A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.
אפיתל המעי ממלא תפקיד חיוני בבריאות האדם, ומספק מחסום בין המארח לסביבה החיצונית. שכבת תאים דינמית מאוד זו מספקת את קו ההגנה הראשון בין אוכלוסיות מיקרוביאליות וחיסוניות ומסייעת לווסת את התגובה החיסונית של המעי. הפרעה במחסום האפיתל היא סימן היכר של מחלות מעי דלקתיות (IBD) והיא מעניינת למיקוד טיפולי. מערכת תרבית המעי הגס התלת-ממדית היא מודל שימושי ביותר במבחנה לחקר דינמיקה של תאי גזע במעי ופיזיולוגיה של תאי אפיתל בפתוגנזה של IBD. באופן אידיאלי, הקמת קולונואידים מרקמת אפיתל דלקתית של בעלי חיים תהיה מועילה ביותר בהערכת ההשפעות הגנטיות והמולקולריות על מחלות. עם זאת, הראינו כי שינויים באפיתל in vivo אינם נשמרים בהכרח בקולונואידים שנוצרו מעכברים עם דלקת חריפה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו פרוטוקול לטיפול בקולונואידים עם קוקטייל של מתווכי דלקת שבדרך כלל מוגברים במהלך IBD. בעוד שמערכת זו יכולה להיות מיושמת בכל מקום בתנאי תרבית שונים, פרוטוקול זה שם דגש על טיפול הן בקולונואידים מובחנים והן במונושכבות דו-ממדיות הנגזרות מקולונואידים מבוססים. בסביבת תרבית מסורתית, קולונואידים מועשרים בתאי גזע של המעי, ומספקים סביבה אידיאלית לחקר נישת תאי הגזע. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת ניתוח של התכונות של הפיזיולוגיה של המעי, כגון תפקוד המחסום. יתר על כן, קולונואידים מסורתיים אינם מציעים את ההזדמנות לחקור את התגובה התאית של תאי אפיתל ממוינים סופניים לגירויים מעודדי דלקת. השיטות המוצגות כאן מספקות מסגרת ניסויית חלופית להתמודדות עם מגבלות אלה. מערכת התרבית החד-שכבתית הדו-ממדית מציעה גם הזדמנות לבדיקת תרופות טיפוליות ex vivo. שכבת תאים מקוטבת זו יכולה להיות מטופלת עם מתווכי דלקת בצד הבסיסי של התא ובמקביל עם טיפולים משוערים כדי לקבוע את התועלת שלהם בטיפול ב- IBD.
מחלת מעי דלקתית (IBD) היא מחלה כרונית, הפוגתית והתקפית המאופיינת באפיזודות של דלקת ושקט קליני. האטיולוגיה של IBD היא רב-גורמית, אך מאפיינים אופייניים עיקריים של המחלה כוללים תפקוד מחסום פגום וחדירות מוגברת של אפיתל המעי, בנוסף למפל איתות פרו-דלקתי המופעל בתוך תא האפיתל 1,2. מספר מודלים במבחנה ו-in vivo שימשו לשחזור תגובת האפיתל במהלך IBD, כולל תרבית תאים ומודלים של דלקת3. עם זאת, לכל המערכות הללו יש חסרונות חשובים המגבילים את יכולתן לשחזר את שינויי האפיתל במהלך IBD4. רוב קווי התאים המשמשים לחקר IBD עוברים טרנספורמציה, יש להם את היכולת ליצור mono....
כל הניסויים ברקמות מורין המתוארים כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית באוניברסיטת פיטסבורג ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה למחקר וטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג ו- UPMC.
1. הכנה לתרבות
הערה: כל הריאגנטים מפורטים בסעיף 'טבלת חומרים ' וניתן למצוא את כל הרכבי הפתרונות בטבלת הרכב הפתרונות (טבלה 1).
מערכת תרבית המעי הגס התלת-ממדית היא כלי רב ערך לחקר התרומה הפנימית של האפיתל להומאוסטזיס רירית המעי. הפרוטוקול המתואר מספק הוראות מפורטות כיצד לבודד קריפטות מעכברי C57BL/6J (WT) בגיל 8 שבועות ולהקים מערכת תרבית קולונואידים ארוכת טווח שניתן לתפעל עבור יישומים מרובים במורד הזרם. עם הבידוד והציפו.......
פיתוח אורגנואידים חולל מהפכה באופן שבו הקהילה המדעית חוקרת מערכות איברים במבחנה עם היכולת לשחזר חלקית את המבנה והתפקוד התאי מבעל חיים או אדם בצלחת. יתר על כן, מערכות אורגנואידים שמקורן בבני אדם עם מחלות מציעות כלי מבטיח לרפואה מותאמת אישית שיכול להנחות קבלת החלטות טיפוליות. כאן, אנו ?.......
לכותבים התורמים אין מה לחשוף.
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים למענקי בריאות R01DK120986 (ל- K.P.M).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved