A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.

Abstract

אפיתל המעי ממלא תפקיד חיוני בבריאות האדם, ומספק מחסום בין המארח לסביבה החיצונית. שכבת תאים דינמית מאוד זו מספקת את קו ההגנה הראשון בין אוכלוסיות מיקרוביאליות וחיסוניות ומסייעת לווסת את התגובה החיסונית של המעי. הפרעה במחסום האפיתל היא סימן היכר של מחלות מעי דלקתיות (IBD) והיא מעניינת למיקוד טיפולי. מערכת תרבית המעי הגס התלת-ממדית היא מודל שימושי ביותר במבחנה לחקר דינמיקה של תאי גזע במעי ופיזיולוגיה של תאי אפיתל בפתוגנזה של IBD. באופן אידיאלי, הקמת קולונואידים מרקמת אפיתל דלקתית של בעלי חיים תהיה מועילה ביותר בהערכת ההשפעות הגנטיות והמולקולריות על מחלות. עם זאת, הראינו כי שינויים באפיתל in vivo אינם נשמרים בהכרח בקולונואידים שנוצרו מעכברים עם דלקת חריפה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, פיתחנו פרוטוקול לטיפול בקולונואידים עם קוקטייל של מתווכי דלקת שבדרך כלל מוגברים במהלך IBD. בעוד שמערכת זו יכולה להיות מיושמת בכל מקום בתנאי תרבית שונים, פרוטוקול זה שם דגש על טיפול הן בקולונואידים מובחנים והן במונושכבות דו-ממדיות הנגזרות מקולונואידים מבוססים. בסביבת תרבית מסורתית, קולונואידים מועשרים בתאי גזע של המעי, ומספקים סביבה אידיאלית לחקר נישת תאי הגזע. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת ניתוח של התכונות של הפיזיולוגיה של המעי, כגון תפקוד המחסום. יתר על כן, קולונואידים מסורתיים אינם מציעים את ההזדמנות לחקור את התגובה התאית של תאי אפיתל ממוינים סופניים לגירויים מעודדי דלקת. השיטות המוצגות כאן מספקות מסגרת ניסויית חלופית להתמודדות עם מגבלות אלה. מערכת התרבית החד-שכבתית הדו-ממדית מציעה גם הזדמנות לבדיקת תרופות טיפוליות ex vivo. שכבת תאים מקוטבת זו יכולה להיות מטופלת עם מתווכי דלקת בצד הבסיסי של התא ובמקביל עם טיפולים משוערים כדי לקבוע את התועלת שלהם בטיפול ב- IBD.

Introduction

מחלת מעי דלקתית (IBD) היא מחלה כרונית, הפוגתית והתקפית המאופיינת באפיזודות של דלקת ושקט קליני. האטיולוגיה של IBD היא רב-גורמית, אך מאפיינים אופייניים עיקריים של המחלה כוללים תפקוד מחסום פגום וחדירות מוגברת של אפיתל המעי, בנוסף למפל איתות פרו-דלקתי המופעל בתוך תא האפיתל 1,2. מספר מודלים במבחנה ו-in vivo שימשו לשחזור תגובת האפיתל במהלך IBD, כולל תרבית תאים ומודלים של דלקת3. עם זאת, לכל המערכות הללו יש חסרונות חשובים המגבילים את יכולתן לשחזר את שינויי האפיתל במהלך IBD4. רוב קווי התאים המשמשים לחקר IBD עוברים טרנספורמציה, יש להם את היכולת ליצור mono....

Protocol

כל הניסויים ברקמות מורין המתוארים כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית באוניברסיטת פיטסבורג ונערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה למחקר וטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג ו- UPMC.

1. הכנה לתרבות

הערה: כל הריאגנטים מפורטים בסעיף 'טבלת חומרים ' וניתן למצוא את כל הרכבי הפתרונות בטבלת הרכב הפתרונות (טבלה 1).

  1. הכן אמצעי שטיפת עכבר כמתואר בטבלה 1. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
  2. הכן מאגר בידוד קריפטה 1 (CIB1) כמתואר בטבלה 1. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
    זהירות: Dithiothreitol (DT....

תוצאות

מערכת תרבית המעי הגס התלת-ממדית היא כלי רב ערך לחקר התרומה הפנימית של האפיתל להומאוסטזיס רירית המעי. הפרוטוקול המתואר מספק הוראות מפורטות כיצד לבודד קריפטות מעכברי C57BL/6J (WT) בגיל 8 שבועות ולהקים מערכת תרבית קולונואידים ארוכת טווח שניתן לתפעל עבור יישומים מרובים במורד הזרם. עם הבידוד והציפו.......

Discussion

פיתוח אורגנואידים חולל מהפכה באופן שבו הקהילה המדעית חוקרת מערכות איברים במבחנה עם היכולת לשחזר חלקית את המבנה והתפקוד התאי מבעל חיים או אדם בצלחת. יתר על כן, מערכות אורגנואידים שמקורן בבני אדם עם מחלות מציעות כלי מבטיח לרפואה מותאמת אישית שיכול להנחות קבלת החלטות טיפוליות. כאן, אנו ?.......

Disclosures

לכותבים התורמים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים למענקי בריאות R01DK120986 (ל- K.P.M).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4-μM transparent transwell, 24-wellGreiner Bio-one662-641
15-mL conical tubesThermo Fisher 12-565-269
50-mL conical tubesThermo Fisher 12-565-271
70-μM cell strainerVWR76327-100
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement Invitrogen12587-010Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVOWorld Precision InstrumentsSTX2
Corning Matrigel GFR Membrane MixCorning354-230Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-5GStock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucoseThermo Fisher11960-069Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and MagnesiumGibco 14190-144Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)Sigma-AldrichE7889Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine SerumBio-TechneS11150HStock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mmThermo Fisher 12-550-15
G418InvivoGenant-ga-1Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin ReagentGibco/Fisher15750-060Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1Fisher Scientific35050-061Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 MGibco15630-080Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγR&D Systems285-IFStock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1βR&D Systems201-LBStock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFαR&D Systems210-TAStock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide SigmaH1009Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B GoldInvivoGenant-hg-1Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell LineATCCCRL-3276
mEGFNovusNBP2-35176Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplementInvitrogen17502-048Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteineSigma A9165-5GStock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
NogginPeprotech250-38Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher15140-122Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposableVWR25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterileGreiner Bio-one5666-2160
R-SpondinR&D Systems3474-RS-050Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE ExpressThermo Fisher12604-013Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water Invitrogen10977-023Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride Abcamab120129Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved