הזרקה ללב לחקר תפקוד הלימפה הלבבי בדג הזברה

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר אספקה יעילה ויציבה של מיקרוספירות פלואורסצנטיות (MS) ונקודות קוונטיות (QD) לשריר הלב של דגים חיים שניתן לעקוב אחריהם לאורך זמן.

Abstract

דג הזברה הוכיח את עצמו כמודל חשוב לחקר היווצרות ותפקוד לב וכלי דם במהלך התפתחות והתחדשות פוסט-עוברית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להזרקת עוקבים פלואורסצנטיים לשריר הלב של דג הזברה כדי לחקור את ספיגת הנוזל הבין-רקמתי והפסולת לכלי הלימפה הלבביים. לשם כך, מיקרוספירות (קוטר 200 ננומטר) ונקודות קוונטיות (קוטר <10 ננומטר) מוחדרות לשריר הלב של דג זברה חי, שניתן לעקוב אחריהן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ex vivo . לאחר מכן עוקבים אחר עוקבים אלה לסירוגין במשך מספר שעות כדי לעקוב אחר פינוי משריר הלב לכלי הלימפה הלבביים. נקודות קוונטיות מועברות דרך כלי לימפה לבביים הרחק מהלב, בעוד שמיקרוספירות גדולות יותר נשארות באתר ההזרקה במשך למעלה משלושה שבועות. ניתן להרחיב שיטה זו של הזרקה לתוך קרדיוקרדיאל לשימושים אחרים, כולל הזרקת טרשת נפוצה או הידרוג'לים במעטפת לשחרור מקומי של תאים, חלבונים או תרכובות מעניינות לאזור ממוקד של הלב.

Introduction

מערכת הלימפה חיונית לשמירה על איזון רקמות-נוזלים, לווסת את התגובה החיסונית לאחר פציעה ולספיגת שומנים במעיים¹. עדויות מצטברות תומכות בתפקידים הרחבים של מערכת הלימפה בהקשרים שונים של מחלות והתפתחות. עם זאת, מחקרים מכניסטיים נפגעים מכיוון שכלי לימפה יכולים להיות קשים להדמיה, והפונקציונליות שלהם יכולה להיות לא ודאית. טכניקות הדמיה מוקדמות הסתמכו על היכולת הטבעית של מערכת הלימפה לספוג באופן אינטרסטילי עוקבים מוזרקים, ולאחר מכן להעביר אותם דרך רשת כלי הלימפה, מה שמאפשר זיהוי והדמיה¹. לא רק שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לדמיין את הלימפה, אלא ניתן להשתמש בה גם כדי לכמת את יכולתם לספוג נוזלים ומקרומולקולות מהרקמה.

רשת הלימפה העצומה מקיפה גם את מערכת הלימפה הלבבית, שהוכחה כממלאת תפקיד אינטגרלי בהתחדשות דג הזברה ^2,3,4. הבנת ההבדלים והדמיון בתפקוד הלימפה בין מינים שונים היא חיונית לניצול ידע זה מבחינה קלינית. לכן, יש צורך לחקור את הטכנולוגיות שיכולות למדוד ולדמיין את תפקוד הלימפה על פני אורגניזמים מודלים שונים ^5,6. לימפה היא כלי דם קהים המעבירים נוזלים בכיוון אחד, הרחק מהרקמה⁷. נדרשת הזרקה תוך-קרדיוקרדיאלית של צבעים פלואורסצנטיים כדי לצפות בניקוז הלימפה מרקמת הלב. זריקות אינטרמיוקרדיאליות שימשו גם קלינית ובמודלים פרה-קליניים של יונקים להשתלת תאי גזע ואב או תרכובות אקסוגניות כגון הידרוג'ל כדי לבדוק שיפור בתפקוד הלב לאחר אוטם שריר הלב ^8,9,10. הזרקה פנימית של דג הזברה לא תוארה בפירוט, מה שהגביל את השימוש בגישות ניסיוניות כאלה ללב דג הזברה.

הזרקות לחלל קרום הלב של דג הזברה וזרימת הדם המערכתית בתוך לומן הלב תוארו בפירוט בעבר^11,12, ודווח על הזרקה תוך-קרדיוקרדיאלית מוצלחת של עוקבים פלואורסצנטיים בדג זברה בוגר². המאמר הנוכחי מספק פרוטוקול מפורט לביצוע הזרקות תוך-קרדיוקרדיאליות בדגי זברה בוגרים. מספר קווי דג זברה טרנסגניים יכולים לזהות כלי לימפה; עם זאת, יש צורך לחקור גישות להבנת ניקוז הלימפה או לדמיין לימפה בהיעדר סמנים טרנסגניים. עוקבים פלואורסצנטיים, מיקרוספירות (MS) ונקודות קוונטיות (QD) משמשים כאן כדי לדמיין את אתר ההזרקה וזרימת הנוזל לתוך הלימפה הלבבית. QD הם ננו-גבישים פלואורסצנטיים בקוטר <10 ננומטר שניתן לכוונן ולהתאים את התכונות האופטיות שלהם כדי לשרת יישומים ביו-רפואיים רבים^13,14. QD נקלט בקלות על ידי כלי לימפה אך לא על ידי כלי דם כאשר הוא מוזרק באופן אינטרסטיציאלי^15,16. MS הם חרוזי פוליסטירן מצופים פלואורסצנטי בקוטר של כ-200 ננומטר¹⁵. ככזה, טרשת נפוצה גדולה משמעותית מ-QD ומתמשכת משמעותית כאשר היא מוזרקת לשריר הלב, מה שמאפשר זיהוי עקבי של אתר ההזרקה. שיטה זו שימושית לחקר תפקוד הלימפה במהלך התחדשות הלב, אך ניתן להתאים אותה לחקר היבטים שונים של ביולוגיה של הלב באמצעות החדרה מקומית יציבה של חרוזים מצופים, הידרוג'לים או תכשירי תאים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ב-Weill Cornell Medicine (פרוטוקול 2020-0027) ופעלו לפי הנחיות מתאימות. הניסויים הבאים בוצעו עם זכר ונקבה של דג זברה מסוג בר AB בגילאי 14 עד 20 חודשים לאחר ההפריה למבוגרים, ו-35 יום לאחר ההפריה לצעירים.

1. משיכת מחט והכנת ריאגנטים

1. משוך נימי זכוכית בורוסיליקט סטנדרטיים בגודל 1.2 מ"מ OD (קוטר חיצוני) באמצעות מושך מחט (איור 1A,B) (ראה טבלת חומרים), לשתי מחטים באמצעות הגדרות אופטימליות. במקרה זה, חום 525; למשוך 65; מהירות 60; זמן 250.
2. וורטקס השיגה באופן מסחרי תמיסות קולואידיות מלאי של MS (1% מוצקים במים) ו-QD (2 מיקרומטר, ראה טבלת חומרים).
   הערה: התמיסה הקולואידית של MS היא בצבע לבן ונראית בקלות בעת הזרקה.
3. סנן 500 מיקרוליטר של תמיסה קולואידית במלאי MS דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) כדי למזער את סתימת המחט.
4. כדי להכין את התמיסה הקולואידית העובדת של MS בלבד, יש לדלל 100 מיקרוליטר מהתמיסה הקולואידית המסוננת של MS ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS (מי מלח חוצצים פוספט).
5. כדי להכין את התמיסה הקולואידית העובדת של MS ו-QD, מערבבים 100 מיקרוליטר של התמיסה הקולואידית המסוננת של MS עם 100 מיקרוליטר של התמיסה הקולואידית QD.
   הערה: בהתאם לניסוי, ניתן לערבב או להזריק MS ו-QD בנפרד.
6. הכן וסדר את הריאגנטים והציוד הדרושים: סטריאוסקופ, ספוג רטוב, מיקרומניפולטור, מזרק, פיפטה 20 מיקרוליטר, תמיסת טריקאין, מספריים לכריתת אירידקטומיה ישרה, מלקחיים, מחטים משוכות, קצות פמטו-מעמיס מיקרו, מיכלי התאוששות ורשתות כפי שמוצג באיור 1D (ראה טבלת חומרים).
7. הפעל את אספקת האוויר של המזרק והגדר את דופק ההזרקה המגודר במקום את דופק ההזרקה המתוזמן.
   הערה: לפרטים האינסטרומנטליים, אנא ראה טבלת חומרים. מכשירים מסוימים דורשים הכנסת דוושת ההזרקה ליציאת הקלט המגודרת בצד האחורי של המכשיר.

2. הכנת תחנת הזרקה והכנת דג הזברה

1. הפעל את מיקרוסקופ החיתוך והתאם את המיקוד.
2. עם קצות פיפטה של מיקרו-מעמיס, טען את תמיסת הבקרה (למשל, 0.05% פנול אדום ב-1x PBS).
3. הכנס את המחט למחזיק המחט של המיקרו-מזרק.
4. מתחת למיקרוסקופ הניתוח, חותכים את המחט הנמשכת במרחק של 1 מ"מ מהקצה בעזרת מלקחיים.
   הערה: חיתוך המחט צר ככל האפשר הוא אופטימלי לניקוב שריר הלב. עם זאת, אם המחט צרה מדי, היא עלולה להתכופף כאשר מנסים לחדור לרקמת הלב.
5. הגדר את לחץ ההזרקה המתאים לסביבות 0.50 kPa/7.3 psi, ואת לחץ האיזון לסביבות 0 psi כך שלא תהיה נסיגת נוזל לתוך המחט (איור 1C).
6. לאחר הגעה ללחץ הרצוי, בדוק את מערך ההזרקה ורשום את הזמן שלוקח להזריק בולוס של תמיסה לשמן מינרלי שקוטרו פחות מ-1 מ"מ (<0.5 מיקרוליטר).
   הערה: באופן אידיאלי, ההזרקה חייבת לשחרר את הנוזל במהירות של כ-50 nL/s כדי לתת קוטר בולוס משוער של 0.8 מ"מ ב-5 שניות. בהתאם לקוטר קצה המחט, ניתן לבצע התאמות בזמן ובלחץ כדי להזריק 0.25-0.3 מיקרוליטר לדג בודד במהלך הזרקה של 5 שניות. לחץ הזרקה גבוה יותר, בניגוד לזמן הזרקה ארוך יותר, רצוי כדי להבטיח שניתן יהיה להתגבר על לחץ הרקמה הבין-רקמתי הגבוה במהלך ההזרקה.
7. טען את המחט בנפח שנבחר (למשל, 10-15 מיקרוליטר, איור 1B) של תמיסת ההזרקה וחזור על שלבים 2.5-2.6.
   הערה: זריקות מגודרות יאפשרו להזריק כל עוד לוחצים על דוושת כף הרגל, מה שמאפשר לבצע התאמות של מיקום הקצה עד למציאת אתר ההזרקה התוך-רקמתי הנכון.
8. הכנס את המחט העמוסה בתמיסת הזרקה לתוך מחזיק המחט של המיקרו-מזרק.

3. הזרקה

1. הכן ספוג מחורץ על ידי גילוף מתאר דמוי דג באמצע.
2. הכן את ריכוז העבודה של טריקאין על ידי דילול 4.2 מ"ל של תמיסת מלאי (4 מ"ג/מ"ל) ל-100 מ"ל מי מתקן דגים (ראה טבלת חומרים) בצלחת מתגבשת.
3. הרדמו את דג הזברה בתמיסת טריקאין עד שתנועת הזימים מופחתת והוא הפסיק לשחות.
   הערה: צבט את הזנב כדי לאשר את אובדן התגובה בדג זברה מורדם.
4. מקם את דג הזברה כשהצד הגחוני שלו פונה לעדשת האובייקט בספוג המחורץ-לח מתחת למיקרוסקופ החיתוך (איור 2A ואיור 3A).
5. השתמש במספריים לכריתת אירידקטומיה כדי לבצע חתך רוחבי קטן בגובה סנפירי החזה ולפתוח את חלל החזה (סרטון משלים 1).
6. בעזרת מלקחיים, קלפו בעדינות את קרום הלב כדי לחשוף את קודקוד הלב (איור 3B).
7. עם מחזיק המחט הטעון ביד, כוון את המחט לכיוון קודקוד החדר בזווית חדה של <30° לציר הגוף.
8. הכניסו מחט של 0.1-0.2 מ"מ ללב מבלי לחדור עמוק מדי לתוך החדר (איור 2B ואיור 3B).
   הערה: אם קצה קצה המחט מתמלא בדם, משוך מעט את המחט כדי למנוע הזרקת MS ו-QD ללומן החדר.
9. כאשר המחט מוכנסת לקודקוד הלב, הרימו מעט את החדר הרחק מהגוף על ידי הקטנת הזווית בין המחט לציר הגוף תוך הזזת קצה המחט לכיוון בסיס הלב (איור 2C ואיור 3C).
   הערה: המחט עשויה להיראות במעומעם דרך דופן שריר הלב.
10. דחוף את המחט עוד יותר לכיוון הראש כך שקצה המחט ינוע לכיוון פני השטח של שריר הלב.
11. הזרקו על ידי לחיצה על הדוושה של מכשיר המיקרו-הזרקה למשך ~1-5 שניות או עד שנראה כתם לבן בתוך רקמת הלב (איורים 2C ואיור 3C,D).
12. אם חלל החזה מתחיל להתמלא בנוזל הזרקה בזמן ההזרקה, זה מצביע על כך שקצה המחט חדר לחלוטין לשריר הלב (איור 2D). משוך את המחט לאט עד שהצטברות של מיקרו-חרוזים נראית בתוך הרקמה.
13. מקם מחדש את קצה המחט אם הנוזל מוזרק ללומן החדר ומתנקה עם פעימות הלב הבאות (איור 2E). במצב כזה, הרם את קצה המחט ודחף את המחט לכיוון הראש עד שלחץ ההזרקה יביא לנקודה לבנה ברקמה.
14. אם לא נראה נוזל לבן או כתם לבן, מחט ההזרקה חסומה. במצב כזה, משוך את המחט במלואה. כדי להמשיך בניסוי, שברו מעט את קצה המחט או החליפו את המחט. בשני המקרים, בדוק את זרימת ההזרקה לפני הזרקה חוזרת של שריר הלב.
15. אחרי הזרקה מוצלחת, משכו בעדינות את המחט משריר הלב (איור 3F) והעבירו מיד את דג הזברה לתוך מיכל התאוששות עם מי מתקן הדגים.
16. עקוב אחר הדג עד שהוא מתאושש לחלוטין מהטריקאין.
17. מעבירים את הדגים המוחזרים למיכל של 2.8 ליטר ומניחים אותו במתקן הדגים, עד לנקודת הזמן הרצויה למיצוי הלב.

4. מיצוי לב והדמיה

1. הכן את ריכוז העבודה של טריקאין על ידי דילול 4.2 מ"ל של תמיסת ציר (4 מ"ג/מ"ל) ל-100 מ"ל מי מתקן דגים בצלחת מתגבשת.
2. הרדמה סופנית של דג הזברה בתמיסת טריקאין עד שתנועת הזימים נעצרה והוא אינו מגיב.
3. העבירו את דג הזברה לספוג מחורץ לח מתחת למיקרוסקופ הניתוח הממוקם בצד הגחון הפונה לעדשת האובייקט.
4. פתח את דופן הגחון של החזה בעזרת מספריים לכריתת אירידקטומיה בגובה סנפירי החזה.
5. פתח את שק קרום הלב ואתר את מסלול הזרימה של הלב. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את אבי העורקים הקדמי לעורקי הבולבוס (BA) ומשוך אותם בזהירות כלפי מעלה עם בסיס החדר.
6. כאשר הקוטב הקדמי של הלב מורם, חותכים את אבי העורקים הגחוני/סינוס וריד כדי לשחרר את הלב ומניחים בצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה PBS.
7. בעזרת מלקחיים, הסר את כל קרישי הדם וקבע את הלב ב-4% PFA (משקל/נפח) למשך 15 דקות.
8. דמיין את הלבבות באמצעות מיקרוסקופ המסוגל לרכוש את אורכי הגל הפלואורסצנטיים שבהם נעשה שימוש.
   הערה: בתאריך לדוגמה, נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי עם קווי לייזר 405, 488, 567 ו-647.
9. השתמש בתוכנת ImageJ/Fiji (ראה טבלת חומרים) לניתוח תמונה.
   הערה: חישוב העשרת QD או MS בוצע באמצעות הסף הגבוה או הנמוך ויצירת פונקציות בחירה עם תעלת כלי הלימפה כדי לבחור תחילה אזורים של כלי לימפה ואלה חסרי אות כלי דם. לאחר מכן, נעשה שימוש בפונקציית המדידה למדידת עוצמת הפיקסלים של ערוץ QD או MS שממנו חושב יחס בין שתי הבחירות.

תוצאות

מיד לאחר ההזרקה, אזור לבן קטן בדופן שריר הלב חייב להיות גלוי (איור 3F). אזור זה יציג תיוג פלואורסצנטי בהיר של MS ו-QD המוזרקים (איור 4B,E). בנוסף, תיתכן פונקטה פלואורסצנטית חלשה וספורדית על פני השטח החיצוניים של הלב מכל QD וטרשת נפוצה בחלל...

Discussion

המאמר הנוכחי תיאר שיטה להחדרת חומר אקסוגני לשריר הלב של דג הזברה. טכניקה זו פותחה כדי להכניס QD וטרשת נפוצה לשריר הלב כדי לחקור את תפקוד הלימפה בהומאוסטזיס והתחדשות ^2,18. גישה דומה שימשה גם להחדרת QD לשריר הלב של עכברים כדי לחקור את הנוכחות וה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crystallization dish	VWR	89000-288
Dissection Scope	Zeiss	495010-0007-000
Fish facility water	N/A	N/A	RO water with sea salt and sodium bicarbonate added to a conductivity of 226uS and pH of 7.35
Forceps	Dumont	11252-20
Glass Capillaries	WPI	1B120-3	no filament
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Iridectomy scissors	Fine Scientific Tools	15000-00
Microinjector	Warner Instruments	64-1735
Microloader femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97	Gated pedal input
Microspheres	Thermo Fisher Scientific	B200	Blue
PBS	Corning	46-013-CM
Quantum dots (QD)	Thermo Fisher Scientific	Q21061MP	Qtracker705 vascular label
Sponge	any	any	(1.5 × 5 × 3 cm) with groove (0.5 × 2.5 cm)
Syringe filter	Corning	431220
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040	concentration: 4 mg/mL