Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

Resumen

Describimos un protocolo que detalla el aislamiento de criptas colónicas murinas para el desarrollo de colonoides tridimensionales. Los colonoides establecidos se pueden diferenciar terminalmente para reflejar la composición celular del epitelio del huésped antes de recibir un desafío inflamatorio o ser dirigidos a establecer una monocapa epitelial.

Resumen

El epitelio intestinal juega un papel esencial en la salud humana, proporcionando una barrera entre el huésped y el medio externo. Esta capa celular altamente dinámica proporciona la primera línea de defensa entre las poblaciones microbianas e inmunitarias y ayuda a modular la respuesta inmunitaria intestinal. La alteración de la barrera epitelial es una característica distintiva de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y es de interés para la orientación terapéutica. El sistema de cultivo de colonoides tridimensionales es un modelo in vitro extremadamente útil para estudiar la dinámica de las células madre intestinales y la fisiología de las células epiteliales en la patogénesis de la EII. Idealmente, el establecimiento de colonoides a partir del tejido epitelial inflamado de los animales sería más beneficioso para evaluar las influencias genéticas y moleculares en la enfermedad. Sin embargo, hemos demostrado que los cambios epiteliales in vivo no se retienen necesariamente en colonoides establecidos a partir de ratones con inflamación aguda. Para abordar esta limitación, hemos desarrollado un protocolo para tratar los colonoides con un cóctel de mediadores inflamatorios que suelen estar elevados durante la EII. Si bien este sistema se puede aplicar de forma ubicua a diversas condiciones de cultivo, este protocolo enfatiza el tratamiento tanto en colonoides diferenciados como en monocapas bidimensionales derivadas de colonoides establecidos. En un entorno de cultivo tradicional, los colonoides se enriquecen con células madre intestinales, lo que proporciona un entorno ideal para estudiar el nicho de las células madre. Sin embargo, este sistema no permite un análisis de las características de la fisiología intestinal, como la función barrera. Además, los colonoides tradicionales no ofrecen la oportunidad de estudiar la respuesta celular de las células epiteliales terminalmente diferenciadas a los estímulos proinflamatorios. Los métodos aquí presentados proporcionan un marco experimental alternativo para abordar estas limitaciones. El sistema de cultivo monocapa bidimensional también ofrece una oportunidad para el cribado terapéutico de fármacos ex vivo. Esta capa polarizada de células puede ser tratada con mediadores inflamatorios en el lado basal de la célula y concomitantemente con terapias putativas por vía apical para determinar su utilidad en el tratamiento de la EII.

Introducción

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica, remitente y recurrente caracterizada por episodios de inflamación y quiescencia clínica. La etiología de la EII es multifactorial, pero los rasgos característicos clave de la enfermedad incluyen una función de barrera defectuosa y un aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal, además de cascadas de señalización proinflamatoria activadas dentro del compartimento epitelial ^1,2. Se han utilizado varios modelos in vitro e in vivo para recapitular la respuesta epitelial durante la EII, incluyendo cultivos celulares y m....

Protocolo

Toda la experimentación con tejidos murinos descritos en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pittsburgh y se llevó a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Investigación y Cuidado Animal de la Universidad de Pittsburgh y UPMC.

1. Preparación para la cultura

NOTA: Todos los reactivos se enumeran en la sección Tabla de materiales y todas las composiciones de la solución se pueden encontrar en la tabla de composición de la solución (Tabla 1).

1. Prepare el medio de lavado del ratón como....

Discusión

El desarrollo de organoides ha revolucionado la forma en que la comunidad científica estudia los sistemas de órganos in vitro con la capacidad de recapitular parcialmente la estructura y función celular de un animal o humano en un plato. Además, los sistemas organoides derivados de humanos con enfermedades ofrecen una herramienta prometedora para la medicina personalizada que podría guiar la toma de decisiones terapéuticas. Aquí, describimos un protocolo de aislamiento de criptas que funciona bien e intro.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)