確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

要約

3次元コロノイドの発生のためのマウス結腸陰窩の単離を詳述するプロトコルについて説明します。その後、確立されたコロノイドは、炎症性チャレンジを受ける前、または上皮単層を確立するように指示される前に、宿主上皮の細胞組成を反映するように最終分化され得る。

要約

腸上皮は人間の健康に不可欠な役割を果たし、宿主と外部環境の間に障壁を提供します。この非常に動的な細胞層は、微生物集団と免疫集団の間の最初の防衛線を提供し、腸の免疫応答を調節するのに役立ちます。上皮バリアの破壊は炎症性腸疾患(IBD)の特徴であり、治療標的化に関心があります。3次元コロノイド培養系は、IBDの病態における腸幹細胞動態と上皮細胞生理を研究するための非常に有用な in vitro モデルです。理想的には、動物の炎症を起こした上皮組織からコロノイドを確立することは、疾患に対する遺伝的および分子的影響を評価するのに最も有益であろう。しかし、我々は、急性炎症マウスから樹立されたコロノイドにおいて 、in vivo 上皮変化が必ずしも保持されないことを示した。この制限に対処するために、IBD中に通常上昇する炎症メディエーターのカクテルでコロノイドを治療するためのプロトコルを開発しました。このシステムはさまざまな培養条件に遍在的に適用できますが、このプロトコルは、分化したコロノイドと確立されたコロノイドに由来する2次元単層の両方の処理に重点を置いています。従来の培養環境では、コロノイドは腸幹細胞が豊富であり、幹細胞ニッチを研究するのに理想的な環境を提供します。しかし、このシステムでは、バリア機能などの腸管生理の特徴を分析することはできません。さらに、伝統的なコロノイドは、炎症誘発性刺激に対する最終分化上皮細胞の細胞応答を研究する機会を提供しない。ここで紹介する方法は、これらの制限に対処するための代替実験フレームワークを提供します。2次元単層培養システムは、 ex vivoでの治療薬スクリーニングの機会も提供します。この細胞の分極層は、細胞の基底側の炎症メディエーターで治療することができ、IBD治療におけるそれらの有用性を決定するために、頂端的に推定治療薬と併用することができる。

概要

炎症性腸疾患(IBD)は、炎症と臨床的静止のエピソードを特徴とする慢性の寛解型および再発性疾患です。IBDの病因は多因子性ですが、この疾患の重要な特徴には、上皮コンパートメント内で活性化される炎症誘発性シグナル伝達カスケードに加えて、バリア機能の欠陥と腸上皮の透過性の増加が含まれます^1,2。IBD中の上皮応答を再現するために、細胞培養および炎症のマウスモデルを含むいくつかのインビトロおよびインビボモデルが使用されてきた³。しかしながら、これらのシステムはすべて、IBD⁴中の上皮変化を再現する能力を制限する重要な欠点を有する。IBDの研究に使用されるほとんどの細胞株は形質転換され、単層を形成する能力を有し、^分化することができるが3、宿主における非形質転換腸上皮細胞とは異なる性質の増殖を行う。炎症のいくつかの異なるマウスモデルがIBDの研究に使用され、そのうちのいくつかには、ノックアウトモデル、感染モデル、化学炎症モデル、およびT細胞移植モデル^{が含まれます5}、⁶、^7、<....

プロトコル

ここに記載されているマウス組織を使用したすべての実験は、ピッツバーグ大学の治験審査委員会によって承認され、ピッツバーグ大学の動物研究およびケア委員会およびUPMCによって定められたガイドラインに従って実施されました。

1.文化の準備

注:すべての試薬は 材料 表セクションにリストされており、すべての溶液組成は溶液組成表(表1)に記載されています。

1. 表1に記載のようにマウス洗浄培地を調製する。4°Cで最長2ヶ月間保管してください。
2. 表 1 の説明に従って、暗号分離バッファー 1 (CIB1) を準備します。4°Cで最長2ヶ月間保管してください。
   注意: ジチオスレイトール(DTT)は、摂取すると急性毒性が起こり、これらの領域にさらされると皮膚や目に損傷を与える可能性があるため、OSHAハザードコミュニケーション基準では危険と見なされています。この化学物質を取り扱うときは、保護手袋、目の保護具、および顔の保護具を使用する必要があります。
3. 表 1 の説明に従って、暗号分離バッファー 2 (CIB2) を準備します。4°Cで最長2ヶ月間保管してください。
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ディスカッション

オルガノイドの開発は、科学界がin vitro で臓器系を研究する方法に革命をもたらし、皿の中の動物または人間の細胞構造と機能を部分的に再現する能力を備えています。さらに、疾患を持つヒトに由来するオルガノイドシステムは、治療上の意思決定を導く可能性のある個別化医療のための有望なツールを提供します。ここでは、適切に機能する暗号分離プロトコルについて説明し、?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)