Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Isolierung von murinen Kolonkrypten für die Entwicklung von 3-dimensionalen Kolonoiden beschreibt. Die etablierten Kolonoide können dann terminalisiert werden, um die zelluläre Zusammensetzung des Wirtsepithels widerzuspiegeln, bevor sie eine entzündliche Herausforderung erhalten oder angewiesen werden, eine epitheliale Monoschicht zu bilden.

Zusammenfassung

Das Darmepithel spielt eine wesentliche Rolle für die menschliche Gesundheit, da es eine Barriere zwischen dem Wirt und der äußeren Umgebung darstellt. Diese hochdynamische Zellschicht stellt die erste Verteidigungslinie zwischen mikrobiellen und immunen Populationen dar und hilft, die Immunantwort des Darms zu modulieren. Die Störung der Epithelbarriere ist ein Kennzeichen der chronisch entzündlichen Darmerkrankung (CED) und für das therapeutische Targeting von Interesse. Das 3-dimensionale Kolonoidkultursystem ist ein äußerst nützliches In-vitro-Modell für die Untersuchung der Dynamik von Darmstammzellen und der Physiologie von Epithelzellen in der Pathogenese von CED. Im Idealfall wäre die Etablierung von Kolonoiden aus dem entzündeten Epithelgewebe von Tieren am vorteilhaftesten, um die genetischen und molekularen Einflüsse auf Krankheiten zu beurteilen. Wir haben jedoch gezeigt, dass in vivo Epithelveränderungen bei Kolonoiden, die von Mäusen mit akuter Entzündung gebildet wurden, nicht unbedingt erhalten bleiben. Um dieser Einschränkung zu begegnen, haben wir ein Protokoll zur Behandlung von Kolonoiden mit einem Cocktail von Entzündungsmediatoren entwickelt, die typischerweise während einer CED erhöht sind. Während dieses System ubiquitär auf verschiedene Kulturbedingungen angewendet werden kann, legt dieses Protokoll den Schwerpunkt auf die Behandlung sowohl auf differenzierten Kolonoiden als auch auf 2-dimensionalen Monoschichten, die von etablierten Kolonoiden abgeleitet sind. In einer traditionellen Kulturumgebung werden Kolonoide mit Darmstammzellen angereichert, was eine ideale Umgebung für die Untersuchung der Stammzellnische bietet. Dieses System erlaubt jedoch keine Analyse der Merkmale der Darmphysiologie, wie z.B. der Barrierefunktion. Darüber hinaus bieten traditionelle Kolonoide nicht die Möglichkeit, die zelluläre Antwort von terminal-differenzierten Epithelzellen auf proinflammatorische Reize zu untersuchen. Die hier vorgestellten Methoden bieten einen alternativen experimentellen Rahmen, um diese Einschränkungen zu adressieren. Das 2-dimensionale Monolayer-Kultursystem bietet auch die Möglichkeit für ein therapeutisches Wirkstoff-Screening ex vivo. Diese polarisierte Zellschicht kann mit Entzündungsmediatoren auf der basalen Seite der Zelle und gleichzeitig mit putativen Therapeutika apikal behandelt werden, um ihren Nutzen bei der CED-Behandlung zu bestimmen.

Einleitung

Entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind eine chronische, remittierende und rezidivierende Erkrankung, die durch Episoden von Entzündungen und klinischer Ruhe gekennzeichnet ist. Die Ätiologie der CED ist multifaktoriell, aber zu den wichtigsten charakteristischen Merkmalen der Erkrankung gehören eine gestörte Barrierefunktion und eine erhöhte Permeabilität des Darmepithels sowie proinflammatorische Signalkaskaden, die innerhalb des Epithelkompartiments aktiviert werden ^1,2. Mehrere In-vitro- und In-vivo-Modelle wurden verwendet, um die Epithelreaktion während CED zu rekapitulieren, einschlie....

Protokoll

Alle hier beschriebenen Versuche mit murinem Gewebe wurden vom Institutional Review Board der University of Pittsburgh genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Research and Care Committee der University of Pittsburgh und des UPMC durchgeführt.

1. Vorbereitung auf die Kultur

HINWEIS: Alle Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt und alle Lösungszusammensetzungen finden Sie in der Tabelle der Lösungszusammensetzung (Tabelle 1).

1. Bereiten Sie das Mauswaschmedium wie in Tabelle 1 beschrieben vor. Bei 4°C bis z....

Diskussion

Die Entwicklung von Organoiden hat die Art und Weise revolutioniert, wie die wissenschaftliche Gemeinschaft Organsysteme in vitro untersucht, mit der Fähigkeit, die zelluläre Struktur und Funktion eines Tieres oder Menschen in einer Schale teilweise zu rekapitulieren. Darüber hinaus bieten organoide Systeme, die von Menschen mit Krankheiten abgeleitet wurden, ein vielversprechendes Werkzeug für die personalisierte Medizin, das die therapeutische Entscheidungsfindung leiten könnte. Hier beschreiben wir ein g.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)