Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

Resumen

Describimos un protocolo que detalla el aislamiento de criptas colónicas murinas para el desarrollo de colonoides tridimensionales. Los colonoides establecidos se pueden diferenciar terminalmente para reflejar la composición celular del epitelio del huésped antes de recibir un desafío inflamatorio o ser dirigidos a establecer una monocapa epitelial.

Resumen

El epitelio intestinal juega un papel esencial en la salud humana, proporcionando una barrera entre el huésped y el medio externo. Esta capa celular altamente dinámica proporciona la primera línea de defensa entre las poblaciones microbianas e inmunitarias y ayuda a modular la respuesta inmunitaria intestinal. La alteración de la barrera epitelial es una característica distintiva de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y es de interés para la orientación terapéutica. El sistema de cultivo de colonoides tridimensionales es un modelo in vitro extremadamente útil para estudiar la dinámica de las células madre intestinales y la fisiología de las células epiteliales en la patogénesis de la EII. Idealmente, el establecimiento de colonoides a partir del tejido epitelial inflamado de los animales sería más beneficioso para evaluar las influencias genéticas y moleculares en la enfermedad. Sin embargo, hemos demostrado que los cambios epiteliales in vivo no se retienen necesariamente en colonoides establecidos a partir de ratones con inflamación aguda. Para abordar esta limitación, hemos desarrollado un protocolo para tratar los colonoides con un cóctel de mediadores inflamatorios que suelen estar elevados durante la EII. Si bien este sistema se puede aplicar de forma ubicua a diversas condiciones de cultivo, este protocolo enfatiza el tratamiento tanto en colonoides diferenciados como en monocapas bidimensionales derivadas de colonoides establecidos. En un entorno de cultivo tradicional, los colonoides se enriquecen con células madre intestinales, lo que proporciona un entorno ideal para estudiar el nicho de las células madre. Sin embargo, este sistema no permite un análisis de las características de la fisiología intestinal, como la función barrera. Además, los colonoides tradicionales no ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta celular de las células epiteliales terminalmente diferenciadas a los estímulos proinflamatorios. Los métodos aquí presentados proporcionan un marco experimental alternativo para abordar estas limitaciones. El sistema de cultivo monocapa bidimensional también ofrece una oportunidad para el cribado terapéutico de fármacos ex vivo. Esta capa polarizada de células puede ser tratada con mediadores inflamatorios en el lado basal de la célula y concomitantemente con terapias putativas por vía apical para determinar su utilidad en el tratamiento de la EII.

Introducción

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica, remitente y recurrente caracterizada por episodios de inflamación y quiescencia clínica. La etiología de la EII es multifactorial, pero los rasgos característicos clave de la enfermedad incluyen una función de barrera defectuosa y un aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal, además de cascadas de señalización proinflamatoria activadas dentro del compartimento epitelial ^1,2. Se han utilizado varios modelos in vitro e in vivo para recapitular la respuesta epitelial durante la EII, incluyendo cultivos celulares y modelos murinos de inflamación³. Sin embargo, todos estos sistemas tienen importantes deficiencias que limitan su capacidad para recapitular los cambios epiteliales durante la EII⁴. La mayoría de las líneas celulares utilizadas para estudiar la EII están transformadas, tienen la capacidad de formar una monocapa y pueden diferenciarse³ pero propagarse intrínsecamente de manera diferente a las células epiteliales intestinales no transformadas en el huésped. Para estudiar la EII se utilizan varios modelos murinos diferentes de inflamación, algunos de los cuales incluyen modelos knockout, modelos infecciosos, modelos inflamatorios químicos y modelos de transferencia de células T 5,6,7,8. Si bien cada uno puede estudiar ciertos aspectos etiológicos de la EII, como las predisposiciones genéticas, la disfunción de barrera, la desregulación inmunitaria y el microbioma, su capacidad para estudiar la naturaleza multifactorial de la enfermedad está limitada.

Los organoides intestinales, incluidos los enteroides y los colonoides, se han establecido en la última década como un modelo in vitro útil para estudiar no solo la dinámica de las células madre intestinales, sino también su papel que desempeñan la integridad de la barrera y la función del epitelio intestinal en la homeostasis y la enfermedad intestinales. Estas entidades han contribuido significativamente a nuestra comprensión de la patogénesis de la EII⁹ y han abierto nuevas oportunidades para la medicina personalizada. Los colonoides, o cultivos de tejido autoorganizados derivados de células madre del colon, se han desarrollado a partir de tejido murino y humano en un proceso que permite que las células madre ubicadas dentro de las criptas intestinales se propaguen y se mantengan^{indefinidamente}. El nicho de las células madre in vivo se basa en factores extracelulares para apoyar su crecimiento, en particular la señalización canónica Wnt y las vías de señalización de proteínas morfogénicas óseas¹¹. La adición de estos factores promueve la salud y la longevidad de los colonoides, pero también conduce el cultivo hacia un estado similar al de las células madre que no refleja la arquitectura celular epitelial in vivo, que consiste tanto en células que se renuevan a sí mismas como en células diferenciadas terminalmente^12,13. Si bien la funcionalidad del epitelio intestinal depende de la interferencia continua entre el compartimento de las células madre y las células diferenciadas, la capacidad de tener ambos en un sistema de cultivo de colonoides es bastante limitada. A pesar de estas limitaciones, el sistema de cultivo de organoides sigue siendo el estándar de oro para estudiar las propiedades intrínsecas del epitelio ex vivo. No obstante, es posible que sea necesario considerar estrategias de cultura alternativas para responder a la pregunta científica en cuestión.

Se ha demostrado que los ratones en un régimen continuo de 7 días de sulfato de sodio de dextrano (DSS) desarrollan inflamación epitelial y disfunción de barrera¹⁴. Además, el fallo de la biogénesis mitocondrial y la reprogramación metabólica dentro del epitelio intestinal, que han demostrado ser evidentes en la EII humana, también se han capturado en este modelo DSS de colitis¹⁵. Sin embargo, nuestros datos preliminares demuestran que las características de la falla de la biogénesis mitocondrial no se conservan en los colonoides derivados de las criptas de los animales tratados con DSS (Figura suplementaria 1). Por lo tanto, se deben utilizar métodos de cultivo alternativos cuando se examina cómo la inflamación impulsa los cambios epiteliales durante la inflamación intestinal murina. Aquí, describimos un protocolo que hemos desarrollado que describe 1) cómo aislar criptas de tejido colónico completo para el establecimiento de colonoides murinos, 2) cómo diferenciar terminalmente esta población celular para reflejar la población celular tal como se encuentra in vivo, y 3) cómo inducir inflamación en este modelo in vitro . Para estudiar las interacciones farmacológicas dentro del epitelio inflamado, hemos desarrollado un protocolo para establecer monocapas bidimensionales (2D) a partir de colonoides murinos que pueden ser tratadas basalmente con mediadores inflamatorios y tratadas apicalmente con terapias farmacológicas.

Protocolo

Toda la experimentación con tejidos murinos descritos en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pittsburgh y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Investigación y Cuidado Animal de la Universidad de Pittsburgh y UPMC.

1. Preparación para la cultura

NOTA: Todos los reactivos se enumeran en la sección Tabla de materiales y todas las composiciones de la solución se pueden encontrar en la tabla de composición de la solución (Tabla 1).

1. Prepare el medio de lavado del ratón como se describe en la Tabla 1. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
2. Prepare el búfer de aislamiento de cripta 1 (CIB1) como se describe en la Tabla 1. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
   PRECAUCIÓN: El ditiotreitol (DTT) es considerado peligroso por el Estándar de Comunicación de Peligros de OSHA debido a la posible toxicidad aguda si se ingiere y al daño en la piel y los ojos si esas áreas están expuestas a él. Se deben usar guantes protectores, protección para los ojos y protección facial cuando se manipule este producto químico.
3. Prepare el búfer de aislamiento de cripta 2 (CIB2) como se describe en la Tabla 1. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
4. Preparar el medio acondicionado con L-WRN de acuerdo con un protocolo previamente publicado¹⁶.
5. Prepare el medio colonoide completo como se describe en la Tabla 1. El medio de crecimiento colonoide completo se puede almacenar hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.
6. Prepare el medio de diferenciación como se describe en la Tabla 1. Este protocolo fue modificado a partir de un artículo publicado anteriormente¹⁷. El medio de diferenciación puede almacenarse hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.
7. Prepare el medio mediador de la inflamación como se describe en la Tabla 1. Este protocolo fue modificado a partir de un artículo publicado anteriormente¹⁸. El medio mediador de la inflamación puede almacenarse hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.
8. Prepare el medio monocapa murino. Omita Y-27632 cuando desafíe las monocapas con factores inflamatorios y/o fármacos. El medio monocapa murino puede almacenarse hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.
9. Prepare el medio mediador de inflamación monocapa. El medio monocapa mediador de la inflamación puede almacenarse hasta 5 días a 4 °C sin pérdida de actividad.

2. Aislamiento de criptas del tejido colónico murino

NOTA: Transfiera el tejido sobre hielo. Retire la cantidad adecuada de matriz de membrana basal del almacenamiento de -20 °C y descongele con hielo. Cada 24 pocillos está recubierto con 15 μL de matriz de membrana basal. Prepare CIB1, CIB2 y el medio de crecimiento colonoide completo como se describe en la sección 1.

1. Sacrificar a un ratón C57BL/6J (6-8 semanas de edad) de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, y extraer el extremo distal (aproximadamente 5-7 cm) del colon con pinzas y tijeras limpias.
   NOTA: En este estudio, los sujetos fueron sacrificados utilizando la incubación en cámara de dióxido de carbono durante 2-3 minutos seguida de una luxación cervical.
   1. Para ello, coloca al ratón boca arriba, haz una incisión horizontal justo debajo de la caja torácica y luego una incisión vertical desde la mitad de la incisión horizontal hacia la base de la cola para exponer la cavidad abdominal.
   2. Con unas pinzas, mueva el intestino delgado fuera del campo, identifique el colon y sígalo hasta la base de la cola. Rompe la pelvis con unas tijeras para exponer completamente el colon distal si es necesario. Utiliza las tijeras para cortar los 5-7 cm más distales del colon.
2. Coloque el tejido del colon sobre una superficie limpia. Eliminar el exceso de grasa serosa que rodea el colon. Elimine la materia fecal enjuagando el contenido luminal del colon con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco usando una jeringa conectada a una aguja de 18 G 1 1/2. Luego, coloque el colon en un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de DPBS helado y colóquelo sobre hielo.
   NOTA: Si aísla el colon de más de un animal, coloque el tejido en hielo antes de continuar con el siguiente animal.
3. Transfiera el tejido del colon a una placa de Petri con 10 ml de DPBS helado e irriga el lumen dos veces con DPBS con una pipeta P1,000.
4. Abra el colon longitudinalmente con unas tijeras y agite suavemente con unas pinzas durante ~30 s en el DPBS para eliminar cualquier resto de contenido fecal.
5. Transfiera el tejido a una nueva placa de Petri con 10 ml de DPBS helado y vuelva a agitar suavemente con unas pinzas antes de cortar el colon en trozos de 2 cm con unas tijeras y colocarlos en un tubo cónico de 50 ml con 7 ml de CIB1 helado. Incubar el tejido en CIB1 en hielo durante 20 min.
   NOTA: Los pasos restantes se realizan dentro de una cabina de seguridad biológica.
6. Transfiera el tejido con pinzas a un tubo cónico precalentado de 50 ml que contenga 7 ml de CIB2 e incube en un baño de agua a 37 ° C durante 5 min.
7. Retire el CIB2 del tubo cónico de 50 ml dejando que el tejido se asiente en el fondo del tubo cónico y luego pipeteando el CIB2. Luego, agregue 10 ml de medio de lavado de ratón helado al mismo tubo cónico.
8. Obtenga un nuevo tubo cónico de 50 ml y coloque un filtro de 70 μm en la parte superior del tubo abierto.
9. Mientras sostiene el tubo con el contenido del colon, gire la mano aproximadamente 45°. Agite el tubo de manera oscilante y vigorosa durante 45 s para liberar las criptas. A continuación, vierta la suspensión de la cripta a través del filtro de células de 70 μm en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
10. Con unas pinzas, vuelva a colocar el tejido del colon en el tubo cónico vacío de 50 ml y agregue 10 ml de medio de lavado de ratón helado. Obtenga un nuevo filtro de células de 70 μm y colóquelo encima del tubo cónico de 50 ml que contiene la solución filtrada anterior.
11. De nuevo, toma el tubo de 50 ml que contiene los fragmentos de la cripta y agítalo de la misma manera que en el paso 2.9. Filtrar el medio a través del filtro celular de 70 μm en el tubo cónico de 50 mL para combinarlo con las criptas previamente filtradas.
    NOTA: Si el rendimiento de la cripta es bajo, agite el tejido del colon una vez más colocando el tejido en un tubo cónico vacío de 50 ml con 10 ml de medio de lavado para ratones. Agite el pañuelo durante 45-50 segundos para liberar las criptas. Además, si el rendimiento de la cripta es bajo, aumente la vigorosidad de la agitación. Por último, si el rendimiento global de la cripta es bajo, tanto las pipetas como los tubos pueden recubrirse con suero fetal bovino (FBS) para evitar la adherencia del tejido al plástico.
12. Centrifugar el tubo cónico de 50 mL que contiene las criptas filtradas a 300 x g durante 5 min a 4°C.
    NOTA: Se debe observar un gránulo en la parte inferior del tubo cónico de 50 ml.
13. Decantar el medio pipeteando, volver a suspender las criptas pipeteando hacia arriba y hacia abajo con 10 ml de medio de lavado de ratón helado y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4°C.
14. Para obtener una preparación más limpia, lave las criptas con 10 ml adicionales de medio para lavar ratones. Decantar el medio anterior y volver a suspender las criptas pipeteando hacia arriba y hacia abajo en 10 ml de medio de lavado de ratón. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4°C utilizando un tubo cónico de 15 mL.
    NOTA: Se debe tener cuidado al pipetear el medio porque, a veces, el gránulo no se centrifuga herméticamente. Si el gránulo no está apretado, pipetee la mayor parte del medio, dejando de 500 μL a 1 mL. A continuación, vuelva a suspender el gránulo pipeteándolo en 10 ml de medio de lavado para ratones y transfiera la solución a un tubo cónico de 15 ml. La centrifugación en un tubo cónico más pequeño puede mejorar la estanqueidad del gránulo.
15. Decantar el medio y volver a suspender las criptas pipeteando hacia arriba y hacia abajo con 10 ml de medio de lavado de ratón helado. Una vez resuspendidas, cuente las criptas bajo un microscopio de campo claro pipeteando inmediatamente 10 μL del medio en un portaobjetos de vidrio.
    1. Coloque dos gotas de 10 μL en extremos separados del portaobjetos y cuente el número de criptas en cada gota. Calcule el promedio de los números entre las dos gotas para determinar el número de criptas por 10 μL. Multiplique este número por 100 para obtener el número de criptas en 1 ml.
       NOTA: Para un recuento preciso, se deben retirar inmediatamente 10 μL de la suspensión de la cripta después de la resuspensión. De lo contrario, las criptas caerán al fondo del tubo, lo que dará como resultado un recuento inexacto.
16. Con el objetivo de sembrar de 300 a 500 criptas por pocillo, transfiera el volumen apropiado de criptas resuspendidas en el medio de lavado de ratones a un nuevo tubo cónico de 15 ml y lleve a 10 ml con medio de lavado de ratones helado. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min a 4°C. Un pequeño gránulo debe ser visible en la parte inferior del tubo.
17. Retire el sobrenadante con una pipeta eléctrica. Utilice una pipeta P200 para eliminar con cuidado cualquier medio residual, dejando solo el gránulo.
18. Vuelva a suspender el gránulo en la cantidad adecuada de matriz de membrana basal helada pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. Tenga cuidado de no introducir burbujas al volver a suspender el gránulo de la cripta. Placa 300-500 criptas/15 μL de matriz de membrana basal en cada pocillo de una placa. Después de la siembra, invierta la placa de cultivo de tejidos y colóquela en una incubadora a 37 °C durante 10-20 minutos.
19. Vuelva a colocar la placa y agregue 500 μL del medio colonoide de ratón completo a cada pocillo. Cambie el medio cada dos días hasta que estén listos para pasar. Pasar los colonoides cada 3-5 días.

3. Pasar los colonoides

NOTA: Por lo general, cada pozo puede pasar de 1:4 a 1:6 de acuerdo con la densidad del pozo original. Tome la cantidad adecuada de matriz de membrana basal fuera de -20 ° C y colóquela sobre hielo para descongelar. Los colonoides se pueden usar para experimentos después de dos pasadas. Al pasar colonoides, los pasos se realizan en una cabina de seguridad biológica para evitar la contaminación.

1. Retire el medio de los pocillos que se van a pasar.
   1. Si hay escombros dentro de la matriz de la membrana basal, lo que puede suceder durante el aislamiento inicial, se puede usar el siguiente protocolo para limpiar los escombros:
      1. Añadir 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) helada al 0,1% en DPBS sin Ca 2+ o Mg²⁺ a cada pocillo. Déjalo reposar durante 5 minutos en el armario de seguridad biológica.
      2. Pipetear hacia arriba y hacia abajo de tres a siete veces con una pipeta P1000 para romper la matriz de la membrana basal y recolectar el contenido de los pocillos en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar los colonoides en un total de 5-10 mL de BSA al 0,1% en DPBS sin Ca 2+ o Mg²⁺. Hacer hasta el volumen adecuado con 0,1% BSA.
      3. Centrifugar a 150 x g durante 5 min a 4°C para pellet los colonoides pero no los residuos.
      4. Decantar el DPBS pipeteando, dejando el pellet. Agregue 1 ml de reactivo de disociación enzimática a temperatura ambiente (RT) y pipetee de tres a cinco veces.
      5. Colocar el tubo cónico de 15 ml con el reactivo de disociación enzimática y los colonoides alterados en un baño de agua a 37 °C durante 3-4 min.
      6. Retire el tubo del baño de agua, pipetee de 3 a 5 veces y luego lleve a 10 ml con medio de lavado de ratón. Continúe con el paso 3.6.
2. Coloque 500 μL de reactivo de disociación enzimática RT en cada pocillo y déjelo reposar durante aproximadamente 1 minuto antes de pipetear hacia arriba y hacia abajo de tres a siete veces para romper la matriz de la membrana basal.
3. Coloque la placa en una incubadora a 37 ° C durante 3-4 minutos.
4. Retire la placa de la incubadora y pipetee hacia arriba y hacia abajo de tres a siete veces con una pipeta P1000 para disociar los colonoides.
5. Transfiera el contenido a un tubo cónico de 15 ml y prepare hasta 10 ml con un medio de lavado de ratón helado.
6. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min a 4°C.
7. Retire el medio con una pipeta eléctrica y una pipeta P200 según sea necesario para que solo quede un gránulo en el tubo cónico.
8. Vuelva a suspender en una cantidad adecuada de matriz de membrana basal helada pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo de acuerdo con la cantidad de pocillos que se van a recubrir. No introduzca burbujas al pipetear. Colocar los fragmentos de colonoides en 15 μL de gotas de matriz de membrana basal por pocillo.
9. Coloque la placa en las criptas, invierta la placa de cultivo de tejidos y luego coloque la placa en una incubadora a 37 °C durante 10-20 minutos.
10. Finalmente, revierta la placa y agregue 500 μL de medio colonoide de ratón completo a cada pocillo. Cambie el medio cada dos días hasta que hayan crecido lo suficiente como para volver a pasar en aproximadamente 3-5 días.

4. Diferenciación terminal de las células colonoides

1. Pase los colonoides como se indicó anteriormente y agregue 500 μL del medio colonoide de ratón completo a cada pocillo.
2. Al menos 48 h después del pase, retirar el medio colonoide de ratón completo y añadir 500 μL del medio diferenciador a cada pocillo (ver sección 1).
3. Incubar los colonoides con medios de diferenciación durante 48 h, después de lo cual se pueden utilizar en experimentos, incluida la recolección de ARN y proteínas.
   NOTA: La diferenciación de los colonoides se puede evaluar mediante la recolección de ARN y la evaluación de la expresión de Lgr5 y Ki67, un marcador de células madre y un marcador de proliferación celular, respectivamente, a través de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (qPCR) cuantitativa. Las células terminalmente diferenciadas deben tener una expresión relativamente baja de Lgr5 y Ki67 en comparación con los colonoides cultivados en un medio colonoide tradicional, donde las células son más parecidas a las madres. Es posible que sea necesario optimizar la duración del tiempo que los colonoides necesitan para incubar en el medio de diferenciación para cada laboratorio individual. Consulte la Tabla Suplementaria 1 para ver la lista de cebadores.

5. Inducir inflamación en colonoides diferenciados con mediadores inflamatorios

1. Después de que los colonoides se hayan incubado durante 2-3 días con el medio de diferenciación, retire el medio existente y agregue 500 μL del medio mediador de inflamación a cada pocillo.
2. Deje que los pocillos se incuben durante 24-72 h antes de recolectar el ARN y la proteína (o evaluar otros parámetros posteriores). Cambia el medio todos los días.

6. Monocapas epiteliales intestinales derivadas de colonoides murinos establecidos

NOTA: Las monocapas epiteliales intestinales murinas se derivan de colonoides murinos que han sido expulsados un mínimo de dos veces. Para permitir la formación exitosa de monocapas en 3-5 días, es imperativo no separar los colonoides en células individuales. Los organoides fragmentados que se han disociado enzimáticamente en grupos celulares son ideales para el crecimiento.

1. Prepare todos los reactivos antes de comenzar el experimento. Descongele la matriz de la membrana basal en hielo. Prepare el medio monocapa murino como se describe en la sección 1. Diluir la membrana basal descongelada 1:20 con el medio monocapa murino frío. Mantener en hielo.
2. Utilice pinzas estériles para colocar un inserto de cultivo celular transparente de 0,4 μm en un solo pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (Tabla de materiales). Tome una punta de esquina del inserto y transfiérala al pozo. Repita hasta que se disponga del número adecuado de insertos de cultivo celular para el cultivo.
   NOTA: Asegúrese de recubrir un pozo de control adicional solo con la matriz de la membrana basal. Este inserto de cultivo celular se utilizará para medir la resistencia de fondo del inserto de cultivo celular sin células presentes, como se describe en el paso siguiente (paso 6.3).
3. Con una pipeta P200, cubra la superficie apical (superior) de cada inserto de cultivo celular con 150 μL de matriz de membrana basal diluida. Coloque la punta de la pipeta en el centro del inserto sin tocar la membrana del inserto y expulse suavemente la solución. Coloque la placa en una incubadora estéril a 37 °C con 5% de CO₂ durante al menos 1 h.
4. Retire suavemente la matriz de la membrana basal antes de su uso y deje que los insertos de cultivo celular se sequen en una cabina de seguridad biológica durante un mínimo de 10 minutos.
   1. Para quitar la matriz de la membrana basal, gire la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45°. Coloque un solo dedo en la esquina de la punta para estabilizar el inserto y, con una pipeta P200, coloque suavemente la punta de la pipeta a lo largo de la parte inferior del inserto y retire la matriz.
   2. Eliminar cualquier exceso de residuo lavando cada inserto de cultivo celular con 150 μL de DPBS estéril sin Ca 2+ o Mg²⁺.
5. Después de 10 min de secado, añadir 400 μL del medio monocapa murino en la parte inferior del inserto de cultivo celular y 75 μL en la parte superior. Repita hasta que todos los insertos de cultivo celular estén sumergidos. Deje la placa en el gabinete de seguridad biológica o vuelva a colocarla en la incubadora hasta que la necesite.
6. Retire la placa de 24 pocillos de colonoides intestinales maduros (organoides en los días 3-5 de crecimiento) de la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ y colóquela debajo del gabinete de seguridad biológica. Retire el medio con puntas estériles y lave cada pocillo con 1 ml de DPBS estéril RT (sin Ca 2+ ni Mg²⁺).
   NOTA: Un pocillo individual de 75-125 colonoides maduros se divide en una proporción de 1:4.
7. Retirar el DPBS sin Ca 2+ o Mg²⁺ utilizando puntas estériles, y digerir cada tapón de la matriz de la membrana basal colocando 500 μL de reactivo de disociación enzimática RT en cada pocillo a pasar.
8. Pipetee cada pocillo hacia arriba y hacia abajo aproximadamente de 6 a 10 veces para romper el tapón. No raye la parte inferior de la placa para quitar el tapón. En su lugar, gire la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45°, coloque la punta de la pipeta en el borde del tapón y desaloje suavemente.
9. Vuelva a colocar la placa de 24 pocillos en una incubadora estéril de 37 °C y 5% de CO₂ durante 3-4 minutos.
10. Retire la placa y pipetee el reactivo de disociación enzimática hacia arriba y hacia abajo de cinco a siete veces para cada pocillo debajo de una cabina de seguridad biológica. Transfiera los colonoides disociados de cada pocillo a un tubo cónico estéril de 15 ml. Lleve hasta un volumen de 10 ml con un medio de lavado de mouse helado.
11. Centrifugar los colonoides parcialmente digeridos a 300 x g a 4 °C durante 5 min en una centrífuga de cubo oscilante.
12. Debajo de la cabina de seguridad biológica, retire el sobrenadante del gránulo con una pipeta de 10 ml. Retire cualquier medio restante con una pipeta P200. Resuspender el gránulo de colonoide en medio monocapa murino. Añadir 75 μL de medio por cada inserto de cultivo celular de colonoides fragmentados que se vayan a sembrar.
13. Añadir 75 μL de suspensión colonoide en el centro de cada inserto de cultivo celular. Antes de agregar la suspensión colonoide a cada pocillo, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo una o dos veces antes de eliminar los 75 μL, lo que permite una siembra más uniforme.
14. Coloque la placa de 24 pocillos con insertos de cultivo celular en una plataforma giratoria durante 10 minutos para permitir una dispersión uniforme en todo el inserto de cultivo celular.
15. Coloque la placa en una incubadora estéril a 37 °C y 5% de CO₂ .
16. Al día siguiente (Día 1), desaloje los fragmentos de colonoides sueltos pipeteando el medio hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces con una pipeta P200. Coloque suavemente la punta junto al interior del inserto de cultivo celular para no alterar las células intestinales adheridas. No introduzca burbujas en el medio, ya que esto impide la eliminación de todos los fragmentos sueltos.
17. Retire inmediatamente la mezcla de medio y colonoide. Repita hasta que se hayan limpiado todos los insertos de cultivo celular.
18. Añadir suavemente 150 μL de medio monocapa murino precalentado en el lado apical de cada inserto de cultivo celular. Agregue 400 μL de medio monocapa murino calentado a cada pocillo de una nueva placa de 24 pocillos. Transfiera el inserto de cultivo celular a la nueva placa agarrando su punta con pinzas estériles. Cambie el medio cada dos días hasta la confluencia.
    NOTA: Los fragmentos de colonoides deben formar una monocapa confluente de 3 a 5 días después de la siembra.

7. Medición de la resistencia neta de las monocapas epiteliales utilizando un voltohmímetro en los días 3 y 5 de cultivo de monocapas

NOTA: Los electrodos de los palillos se asemejan a pinzas y tienen una longitud asimétrica. El brazo más largo de la sonda es el electrodo basolateral y el brazo más corto es el electrodo apical. La sonda puede ser difícil de insertar entre el interior y el exterior del inserto de cultivo celular. Colocar la sonda en un ligero ángulo al insertarla, seguido de enderezar verticalmente la sonda, evitará que la sonda se atasque. Asegúrese de leer la resistencia neta de cada inserto de cultivo celular en un ángulo similar, ya que esto puede afectar los valores.

1. Coloque el voltohmetro y todos los reactivos dentro de una cabina de seguridad biológica.
   1. Conecte el voltohmímetro a la toma de CA más cercana y conecte el conector modular de plástico de la sonda de electrodo en el conector INPUT de la pantalla frontal.
   2. Para colocar el voltohmímetro en un ángulo de 45°, gire el brazo de metal en la parte posterior del equipo hacia afuera hasta que encaje en su lugar.
   3. Ahora, encienda el voltohmímetro girando el interruptor de encendido hacia arriba en la pantalla frontal. Por último, gire el interruptor hacia OHMS para mostrar la lectura en esta métrica.
2. Retire la placa de 24 pocillos de la incubadora de 37 °C con 5 % de CO₂ y colóquela plana en la cabina de seguridad biológica. La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) es sensible a la temperatura. Retire la placa inmediatamente antes de leer el TEER.
3. Esterilice la sonda del electrodo en etanol precalentado al 70% durante 30 s a 1 min. Retire la sonda, inviértala y muévala una o dos veces para eliminar el exceso de etanol. Deje que la sonda se seque al aire durante aproximadamente 30 s.
4. Lave cualquier resto de etanol que quede en la sonda con un medio de lavado de ratón precalentado.
   PRECAUCIÓN: No permita que ninguna de las gotas de etanol restantes en la parte superior de la sonda caiga en el inserto de cultivo celular. Al lavar el etanol con medio, no deje que el medio pase por encima del campo de etanol estéril. Esto podría hacer que el medio contaminado entre en el inserto de cultivo celular.
5. Sostenga la sonda perpendicular al inserto de cultivo celular. Inserte el electrodo basolateral (extremo más largo de la sonda) en el exterior del inserto de cultivo celular hasta que toque la base de la placa de 24 pocillos. Deslice el electrodo apical (extremo más corto de la sonda) en el inserto de cultivo celular. No varíe la distancia de los dos electrodos de un pocillo a otro. Esto afectará a la medición de TEER.
6. Verifique que el electrodo apical no toque la base del inserto de cultivo celular antes de leer el TEER. Comience con el inserto de cultivo celular de control en segundo plano y registre el valor. El valor se mostrará automáticamente digitalmente en la parte frontal del voltohmetro.
7. Repita los pasos 7.5-7.6 para cada inserto de cultivo celular.
   NOTA: Si existen diferentes condiciones experimentales entre los insertos de cultivo celular, esterilice la sonda entre cada nueva condición. Comience en el paso 7.1 y continúe numéricamente a través de los pasos.
8. Vuelva a colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora una vez que se hayan registrado todas las mediciones de TEER.
9. Los valores netos a 350 Ω o más son indicativos de formación de monocapas. Repita nuevamente en los días siguientes hasta que se haya logrado la formación de una sola capa.
   NOTA: Por lo general, los valores de 1.000 Ω o más se pueden capturar en el día 3, pero con el tiempo, todos convergerán en un número más bajo alrededor de 350 Ω.

8. Cálculo del TEER utilizando mediciones de resistencia neta del voltohmetro

NOTA: La formación exitosa de monocapas de los colonoides dará mediciones de TEER superiores a 115 Ω·^cm2.

1. Tome los valores de resistencia neta individuales y reste la resistencia neta del pozo de fondo. Los insertos de cultivo celular recubiertos con la membrana de la matriz basal darán una lectura neta de alrededor de 100 Ω.
2. Tome las medidas de resistencia neta restados de fondo y multiplíquelas por el área de superficie del inserto de cultivo celular. Un inserto de cultivo celular de 24 pocillos tiene una superficie de 0,33^cm2.
3. Si los valores son de 115 Ω·^cm2 o superiores, se procederá a los ensayos experimentales posteriores.

9. Inducir inflamación en las monocapas epiteliales con mediadores inflamatorios

1. Una vez que se hayan formado monocapas exitosas, agregue mediadores inflamatorios al cultivo en el lado basal del cultivo. Prepare el medio mediador de inflamación monocapa, como se describe en el paso 1.9, y agregue 400 μL a cada pocillo en una nueva placa de 24 pocillos.
2. Retire el medio del lado apical del inserto de cultivo celular y agregue 150 μL del medio monocapa murino sin Y-27632. No complemente este lado con mediadores inflamatorios. Sin embargo, si la muerte celular parece excesiva, deje el Y-27632 en los medios de comunicación. Esto debe ser determinado por el usuario final.
3. Transfiera los insertos de cultivo celular a una nueva placa de 24 pocillos y colóquelos en los pocillos complementados con el medio monocapa mediador de inflamación.
4. Estimular las monocapas con mediadores inflamatorios durante 24-72 h, dependiendo del experimento.
5. Para probar las respuestas a los fármacos utilizando este modelo inflamatorio, complemente el medio monocapa en el lado apical del inserto de cultivo celular con el fármaco de elección. El fármaco puede añadirse en cualquier momento del experimento, dependiendo del mecanismo de acción del fármaco y de los parámetros posteriores a evaluar.

Resultados

El sistema de cultivo de colonoides intestinales en 3D es una herramienta inestimable para estudiar la contribución intrínseca del epitelio a la homeostasis de la mucosa intestinal. El protocolo descrito proporciona instrucciones detalladas sobre cómo aislar criptas de ratones C57BL/6J (WT) a las 8 semanas de edad y establecer un sistema de cultivo de colonoides a largo plazo que pueda manipularse para múltiples aplicaciones posteriores. Tras el aislamiento y la colocación de placas en la matriz de la membrana basal...

Discusión

El desarrollo de organoides ha revolucionado la forma en que la comunidad científica estudia los sistemas de órganos in vitro con la capacidad de recapitular parcialmente la estructura y función celular de un animal o humano en un plato. Además, los sistemas organoides derivados de humanos con enfermedades ofrecen una herramienta prometedora para la medicina personalizada que podría guiar la toma de decisiones terapéuticas. Aquí, describimos un protocolo de aislamiento de criptas que funciona bien e intro...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)