Изучение эпителиальных эффектов воспаления кишечника in vitro на установленных колоноидах мышей

Резюме

Мы описываем протокол, подробно описывающий изоляцию крипт толстой кишки мышей для развития трехмерных колоноидов. Затем сформированные колоноиды могут быть терминально дифференцированы, чтобы отразить клеточный состав эпителия хозяина до того, как они получат воспалительную инструкцию или будут направлены на создание эпителиального монослоя.

Аннотация

Кишечный эпителий играет важнейшую роль в здоровье человека, обеспечивая барьер между хозяином и внешней средой. Этот высокодинамичный клеточный слой обеспечивает первую линию защиты между микробными и иммунными популяциями и помогает модулировать иммунный ответ кишечника. Нарушение эпителиального барьера является отличительным признаком воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и представляет интерес для терапевтического таргетирования. 3-мерная колоноидная культуральная система является чрезвычайно полезной моделью in vitro для изучения динамики стволовых клеток кишечника и физиологии эпителиальных клеток в патогенезе ВЗК. В идеале, создание колоноидов из воспаленной эпителиальной ткани животных было бы наиболее полезным для оценки генетического и молекулярного влияния на заболевание. Однако мы показали, что эпителиальные изменения in vivo не обязательно сохраняются у колоноидов, полученных от мышей с острым воспалением. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали протокол лечения колоноидов коктейлем медиаторов воспаления, которые обычно повышены во время ВЗК. Несмотря на то, что эта система может применяться повсеместно в различных условиях культивирования, этот протокол делает акцент на обработке как дифференцированных колоноидов, так и двухмерных монослоев, полученных из установленных колоноидов. В условиях традиционной культуры колоноиды обогащаются стволовыми клетками кишечника, обеспечивая идеальную среду для изучения ниши стволовых клеток. Однако эта система не позволяет провести анализ особенностей физиологии кишечника, таких как барьерная функция. Кроме того, традиционные колоноиды не дают возможности изучать клеточный ответ терминально дифференцированных эпителиальных клеток на провоспалительные раздражители. Методы, представленные здесь, представляют собой альтернативную экспериментальную основу для устранения этих ограничений. Двухмерная монослойная культуральная система также дает возможность проведения терапевтического скрининга лекарственных средств ex vivo. Этот поляризованный слой клеток может быть обработан медиаторами воспаления на базальной стороне клетки и одновременно с предполагаемой терапией апикально, чтобы определить их полезность в лечении ВЗК.

Введение

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) — это хроническое, ремиттирующее и рецидивирующее заболевание, характеризующееся эпизодами воспаления и клиническим покоем. Этиология ВЗК является многофакторной, но ключевыми характерными особенностями заболевания являются дефектная барьерная функция и повышенная проницаемость кишечного эпителия, а также провоспалительные сигнальные каскады, активированные в эпителиальном компартменте ^1,2. Для повторения эпителиального ответа во время ВЗК было использовано несколько моделей in vitro и in vivo, включая клеточные культуры и мышиные модели воспаления³. Однако все эти системы имеют существенные недостатки, которые ограничивают их способность повторять эпителиальные изменения во время ВЗК⁴. Большинство клеточных линий, используемых для изучения ВЗК, трансформируются, обладают способностью образовывать монослой и могут дифференцироваться³, но по своей природе размножаются иначе, чем нетрансформированные эпителиальные клетки кишечника в организме хозяина. Для изучения ВЗК используется несколько различных мышиных моделей воспаления, некоторые из которых включают нокаутные модели, инфекционные модели, химические воспалительные модели и модели переноса Т-клеток 5,6,7,8. Хотя каждый из них может изучать определенные этиологические аспекты ВЗК, такие как генетическая предрасположенность, барьерная дисфункция, иммунная дерегуляция и микробиом, они ограничены в своих возможностях изучать многофакторную природу заболевания.

За последнее десятилетие было установлено, что кишечные органоиды, включая энтероиды и колоноиды, являются полезной моделью in vitro для изучения не только динамики кишечных стволовых клеток, но и их роли, барьерной целостности и функции кишечного эпителия в кишечном гомеостазе и заболевании. Эти сущности внесли значительный вклад в наше понимание патогенеза ВЗК⁹ и открыли новые возможности для персонализированной медицины. Колоноиды, или самоорганизующиеся культуры тканей толстой кишки, полученные из стволовых клеток, были выведены как из мышиных, так и из человеческих тканей в процессе, который позволяет стволовым клеткам, находящимся в кишечных криптах, размножаться и поддерживаться в^{течение неопределенного} времени. Ниша стволовых клеток in vivo зависит от внеклеточных факторов для поддержки их роста, в частности, канонических сигнальных путей Wnt и сигнальных путей костного морфогенного белка¹¹. Добавление этих факторов способствует здоровью и долголетию колоноидов, но также приводит культуру к состоянию, подобному стволовым клеткам, которое не отражает клеточную архитектуру эпителия in vivo, которая состоит как из самообновляющихся, так и из терминально дифференцированных клеток^12,13. В то время как функциональность кишечного эпителия зависит от постоянных перекрестных помех между компартментом стволовых клеток и дифференцированными клетками, возможность иметь и то, и другое в системе колоноидных культур довольно ограничена. Несмотря на эти ограничения, система органоидных культур остается золотым стандартом для изучения внутренних свойств эпителия ex vivo. Тем не менее, для ответа на поставленный научный вопрос, возможно, потребуется рассмотреть альтернативные культурные стратегии.

Было показано, что у мышей, получающих непрерывный 7-дневный режим приема декстрана сульфата натрия (DSS), развивается как воспаление эпителия, так и барьерная дисфункция¹⁴. Кроме того, сбой митохондриального биогенеза и метаболическое перепрограммирование в кишечном эпителии, которые, как было показано, проявляются при ВЗК человека, также были учтены в этой DSS-модели колита¹⁵. Тем не менее, наши предварительные данные показывают, что характеристики недостаточности митохондриального биогенеза не сохраняются у колоноидов, полученных из крипт животных, обработанных DSS (дополнительный рисунок 1). Таким образом, при изучении того, как воспаление приводит к эпителиальным изменениям при воспалении кишечника мышей, необходимо использовать альтернативные методы культивирования. Здесь мы излагаем разработанный нами протокол, который описывает: 1) как изолировать крипты от всей ткани толстой кишки для создания мышиных колоноидов, 2) как терминально дифференцировать эту клеточную популяцию, чтобы отразить клеточную популяцию в том виде, в каком она существует in vivo, и 3) как индуцировать воспаление в этой модели in vitro . Для изучения лекарственных взаимодействий в воспаленном эпителии мы разработали протокол для создания 2-мерных (2D) монослоев из мышиных колоноидов, которые могут быть базально обработаны медиаторами воспаления и апикально обработаны лекарственной терапией.

протокол

Все эксперименты с использованием мышиных тканей, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга и проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по исследованиям и уходу за животными в Университете Питтсбурга и UPMC.

1. Подготовка к культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты перечислены в разделе «Таблица материалов », а все составы растворов можно найти в таблице состава растворов (Таблица 1).

1. Приготовьте средство для мытья мышей, как описано в таблице 1. Хранить при температуре 4°C до 2 месяцев.
2. Подготовьте буфер изоляции крипты 1 (CIB1), как описано в таблице 1. Хранить при температуре 4°C до 2 месяцев.
   ВНИМАНИЕ: Дитиотрейтол (DTT) считается опасным в соответствии со стандартом OSHA Hazard Communication Standard из-за потенциальной острой токсичности при проглатывании и повреждения кожи и глаз при его воздействии на эти области. При работе с этим химическим веществом следует использовать защитные перчатки, средства защиты глаз и лица.
3. Подготовьте буфер изоляции крипты 2 (CIB2), как описано в таблице 1. Хранить при температуре 4°C до 2 месяцев.
4. Готовят L-WRN-кондиционированную среду в соответствии с ранее опубликованным протоколом¹⁶.
5. Подготовьте полную колоноидную среду, как описано в таблице 1. Полная колоноидная питательная среда может храниться до 5 дней при 4°C без потери активности.
6. Приготовьте дифференцирующую среду, как описано в таблице 1. Этот протокол был изменен по сравнению с ранее опубликованной статьей¹⁷. Дифференцирующая среда может храниться до 5 дней при 4°C без потери активности.
7. Приготовьте медиаторную среду воспаления, как описано в таблице 1. Этот протокол был изменен по сравнению с ранее опубликованной статьей¹⁸. Медиаторная среда воспаления может храниться до 5 дней при температуре 4°C без потери активности.
8. Приготовьте мышиную монослойную среду. Опустите Y-27632 при воздействии на монослои воспалительных факторов и/или лекарств. Монослойная среда для мышей может храниться до 5 дней при температуре 4°C без потери активности.
9. Приготовьте медиатор воспаления однослойной средой. Однослойная среда медиатора воспаления может храниться до 5 дней при температуре 4°С без потери активности.

2. Выделение крипты из ткани толстой кишки мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Переложите салфетку на лед. Выньте необходимое количество мембранной матрицы основания из хранилища при температуре −20 °C и разморозьте на льду. Каждая 24-луночная мембрана покрыта 15 мкл матрицы базальной мембраны. Подготовьте CIB1, CIB2 и полную питательную среду, как описано в разделе 1.

1. Усыпите мышь C57BL/6J (в возрасте 6-8 недель) в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по уходу за животными и их использованию, и извлеките дистальный конец толстой кишки (примерно 5-7 см) с помощью чистого пинцета и ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании испытуемых усыпляли с помощью инкубации в углекислотной камере в течение 2-3 мин с последующим вывихом шейки матки.
   1. Для этого положите мышь на спину, сделайте горизонтальный разрез чуть ниже грудной клетки, а затем вертикальный разрез от середины горизонтального разреза к основанию хвоста, чтобы обнажить брюшную полость.
   2. С помощью пинцета переместите тонкую кишку из поля, определите толстую кишку и проследите за ней вниз до основания хвоста. При необходимости разбейте таз ножницами, чтобы полностью обнажить дистальный отдел толстой кишки. Ножницами отрежьте самые дистальные 5-7 см толстой кишки.
2. Положите ткань толстой кишки на чистую поверхность. Удалите избыток серозного жира, который окружает толстую кишку. Удалите фекалии, промыв просветное содержимое толстой кишки фосфатно-солевым буфером (DPBS) Dulbecco с помощью шприца, прикрепленного к игле 18 G 1 1/2. Затем поместите толстую кишку в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл ледяного DPBS, и поместите ее на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы изолируете толстую кишку от более чем одного животного, положите ткань на лед, прежде чем перейти к следующему животному.
3. Перенесите ткань толстой кишки в чашку Петри с 10 мл ледяного DPBS и дважды промойте просвет DPBS с помощью пипетки P1000.
4. Откройте толстую кишку продольно с помощью ножниц и осторожно встряхните пинцетом в течение ~30 с в DPBS, чтобы удалить оставшееся фекальное содержимое.
5. Перенесите ткань в новую чашку Петри с 10 мл ледяного DPBS и снова осторожно встряхните пинцетом, прежде чем разрезать толстую кишку на кусочки по 2 см ножницами и поместить их в коническую пробирку объемом 50 мл с 7 мл ледяного CIB1. Инкубируют ткань в CIB1 на льду в течение 20 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные шаги выполняются в шкафу биологической безопасности.
6. Переложите ткань пинцетом в предварительно нагретую коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 7 мл CIB2, и инкубируйте на водяной бане при температуре 37°C в течение 5 минут.
7. Извлеките CIB2 из конической пробирки объемом 50 мл, дав ткани осесть на дне конической пробирки, а затем пипетируя CIB2. Затем добавьте 10 мл ледяного средства для мытья мышей в ту же коническую пробирку.
8. Возьмите новую коническую пробирку объемом 50 мл и поместите фильтр 70 мкм поверх открытой пробирки.
9. Удерживая пробирку с содержимым толстой кишки, поверните руку примерно на 45°. Встряхните трубку, покачиваясь и энергично, в течение 45 секунд, чтобы освободить крипты. Затем перелейте суспензию крипты через ситечко с ячейками 70 мкм в новую коническую пробирку объемом 50 мл.
10. С помощью пинцета поместите ткань толстой кишки обратно в пустую коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте 10 мл ледяного средства для мытья мышей. Возьмите новый сетчатый фильтр для клеток размером 70 мкм и поместите его на коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую предыдущий отфильтрованный раствор.
11. Снова возьмите пробирку объемом 50 мл, содержащую фрагменты крипты, и встряхните ее идентично, как в шаге 2.9. Отфильтруйте среду через ситечко с ячейками 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл, чтобы соединить ее с ранее отфильтрованными криптами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если выход крипты низкий, встряхните ткань толстой кишки еще один раз, поместив ткань в пустую коническую пробирку объемом 50 мл с 10 мл средства для промывки мышей. Встряхните ткань в течение 45-50 с, чтобы освободить крипты. Также, если доходность крипты низкая, то увеличьте энергичность встряхивания. Наконец, если общий выход крипт низкий, пипетки и пробирки могут быть покрыты фетальной бычьей сывороткой (FBS), чтобы предотвратить прилипание ткани к пластику.
12. Центрифугу в конической пробирке объемом 50 мл, содержащей отфильтрованные крипты, в концентрации 300 x g в течение 5 мин при 4°C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На дне конической пробирки объемом 50 мл должна находиться гранула.
13. Сцедите среду с помощью пипетирования, повторно суспендируйте крипты, пипетируя вверх и вниз 10 мл ледяного средства для промывки мышей, и перелейте в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4°C.
14. Чтобы получить более чистый препарат, промойте крипты дополнительными 10 мл средства для мытья мышей. Сцедите предыдущую среду и снова суспендируйте крипты, пипетируя вверх и вниз в 10 мл средства для мытья мышей. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при 4°C с помощью конической пробирки объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при пипетировании среды, так как иногда гранулы центрифугируются неплотно. Если гранула не плотная, удалите пипеткой большую часть среды, оставив от 500 мкл до 1 мл. Затем повторно суспендируйте гранулу путем пипетирования в 10 мл средства для мытья мыши и перелейте раствор в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугирование в конической пробирке меньшего размера может улучшить герметичность гранулы.
15. Сцедите среду и снова суспендируйте крипты, пипетируя вверх и вниз 10 мл ледяного средства для мытья мышей. После ресуспендирования подсчитайте крипты под светлопольным микроскопом, немедленно пипетируя 10 мкл среды на предметное стекло.
    1. Поместите две капли по 10 мкл на отдельные концы предметного стекла и подсчитайте количество крипт в каждой капле. Усредните числа между двумя каплями, чтобы определить количество крипт на 10 мкл. Умножьте это число на 100, чтобы получить количество крипт в 1 мл.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для точного подсчета 10 мкл суспензии крипт должны быть немедленно удалены после ресуспензии. В противном случае крипты упадут на дно трубы, что приведет к нетточному подсчету.
16. С целью покрытия 300-500 крипт на лунку, переложите соответствующий объем крипт, ресуспендированных в промывочной среде для мыши, в новую коническую пробирку объемом 15 мл и доведите до 10 мл ледяной промывочной средой для мыши. Центрифугируйте пробирку при 300 x g в течение 5 минут при 4°C. На дне тюбика должна быть видна маленькая гранула.
17. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Используйте пипетку P200, чтобы осторожно удалить остатки среды, оставив только гранулы.
18. Ресуспендируйте гранулу в соответствующем количестве ледяной мембранной матрицы, медленно пипетируя вверх и вниз. Будьте осторожны, чтобы не занести пузырьки при повторном суспендировании гранулы крипты. Планшет 300-500 крипт/15 мкл матрицы базальной мембраны в каждой лунке планшета. После нанесения покрытия переверните планшет для культуры тканей и поместите его в инкубатор при температуре 37°C на 10-20 минут.
19. Переверните планшет и добавьте 500 мкл полной колоноидной среды мыши в каждую лунку. Меняйте носители через день, пока они не будут готовы к прохождению. Отсаживают колоноиды каждые 3-5 дней.

3. Пассаж колоноидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина, как правило, может быть проходима от 1:4 до 1:6 в зависимости от плотности исходной скважины. Выньте необходимое количество матрицы базальной мембраны при температуре −20°C и поместите ее на лед, чтобы она оттаяла. Колоноиды можно использовать для экспериментов после двух проходов. При прохождении колоноидов этапы выполняются в шкафу биологической безопасности для предотвращения загрязнения.

1. Удалите среду из лунок, которые необходимо пройти.
   1. Если в матрице базальной мембраны есть мусор, что может произойти во время первоначальной изоляции, для очистки от мусора можно использовать следующий протокол:
      1. Добавьте 1 мл ледяного 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в DPBS без Ca 2+ или Mg²⁺ в каждую лунку. Оставьте на 5 минут в шкафу биологической безопасности.
      2. Проведите пипеткой вверх и вниз от трех до семи раз с помощью пипетки P1000, чтобы нарушить матрицу базальной мембраны, и соберите содержимое лунок в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируют колоноиды в общей сложности 5-10 мл 0,1% БСА в DPBS без Ca 2+ или Mg²⁺. Доведите до соответствующего объема 0,1% BSA.
      3. Центрифуга при 150 x g в течение 5 минут при 4°C, чтобы гранулировать колоноиды, но не мусор.
      4. Декантировать DPBS путем пипетирования, оставляя гранулы. Добавьте 1 мл реагента для ферментативной диссоциации комнатной температуры (RT) и пипетку три-пять раз.
      5. Поместите коническую пробирку объемом 15 мл с реагентом для ферментативной диссоциации и разрушенными колоноидами на водяную баню с температурой 37°C на 3-4 минуты.
      6. Снимите тюбик с водяной бани, пипеткой 3-5 раз, а затем доведите до 10 мл со средством для мытья мыши. Перейдите к шагу 3.6.
2. Поместите 500 мкл реагента для ферментативной диссоциации RT в каждую лунку и дайте ему постоять примерно 1 минуту, прежде чем пипетировать вверх и вниз от трех до семи раз, чтобы разрушить матрицу базальной мембраны.
3. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37°C на 3-4 минуты.
4. Извлеките планшет из инкубатора и проведите пипеткой вверх и вниз от трех до семи раз, используя пипетку P1000, чтобы диссоциировать колоноиды.
5. Перелейте содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте до 10 мл ледяного средства для мытья мышей.
6. Центрифугируют образец при 300 x g в течение 5 мин при 4°C.
7. При необходимости удалите среду с помощью силовой пипетки и пипетки P200 так, чтобы в конической пробирке осталась только гранула.
8. Ресуспендируйте в соответствующем количестве ледяной мембранной матрицы основания, осторожно пипетируя вверх и вниз в зависимости от того, сколько лунок должно быть покрыто. Не вводите пузырьки при пипетировании. Поместите фрагменты колоноида в 15 мкл капель матрицы базальной мембраны на лунку.
9. Протащите крипты, переверните планшет для культуры тканей, а затем поместите планшет в инкубатор при температуре 37°C на 10-20 минут.
10. Наконец, переверните пластину и добавьте 500 мкл полной колоноидной среды мыши в каждую лунку. Меняйте среду через день, пока они не станут достаточно большими, чтобы их можно было снова пропустить примерно через 3-5 дней.

4. Терминальная дифференцировка клеток толстой кишки

1. Пропустите колоноиды, как указано выше, и добавьте 500 мкл полной колоноидной среды мыши в каждую лунку.
2. Не менее чем через 48 ч после пассажа удалите всю колоноидную среду мыши и добавьте 500 мкл дифференцирующей среды в каждую лунку (см. раздел 1).
3. Инкубируют колоноиды с дифференцирующими средами в течение 48 ч, после чего их можно использовать в экспериментах, в том числе для сбора РНК и белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Колоноиды могут быть оценены на дифференцировку путем сбора РНК и оценки экспрессии Lgr5 и Ki67, маркера стволовых клеток и маркера пролиферации клеток, соответственно, с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (кПЦР). Терминально дифференцированные клетки должны иметь относительно низкую экспрессию Lgr5 и Ki67 по сравнению с колоноидами, выращенными в традиционной колоноидной среде, где клетки более стволовые. Продолжительность времени, в течение которого колоноиды должны инкубироваться в дифференцирующей среде, может быть оптимизирована для каждой отдельной лаборатории. Список грунтовок см. в Дополнительной таблице 1 .

5. Индуцирование воспаления в дифференцированных колоноидах с медиаторами воспаления

1. После инкубации колоноидов в течение 2-3 суток с дифференцирующей средой существующую среду удаляют и добавляют в каждую лунку по 500 мкл медиаторной среды воспаления.
2. Дайте лункам инкубироваться в течение 24-72 ч, прежде чем собирать РНК и белок (или оценивать другие последующие параметры). Меняйте носитель каждый день.

6. Монослои кишечного эпителия, полученные из установленных мышиных колоноидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Монослои кишечника мышей получены из мышиных колоноидов, которые были пассированы не менее двух раз. Чтобы обеспечить успешное формирование монослоя за 3-5 дней, крайне важно не разделять колоноиды на отдельные клетки. Фрагментированные органоиды, которые были ферментативно диссоциированы в клеточные кластеры, идеально подходят для роста.

1. Подготовьте все реактивы перед началом эксперимента. Разморозьте матрицу базальной мембраны на льду. Приготовьте монослойную среду для мышей, как описано в разделе 1. Разбавьте оттаявшую базальную мембрану в соотношении 1:20 холодной мышиной монослойной средой. Держите на льду.
2. С помощью стерильных щипцов поместите прозрачную вставку клеточной культуры размером 0,4 мкм в одну лунку 24-луночного планшета для культуры тканей (таблица материалов). Возьмитесь за угловой зубец вкладыша и перенесите его в колодец. Повторяйте до тех пор, пока не будет доступно соответствующее количество вставок для культуры клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что дополнительная контрольная яма покрыта только матрицей базовой мембраны. Эта вставка для клеточной культуры будет использоваться для измерения фонового сопротивления вставки клеточной культуры без присутствующих клеток, как описано в следующем шаге (шаг 6.3).
3. С помощью пипетки P200 покройте апикальную (верхнюю) поверхность каждой вставки для клеточной культуры 150 мкл разбавленной матрицы базальной мембраны. Поместите наконечник пипетки в центр вкладыша, не касаясь мембраны вкладыша, и осторожно выдавите раствор. Поместите планшет в стерильный инкубатор с температурой 37°C с 5% CO₂ не менее чем на 1 ч.
4. Перед использованием осторожно снимите матрицу базальной мембраны и дайте вставкам клеточных культур высохнуть в шкафу биологической безопасности в течение не менее 10 минут.
   1. Чтобы удалить матрицу базальной мембраны, поверните 24-луночную пластину под углом 45°. Поместите один палец на угол штыря, чтобы стабилизировать пластину, и с помощью пипетки P200 осторожно поместите наконечник пипетки вдоль нижней стороны вставки и снимите матрицу.
   2. Удалите излишки остатков, промыв каждую вставку клеточной культуры 150 мкл стерильного DPBS без Ca 2+ или Mg²⁺.
5. После 10 мин сушки добавьте 400 мкл мышиной монослойной среды на дно вставки для клеточной культуры и 75 мкл сверху. Повторяйте до тех пор, пока все вкладыши для клеточных культур не будут погружены. Оставьте планшет в шкафу биологической безопасности или поместите его обратно в инкубатор до тех пор, пока он не понадобится.
6. Извлеките 24-луночную пластину зрелых (органоиды на 3-5 день роста) кишечных колоноидов из инкубатора с температурой 37°C, 5%_CO2 и поместите ее под шкаф биологической безопасности. Удалите среду стерильными наконечниками и промойте каждую лунку 1 мл стерильного DPBS RT (без Ca 2+ или Mg²⁺).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельная лунка из 75-125 зрелых колоноидов разбивается в соотношении 1:4.
7. Удалите DPBS без Ca 2+ или Mg²⁺ с помощью стерильных наконечников и расщепите каждую пробку матрицы базальной мембраны, поместив 500 мкл реагента для ферментативной диссоциации RT в каждую лунку, которую необходимо пройти.
8. Пропитывайте каждую лунку вверх и вниз примерно 6-10 раз, чтобы разбить пробку. Не царапайте нижнюю часть пластины, чтобы снять заглушку. Вместо этого поверните 24-луночную пластину под углом 45°, поместите наконечник пипетки на край пробки и осторожно сдвиньте ее.
9. Поместите 24-луночный планшет обратно в стерильный инкубатор с температурой 37°C, 5%_CO2 на 3-4 минуты.
10. Снимите планшет и протрите реагент для ферментативной диссоциации вверх и вниз пять-семь раз для каждой лунки под шкафом биологической безопасности. Переложите диссоциированные колоноиды из каждой лунки в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл. Доведите объем до 10 мл ледяным средством для мытья мыши.
11. Центрифугируйте частично переваренные колоноиды при 300 x g при 4°C в течение 5 мин в центрифуге с качающимся ковшом.
12. Под шкафом биологической безопасности удалите надосадочную жидкость из гранулы с помощью пипетки объемом 10 мл. Удалите оставшуюся среду с помощью пипетки P200. Ресуспендируйте колоноидную гранулу в мышиной однослойной среде. Добавляют 75 мкл среды на каждую вставку клеточной культуры фрагментированных колоноидов, подлежащих нанесению.
13. Добавьте 75 мкл колоноидной суспензии в центр каждой вставки для клеточной культуры. Перед добавлением колоноидной суспензии в каждую лунку осторожно пропитывайте вверх и вниз один или два раза, прежде чем удалить 75 мкл, что обеспечивает более равномерное покрытие.
14. Поместите 24-луночный планшет со вставками для клеточных культур на вращающуюся платформу на 10 минут, чтобы обеспечить равномерное диспергирование по всей вставке для клеточной культуры.
15. Поместите планшет в стерильный инкубатор с 5%_СО2 при температуре 37°C.
16. На следующий день (день 1) сместите неприкрепленные фрагменты толстой кишки, пипетируя среду вверх и вниз три-пять раз пипеткой P200. Осторожно поместите наконечник рядом с внутренней стороной вкладыша для клеточной культуры, чтобы не нарушить прикрепленные клетки кишечника. Не вводите пузырьки в среду, так как это препятствует удалению всех неприкрепленных фрагментов.
17. Сразу же удалите смесь среды и колоноида. Повторяйте до тех пор, пока все вкладыши для клеточных культур не будут очищены.
18. Осторожно добавьте 150 мкл предварительно подогретой мышиной монослойной среды на апикальную сторону каждой вставки для клеточной культуры. Добавьте 400 мкл нагретой мышиной монослойной среды в каждую лунку новой 24-луночной планшета. Перенесите вкладыш с клеточной культурой на новую пластину, захватив ее штырь стерильными щипцами. Меняйте носитель через день до слияния.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагменты колоноида должны образовать сливающийся монослой через 3-5 дней после нанесения покрытия.

7. Измерение чистого сопротивления эпителиальных монослоев с помощью вольтомметра на 3 - 5 сутки культивирования монослоя

ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды для еды напоминают щипцы и имеют асимметричную длину. Более длинное плечо зонда является базолатеральным электродом, а более короткое плечо — апикальным электродом. Зонд может быть трудно вставить между внутренней и внешней стороной вставки для клеточной культуры. Размещение зонда под небольшим углом при введении с последующим вертикальным выпрямлением зонда предотвратит застревание зонда. Убедитесь, что нетто-сопротивление каждой вставки для клеточной культуры находится под одинаковым углом, так как это может повлиять на значения.

1. Поместите вольтомметр и все реактивы в шкаф биологической безопасности.
   1. Подключите вольтомметр к ближайшей розетке переменного тока, а пластиковый модульный разъем электродного щупа — к разъему INPUT на переднем дисплее.
   2. Чтобы расположить вольтомметр под углом 45°, поверните металлический кронштейн на задней стороне оборудования наружу, пока он не зафиксируется на месте.
   3. Теперь включите вольтомметр, повернув выключатель питания вверх на переднем дисплее. Наконец, переместите переключатель вверх в сторону OHMS, чтобы отобразить показания в этой метрике.
2. Извлеките 24-луночную пластину из инкубатора с содержанием CO2 при температуре 37 °C, 5%_CO2 и положите ее в шкаф биологической безопасности. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) чувствительно к температуре. Снимайте пластину только непосредственно перед считыванием TEER.
3. Стерилизовать электродный зонд в предварительно нагретом 70% этаноле в течение от 30 с до 1 мин. Снимите зонд, переверните и проведите им один-два раза, чтобы удалить излишки этанола. Дайте зонду высохнуть на воздухе в течение примерно 30 секунд.
4. Смойте оставшийся на зонде этанол предварительно подогретым средством для мытья мышей.
   ВНИМАНИЕ: Не допускайте, чтобы оставшиеся капли этанола, расположенные выше на зонде, попали во вставку с клеточной культурой. При смывании этанола со средой не позволяйте среде подниматься выше стерильного поля этанола. Это может привести к попаданию загрязненной среды во вставку клеточной культуры.
5. Держите зонд перпендикулярно вставке для клеточной культуры. Вставьте базолатеральный электрод (более длинный конец зонда) на внешнюю сторону вкладыша для клеточной культуры, пока он не коснется основания 24-луночного планшета. Вставьте апикальный электрод (более короткий конец зонда) во вставку для клеточной культуры. Не изменяйте расстояние между двумя электродами от лунки к лунке. Это повлияет на измерение TEER.
6. Убедитесь, что апикальный электрод не касается основания вкладыша для клеточной культуры, прежде чем считывать TEER. Начните с фоновой вставки культуры и запишите значение. Значение будет автоматически отображаться в цифровом виде на передней панели вольтомметра.
7. Повторите шаги 7.5-7.6 для каждой вставки клеточной культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если между вставками для клеточных культур существуют различные экспериментальные условия, стерилизуйте зонд между каждым новым состоянием. Начните с шага 7.1 и пройдите шаги в числовом исчислении.
8. Поместите 24-луночный планшет обратно в инкубатор после того, как все измерения TEER будут записаны.
9. Нетто-значения на уровне 350 Ω и более указывают на образование монослоя. Повторяйте снова в последующие дни до тех пор, пока не будет достигнуто образование монослоя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, значения 1 000 Ω или больше могут быть зафиксированы на 3-й день, но со временем все они сойдутся к меньшему числу около 350 Ω.

8. Расчет TEER с помощью измерений чистого сопротивления с помощью вольтомметра

ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное формирование монослоя колоноидов даст измерения TEER более 115 Ω·^см2.

1. Возьмите отдельные значения чистого сопротивления и вычтите чистое сопротивление из фонового колодца. Вставки для клеточных культур, покрытые мембраной базального матрикса, дают нетто-показания около 100 Ω.
2. Возьмите измерения чистого сопротивления с вычитанием фона и умножьте их на площадь поверхности вставки для клеточной культуры. 24-луночная вставка для клеточных культур имеет площадь поверхности 0,33 см² .
3. Если значения составляют 115 Ω·^см2 или более, переходите к последующему экспериментальному анализу.

9. Индуцирование воспаления в эпителиальных монослоях с помощью медиаторов воспаления

1. После того, как успешные монослои сформировались, добавьте медиаторы воспаления в культуру на базальной стороне культуры. Приготовьте монослойную среду медиатора воспаления, как описано на шаге 1.9, и добавьте 400 мкл в каждую лунку в новой 24-луночной планшете.
2. Удалите среду с апикальной стороны вкладыша для клеточной культуры и добавьте 150 мкл мышиной монослойной среды без Y-27632. Не дополняйте эту сторону медиаторами воспаления. Однако, если гибель клеток кажется чрезмерной, оставьте Y-27632 в СМИ. Это должен определить конечный пользователь.
3. Переносят вкладыши клеточных культур на новую 24-луночную пластину и помещают их в лунки, дополненные монослойной средой медиатора воспаления.
4. Стимулируют монослои медиаторами воспаления в течение 24-72 ч, в зависимости от эксперимента.
5. Чтобы протестировать лекарственные реакции с использованием этой модели воспаления, добавьте монослойную среду на апикальной стороне вкладыша в клеточную культуру препаратом выбора. Препарат может быть добавлен в любой момент эксперимента, в зависимости от механизма действия препарата и последующих параметров, подлежащих оценке.

Результаты

3D система культивирования кишечных колоноидов является бесценным инструментом для изучения внутреннего вклада эпителия в гомеостаз слизистой оболочки кишечника. Описанный протокол содержит подробные инструкции о том, как изолировать крипты от мышей C57BL/6J (WT) в возрасте 8 недель и созд...

Обсуждение

Разработка органоидов произвела революцию в том, как научное сообщество изучает системы органов in vitro , с возможностью частичного повторения клеточной структуры и функции животного или человека в чашке. Кроме того, органоидные системы, полученные от людей с заболеваниями, предлаг?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)