles et femelles âgés de 14 à 20 mois après la fécondation pour les adultes et de 35 jours après la fécondation pour les juvéniles.

1. Tirage de l’aiguille et préparation du réactif

1. Tirez un capillaire standard en verre borosilicaté de 1,2 mm de diamètre extérieur à l’aide d’un extracteur d’aiguille (Figure 1A,B) (voir le tableau des matériaux) en deux aiguilles en utilisant les réglages optimaux. Dans ce cas, chauffer 525 ; traction 65 ; vitesse 60 ; Temps 250.
2. Vortex a obtenu commercialement des solutions colloïdales mères de MS (1 % de solides dans l’eau) et de QD (2 μM, voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : La solution colloïdale MS est de couleur blanche et facilement visible lorsqu’elle est injectée.
3. Filtrer 500 μL de solution colloïdale mère MS à travers un filtre à seringue de 0,45 μm (voir le tableau des matériaux) pour minimiser l’obstruction de l’aiguille.
4. Pour préparer la solution colloïdale de travail de MS uniquement, diluez 100 μL de la solution colloïdale MS filtrée avec 100 μL de 1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate).
5. Pour préparer la solution colloïdale de travail de MS et de QD, mélanger 100 μL de la solution colloïdale MS filtrée avec 100 μL de la solution colloïdale QD.
   REMARQUE : Selon l’expérience, MS et QD peuvent être mélangés ou injectés individuellement.
6. Préparez et disposez les réactifs et l’équipement nécessaires : stéréoscope, éponge humide, micromanipulateur, injecteur, pipette de 20 μL, solution de tricaïne, ciseaux d’iridectomie droits, pinces, aiguilles tirées, embouts de microchargeur, réservoirs de récupération et filets, comme illustré à la figure 1D (voir le tableau des matériaux).
7. Allumez l’alimentation en air de l’injecteur et configurez l’impulsion d’injection à grille plutôt que l’impulsion d’injection temporisée.
   REMARQUE : Pour les détails instrumentaux, veuillez consulter la table des matériaux. Certains instruments nécessitent que la pédale d’injection soit insérée dans le port d’entrée à grille situé à l’arrière de l’instrument.

2. Préparation de la station d’injection et préparation du poisson-zèbre

1. Allumez le microscope de dissection et ajustez la mise au point.
2. À l’aide des pointes de pipette du microchargeur, chargez la solution de contrôle (par exemple, 0,05 % de rouge de phénol dans 1x PBS).
3. Insérez l’aiguille dans le porte-aiguille du micro-injecteur.
4. Sous le microscope à dissection, coupez l’aiguille tirée à 1 mm de la pointe à l’aide d’une pince.
   REMARQUE : Couper l’aiguille aussi étroite que possible est optimal pour percer le myocarde. Cependant, si l’aiguille est trop étroite, elle peut se plier en essayant de pénétrer dans le tissu cardiaque.
5. Réglez la pression d’injection appropriée à environ 0,50 kPa/7,3 psi et la pression d’équilibre à environ 0 psi afin qu’il n’y ait pas de rétraction du liquide dans l’aiguille (Figure 1C).
6. Une fois la pression souhaitée atteinte, testez le dispositif d’injection et notez le temps nécessaire pour injecter un bolus de solution dans une huile minérale de moins de 1 mm de diamètre (<0,5 μL).
   REMARQUE : Idéalement, l’injection doit libérer le liquide à environ 50 nL/s pour donner un diamètre de bolus approximatif de 0,8 mm en 5 s. En fonction du diamètre de la pointe de l’aiguille, des ajustements de temps et de pression peuvent être effectués pour injecter 0,25 à 0,3 μL dans un seul poisson sur une injection de 5 s. Une pression d’injection plus élevée, par opposition à un temps d’injection plus long, est souhaitable pour s’assurer que la pression élevée du tissu interstitiel peut être surmontée pendant l’injection.
7. Chargez l’aiguille avec le volume sélectionné (p. ex., 10-15 μL, figure 1B) de solution d’injection et répétez les étapes 2.5-2.6.
   REMARQUE : Les injections à grille permettront d’injecter aussi longtemps que la pédale est enfoncée, ce qui permet d’ajuster la position de la pointe jusqu’à ce que le bon site d’injection intratissulaire soit trouvé.
8. Insérez l’aiguille chargée de solution d’injection dans le porte-aiguille du micro-injecteur.

3. L’injection

1. Préparez une éponge rainurée en sculptant un contour semblable à celui d’un poisson au milieu.
2. Préparer la concentration de travail de tricaïne en diluant 4,2 mL de solution mère (4 mg/mL) dans 100 mL d’eau d’installation piscicole (voir le tableau des matières) dans un plat de cristallisation.
3. Anesthésez le poisson-zèbre dans une solution de tricaïne jusqu’à ce que le mouvement des branchies soit réduit et qu’il ait cessé de nager.
   REMARQUE : Pincez la queue pour confirmer la perte de réponse chez le poisson-zèbre anesthésié.
4. Placez le poisson-zèbre avec sa face ventrale face à la lentille de l’objectif dans l’éponge rainurée humidifiée sous le microscope de dissection (Figure 2A et Figure 3A).
5. Utilisez des ciseaux d’iridectomie pour faire une petite coupe transversale au niveau des nageoires pectorales et ouvrir la cavité thoracique (vidéo supplémentaire 1).
6. À l’aide d’une pince, retirez délicatement le péricarde pour exposer l’apex du cœur (figure 3B).
7. Avec le porte-aiguille chargé en main, dirigez l’aiguille vers l’apex du ventricule à un angle aigu de <30° par rapport à l’axe du corps.
8. Insérez une aiguille de 0,1 à 0,2 mm dans le cœur sans pénétrer trop profondément dans le ventricule (Figure 2B et Figure 3B).
   REMARQUE : Si l’extrémité de l’aiguille se remplit de sang, rétractez légèrement l’aiguille pour éviter d’injecter le MS et le QD dans la lumière ventriculaire.
9. Avec l’aiguille insérée dans l’apex du cœur, soulevez légèrement le ventricule loin du corps en réduisant l’angle entre l’aiguille et l’axe du corps tout en déplaçant la pointe de l’aiguille vers la base du cœur (Figure 2C et Figure 3C).
   REMARQUE : L’aiguille peut être faiblement visible à travers la paroi myocardique.
10. Poussez l’aiguille plus loin vers la tête de sorte que la pointe de l’aiguille se déplace vers la surface du myocarde.
11. Injectez en appuyant sur la pédale du dispositif de micro-injection pendant ~1 à 5 secondes ou jusqu’à ce qu’une tache blanche soit visible dans le tissu cardiaque (Figures 2C et Figure 3C,D).
12. Si la cavité thoracique commence à se remplir de liquide d’injection pendant l’injection, cela indique que la pointe de l’aiguille a complètement pénétré le myocarde (Figure 2D). Retirez l’aiguille lentement jusqu’à ce qu’une accumulation de microbilles soit visible dans le tissu.
13. Repositionnez l’extrémité de l’aiguille si le liquide est injecté dans la lumière ventriculaire et évacué avec le rythme cardiaque suivant (Figure 2E). Dans une telle situation, soulevez la pointe de l’aiguille et poussez l’aiguille vers la direction de la tête jusqu’à ce que la pression d’injection entraîne une tache blanche dans le tissu.
14. Si aucun liquide ou tache blanche n’est visible, l’aiguille d’injection est bloquée. Dans une telle situation, rétractez complètement l’aiguille. Pour continuer l’expérience, cassez légèrement la pointe de l’aiguille ou remplacez l’aiguille. Dans les deux cas, vérifiez le débit d’injection avant de réinjecter le myocarde.
15. Une fois l’injection réussie, retirez doucement l’aiguille du myocarde (figure 3F) et transférez immédiatement le poisson-zèbre dans un réservoir de récupération avec de l’eau de poisson.
16. Surveillez le poisson jusqu’à ce qu’il se remette complètement de la tricaïne.
17. Transférez les poissons récupérés dans un réservoir de 2,8 L et placez-les dans l’installation de gestion du poisson, jusqu’au moment souhaité pour l’extraction du cœur.

4. Extraction cardiaque et imagerie

1. Préparer la concentration de travail de tricaïne en diluant 4,2 mL de solution mère (4 mg/mL) dans 100 mL d’eau de poissonnerie dans une boîte de cristallisation.
2. Anesthésier terminal le poisson-zèbre dans une solution de tricaïne jusqu’à ce que le mouvement des branchies ait cessé et qu’il ne réponde plus.
3. Transférez le poisson-zèbre dans une éponge rainurée humidifiée sous le microscope de dissection positionné sur le côté ventral face à la lentille de l’objectif.
4. Ouvrez la paroi ventrale du thorax à l’aide de ciseaux d’iridectomie au niveau des nageoires pectorales.
5. Ouvrez le sac péricardique et localisez la voie d’écoulement du cœur. À l’aide d’une pince, saisissez l’aorte antérieure à l’artériole bulbeuse (BA) et tirez-la délicatement vers le haut avec la base du ventricule.
6. Avec le pôle antérieur du cœur relevé, coupez l’aorte ventrale/sinus veineux pour libérer le cœur et placez-le dans une boîte de Pétri de 35 mm contenant du PBS.
7. À l’aide d’une pince, retirez tous les caillots sanguins et fixez le cœur à 4 % de PFA (poids / vol) pendant 15 min.
8. Imagez les cœurs à l’aide d’un microscope capable d’acquérir les longueurs d’onde fluorescentes utilisées.
   REMARQUE : Dans l’exemple de date, un microscope confocal avec 405, 488, 567 et 647 lignes laser a été utilisé.
9. Utilisez le logiciel ImageJ/Fiji (voir la table des matériaux) pour l’analyse des images.
   REMARQUE : Le calcul de l’enrichissement QD ou MS a été effectué à l’aide du seuillage haut ou bas et des fonctions de sélection de création avec le canal des vaisseaux lymphatiques pour sélectionner d’abord les régions des vaisseaux lymphatiques et celles qui n’ont pas de signal vasculaire. Ensuite, la fonction Measure a été utilisée pour mesurer l’intensité des pixels du canal QD ou MS à partir duquel un rapport des deux sélections a été calculé.

Résultats

Immédiatement après l’injection, une petite région blanche de la paroi myocardique doit être visible (Figure 3F). Cette région montrera un marquage fluorescent brillant du MS et du QD injectés (Figure 4B,E). De plus, il peut y avoir des points de fluorescence faibles et sporadiques sur la surface externe du cœur à cause de tout QD et MS dans l’espace péricardique après l’intervention (

Discussion

Le présent article a décrit une méthode pour introduire du matériel exogène dans le myocarde du poisson-zèbre. Cette technique a été mise au point pour introduire la QD et la SEP dans le myocarde afin d’étudier la fonction lymphatique dans l’homéostasie et la régénération ^2,18. Une approche similaire a également été utilisée pour introduire la QD dans le myocarde de souris afin d’étudier la présence et la...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water with sea salt and sodium bicarbonate added to a conductivity of 226uS and pH of 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	no filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vascular label
Sponge	any	any	(1.5 × 5 × 3 cm) with groove (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentration: 4 mg/mL