Studiare gli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale in vitro su colonoidi murini accertati

Riepilogo

Descriviamo un protocollo che descrive in dettaglio l'isolamento delle cripte del colon murino per lo sviluppo di colonoidi tridimensionali. I colonoidi stabiliti possono quindi essere differenziati terminalmente per riflettere la composizione cellulare dell'epitelio ospite prima di ricevere una sfida infiammatoria o di essere diretti a stabilire un monostrato epiteliale.

Abstract

L'epitelio intestinale svolge un ruolo essenziale nella salute umana, fornendo una barriera tra l'ospite e l'ambiente esterno. Questo strato cellulare altamente dinamico fornisce la prima linea di difesa tra popolazioni microbiche e immunitarie e aiuta a modulare la risposta immunitaria intestinale. La rottura della barriera epiteliale è un segno distintivo della malattia infiammatoria intestinale (IBD) ed è di interesse per il targeting terapeutico. Il sistema di coltura di colonoidi tridimensionali è un modello in vitro estremamente utile per lo studio della dinamica delle cellule staminali intestinali e della fisiologia delle cellule epiteliali nella patogenesi delle IBD. Idealmente, stabilire colonoidi dal tessuto epiteliale infiammato degli animali sarebbe più utile per valutare le influenze genetiche e molecolari sulla malattia. Tuttavia, abbiamo dimostrato che i cambiamenti epiteliali in vivo non sono necessariamente mantenuti nei colonoidi stabiliti da topi con infiammazione acuta. Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato un protocollo per trattare i colonoidi con un cocktail di mediatori infiammatori che sono tipicamente elevati durante l'IBD. Mentre questo sistema può essere applicato ovunque a varie condizioni di coltura, questo protocollo enfatizza il trattamento sia su colonoidi differenziati che su monostrati 2-dimensionali derivati da colonoidi stabiliti. In un ambiente di coltura tradizionale, i colonoidi sono arricchiti con cellule staminali intestinali, fornendo un ambiente ideale per studiare la nicchia delle cellule staminali. Tuttavia, questo sistema non consente un'analisi delle caratteristiche della fisiologia intestinale, come la funzione di barriera. Inoltre, i colonoidi tradizionali non offrono l'opportunità di studiare la risposta cellulare delle cellule epiteliali terminalmente differenziate agli stimoli proinfiammatori. I metodi qui presentati forniscono un quadro sperimentale alternativo per affrontare queste limitazioni. Il sistema di coltura monostrato 2-dimensionale offre anche un'opportunità per lo screening terapeutico dei farmaci ex vivo. Questo strato polarizzato di cellule può essere trattato con mediatori infiammatori sul lato basale della cellula e in concomitanza con terapie putative apicalmente per determinare la loro utilità nel trattamento dell'IBD.

Introduzione

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica, remittente e recidivante caratterizzata da episodi di infiammazione e quiescenza clinica. L'eziologia dell'IBD è multifattoriale, ma le caratteristiche chiave della malattia includono la funzione barriera difettosa e l'aumento della permeabilità dell'epitelio intestinale, oltre alle cascate di segnalazione proinfiammatoria attivate all'interno del compartimento epiteliale ^1,2. Diversi modelli in vitro e in vivo sono stati utilizzati per ricapitolare la risposta epiteliale durante l'IBD, compresi i modelli di coltura cellulare e murino di infiammazione³. Tuttavia, tutti questi sistemi hanno importanti carenze che limitano la loro capacità di ricapitolare i cambiamenti epiteliali durante IBD⁴. La maggior parte delle linee cellulari utilizzate per studiare l'IBD sono trasformate, hanno la capacità di formare un monostrato e possono differenziare³ ma propagarsi intrinsecamente in modo diverso rispetto alle cellule epiteliali intestinali non trasformate nell'ospite. Diversi modelli murini di infiammazione sono utilizzati per studiare IBD, alcuni dei quali includono modelli knockout, modelli infettivi, modelli infiammatori chimici e modelli di trasferimento delle cellule T 5,6,7,8. Mentre ognuno può studiare alcuni aspetti eziologici dell'IBD, come le predisposizioni genetiche, la disfunzione della barriera, la deregolazione immunitaria e il microbioma, sono limitati nella loro capacità di studiare la natura multifattoriale della malattia.

Gli organoidi intestinali, inclusi enteroidi e colonoidi, sono stati affermati nell'ultimo decennio come un utile modello in vitro per studiare non solo la dinamica delle cellule staminali intestinali, ma anche il loro ruolo che l'integrità della barriera e la funzione dell'epitelio intestinale svolgono nell'omeostasi e nella malattia intestinale. Queste entità hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della patogenesi di IBD⁹ e hanno aperto nuove opportunità per la medicina personalizzata. I colonoidi, o colture tissutali auto-organizzanti derivate da cellule staminali dal colon, sono stati sviluppati sia da tessuto murino che umano in un processo che consente alle cellule staminali situate all'interno delle cripte intestinali di propagarsi e mantenersi indefinitamente¹⁰. La nicchia delle cellule staminali in vivo si basa su fattori extracellulari per sostenere la sua crescita, in particolare le vie canoniche di segnalazione Wnt e di segnalazione delle proteine morfogeniche ossee¹¹. L'aggiunta di questi fattori promuove la salute e la longevità dei colonoidi, ma spinge anche la coltura verso uno stato simile alle cellule staminali che non riflette l'architettura cellulare epiteliale in vivo, che consiste sia di cellule auto-rinnovanti che di cellule terminalmente differenziate^12,13. Mentre la funzionalità dell'epitelio intestinale dipende dalla continua diafonia tra il compartimento delle cellule staminali e le cellule differenziate, la capacità di avere entrambi in un sistema di coltura di colonoidi è piuttosto limitata. Nonostante queste limitazioni, il sistema di coltura organoide rimane il gold standard per studiare le proprietà intrinseche dell'epitelio ex vivo. Tuttavia, potrebbe essere necessario prendere in considerazione strategie culturali alternative per rispondere alla domanda scientifica in questione.

È stato dimostrato che i topi con un regime continuo di 7 giorni di destrano solfato di sodio (DSS) sviluppano sia infiammazione epiteliale che disfunzione barriera¹⁴. Inoltre, il fallimento della biogenesi mitocondriale e la riprogrammazione metabolica all'interno dell'epitelio intestinale, che hanno dimostrato di essere evidenti nell'IBD umana, sono stati catturati anche in questo modello DSS di colite¹⁵. Tuttavia, i nostri dati preliminari dimostrano che le caratteristiche del fallimento della biogenesi mitocondriale non sono mantenute nei colonoidi derivati dalle cripte di animali trattati con DSS (Figura supplementare 1). Pertanto, i metodi di coltura alternativi devono essere utilizzati quando si esamina come l'infiammazione guida i cambiamenti epiteliali durante l'infiammazione intestinale murina. Qui, delineiamo un protocollo che abbiamo sviluppato che descrive 1) come isolare le cripte dall'intero tessuto del colon per la creazione di colonoidi murini, 2) come differenziare terminalmente questa popolazione cellulare per riflettere la popolazione cellulare così com'è in vivo e 3) come indurre l'infiammazione in questo modello in vitro . Per studiare le interazioni farmacologiche all'interno dell'epitelio infiammato, abbiamo sviluppato un protocollo per stabilire monostrati 2-dimensionali (2D) da colonoidi murini che possono essere trattati basalmente con mediatori infiammatori e trattati apicamente con terapie farmacologiche.

Protocollo

Tutte le sperimentazioni che utilizzano tessuti murini qui descritti sono state approvate dall'Institutional Review Board dell'Università di Pittsburgh e condotte in conformità con le linee guida stabilite dall'Animal Research and Care Committee dell'Università di Pittsburgh e da UPMC.

1. Preparazione alla cultura

NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nella sezione Tabella dei materiali e tutte le composizioni della soluzione sono disponibili nella tabella di composizione della soluzione (Tabella 1).

1. Preparare il mezzo di lavaggio del topo come descritto nella Tabella 1. Conservare a 4°C per un massimo di 2 mesi.
2. Preparare il buffer di isolamento della cripta 1 (CIB1) come descritto nella Tabella 1. Conservare a 4°C per un massimo di 2 mesi.
   ATTENZIONE: Il ditiotreitolo (DTT) è considerato pericoloso dallo standard di comunicazione dei pericoli OSHA a causa della potenziale tossicità acuta se ingerito e dei danni alla pelle e agli occhi se tali aree sono esposte ad esso. Guanti protettivi, protezione per gli occhi e protezione per il viso devono essere utilizzati quando si maneggia questa sostanza chimica.
3. Preparare il buffer di isolamento della cripta 2 (CIB2) come descritto nella Tabella 1. Conservare a 4°C per un massimo di 2 mesi.
4. Preparare il mezzo condizionato da L-WRN secondo un protocollo¹⁶ precedentemente pubblicato.
5. Preparare il mezzo completo per i colonoidi come descritto nella Tabella 1. Il terreno di coltura completo per colonoidi può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.
6. Preparare il mezzo di differenziazione come descritto nella tabella 1. Questo protocollo è stato modificato da un documento precedentemente pubblicato¹⁷. Il mezzo di differenziazione può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.
7. Preparare il mezzo mediatore dell'infiammazione come descritto nella Tabella 1. Questo protocollo è stato modificato da un documento precedentemente pubblicato¹⁸. Il mezzo mediatore dell'infiammazione può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.
8. Preparare il mezzo monostrato murino. Omettere Y-27632 quando si sfidano i monostrati con fattori infiammatori e/o farmaci. Il mezzo monostrato murino può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.
9. Preparare il mezzo monostrato mediatore dell'infiammazione. Il mezzo monostrato mediatore dell'infiammazione può essere conservato fino a 5 giorni a 4°C senza perdita di attività.

2. Isolamento della cripta dal tessuto del colon murino

NOTA: Trasferire il tessuto sul ghiaccio. Prelevare la quantità appropriata di matrice della membrana basale dallo stoccaggio di -20 ° C e scongelare sul ghiaccio. Ogni pozzetto da 24 è placcato con 15 μL di matrice a membrana basale. Preparare CIB1, CIB2 e il terreno di coltura completo per i colonidi come descritto nel paragrafo 1.

1. Eutanasia di un topo C57BL/6J (6-8 settimane) secondo il protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee ed estrarre l'estremità distale (circa 5-7 cm) del colon usando pinzette e forbici pulite.
   NOTA: In questo studio, i soggetti sono stati eutanizzati usando l'incubazione della camera di anidride carbonica per 2-3 minuti seguita da lussazione cervicale.
   1. Per questo, posizionare il mouse sul dorso, fare un'incisione orizzontale appena sotto la gabbia toracica e poi un'incisione verticale dal centro dell'incisione orizzontale verso la base della coda per esporre la cavità addominale.
   2. Con una pinzetta, sposta l'intestino tenue fuori dal campo, identifica il colon e seguilo fino alla base della coda. Rompere il bacino con le forbici per esporre completamente il colon distale, se necessario. Usa le forbici per tagliare i 5-7 cm più distali del colon.
2. Posizionare il tessuto del colon su una superficie pulita. Rimuovere il grasso sieroso in eccesso che circonda il colon. Rimuovere la materia fecale lavando il contenuto luminale del colon con soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) utilizzando una siringa attaccata a un ago da 18 G 1 1/2. Quindi, posizionare il colon in un tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di DPBS ghiacciato e posizionarlo sul ghiaccio.
   NOTA: Se si isolano i due punti da più di un animale, posizionare il tessuto sul ghiaccio prima di passare all'animale successivo.
3. Trasferire il tessuto del colon in una capsula di Petri con 10 ml di DPBS ghiacciato e irrigare il lume due volte con DPBS utilizzando una pipetta P1.000.
4. Aprire il colon longitudinalmente usando le forbici e agitare delicatamente con una pinzetta per ~ 30 s nel DPBS per rimuovere eventuali contenuti fecali rimanenti.
5. Trasferire il tessuto in una nuova capsula di Petri con 10 ml di DPBS ghiacciato e di nuovo agitare delicatamente con una pinzetta prima di tagliare il colon in pezzi di 2 cm usando le forbici e metterli in un tubo conico da 50 ml con 7 ml di CIB1 ghiacciato. Incubare il tessuto in CIB1 su ghiaccio per 20 minuti.
   NOTA: I passaggi rimanenti vengono eseguiti all'interno di un armadio di sicurezza biologica.
6. Trasferire il tessuto con una pinzetta in un tubo conico preriscaldato da 50 mL contenente 7 mL di CIB2 e incubare a bagnomaria a 37°C per 5 minuti.
7. Rimuovere CIB2 dal tubo conico da 50 mL lasciando che il tessuto si depositi sul fondo del tubo conico e quindi pipettando il CIB2. Quindi, aggiungere 10 ml di mezzo di lavaggio del topo ghiacciato allo stesso tubo conico.
8. Procurarsi un nuovo tubo conico da 50 mL e posizionare un filtro da 70 μm sopra il tubo aperto.
9. Mentre si tiene il tubo con il contenuto del colon, ruotare la mano di circa 45°. Scuotere il tubo in modo oscillante e vigoroso per 45 secondi per liberare le cripte. Quindi, versare la sospensione della cripta attraverso il filtro cellulare da 70 μm in un nuovo tubo conico da 50 ml.
10. Utilizzando una pinzetta, riposizionare il tessuto del colon nel tubo conico vuoto da 50 ml e aggiungere 10 ml di mezzo di lavaggio del topo ghiacciato. Procurarsi un nuovo filtro cellulare da 70 μm e posizionarlo sopra il tubo conico da 50 mL contenente la soluzione filtrata precedente.
11. Di nuovo, prendere il tubo da 50 ml contenente i frammenti della cripta e agitarlo in modo identico a quello del punto 2.9. Filtrare il mezzo attraverso il filtro cellulare da 70 μm nel tubo conico da 50 mL per combinarlo con le cripte precedentemente filtrate.
    NOTA: Se la resa della cripta è bassa, agitare il tessuto del colon un'altra volta posizionando il tessuto in un tubo conico vuoto da 50 ml con 10 ml di mezzo di lavaggio del topo. Agitare il tessuto per 45-50 s per rilasciare le cripte. Inoltre, se la resa della cripta è bassa, aumentare il vigore dello scuotimento. Infine, se la resa complessiva della cripta è bassa, sia i pipetti che i tubi possono essere rivestiti con siero bovino fetale (FBS) per impedire l'aderenza del tessuto alla plastica.
12. Centrifugare il tubo conico da 50 mL contenente le cripte filtrate a 300 x g per 5 minuti a 4°C.
    NOTA: Un pellet deve essere osservato sul fondo del tubo conico da 50 ml.
13. Decantare il mezzo mediante pipettaggio, risospendere le cripte mediante pipettaggio su e giù con 10 ml di mezzo di lavaggio del topo ghiacciato e trasferire in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4°C.
14. Per ottenere una preparazione più pulita, lavare le cripte con altri 10 ml di mezzo di lavaggio del mouse. Decantare il mezzo precedente e risospendere le cripte pipettando su e giù in 10 ml di mezzo di lavaggio del topo. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4°C utilizzando un tubo conico da 15 mL.
    NOTA: È necessario prestare attenzione quando si esegue il pipettaggio del fluido perché, a volte, il pellet non viene centrifugato ermeticamente. Se il pellet non è stretto, pipettare la maggior parte del mezzo, lasciando 500 μL a 1 mL. Quindi, risospendere il pellet mediante pipettaggio in 10 ml di mezzo di lavaggio del topo e trasferire la soluzione in un tubo conico da 15 ml. La centrifugazione in un tubo conico più piccolo può migliorare la tenuta del pellet.
15. Decantare il mezzo e risospendere le cripte pipettando su e giù con 10 ml di mezzo di lavaggio del topo ghiacciato. Una volta risospese, contare le cripte al microscopio a campo chiaro pipettando immediatamente 10 μL del mezzo su un vetrino.
    1. Posizionare due gocce da 10 μL su estremità separate del vetrino e contare il numero di cripte in ciascuna goccia. Calcola la media dei numeri tra le due gocce per determinare il numero di cripte per 10 μL. Moltiplica questo numero per 100 per ottenere il numero di cripte in 1 ml.
       NOTA: Per un conteggio accurato, 10 μL della sospensione della cripta devono essere immediatamente rimossi dopo la risospensione. In caso contrario, le cripte cadranno sul fondo del tubo, il che comporterà un conteggio impreciso.
16. Con l'obiettivo di placcare 300-500 cripte per pozzetto, trasferire il volume appropriato di cripte risospese nel mezzo di lavaggio del topo in un nuovo tubo conico da 15 ml e portare a 10 ml con mezzo di lavaggio del topo ghiacciato. Centrifugare il tubo a 300 x g per 5 minuti a 4°C. Un piccolo pellet dovrebbe essere visibile sul fondo del tubo.
17. Rimuovere il surnatante con una pipetta di potenza. Utilizzare un pipettuccio P200 per rimuovere con cura qualsiasi mezzo residuo, lasciando solo il pellet.
18. Risospendere il pellet nella quantità appropriata di matrice di membrana basale ghiacciata pipettando lentamente su e giù. Fare attenzione a non introdurre bolle quando si risospende il pellet della cripta. Piastra 300-500 cripte / 15 μL di matrice di membrana basale in ciascun pozzetto di una piastra. Dopo la placcatura, capovolgere la piastra di coltura tissutale e metterla in un'incubatrice a 37°C per 10-20 minuti.
19. Invertire la piastra e aggiungere 500 μL del mezzo completo del colonoide di topo a ciascun pozzetto. Cambia il mezzo a giorni alterni fino a quando non sono pronti per il passaggio. Passare i colonidi ogni 3-5 giorni.

3. Passare i colonoidi

NOTA: Ogni pozzo può generalmente essere fatto passare da 1:4 a 1:6 in base alla densità del pozzo originale. Prelevare la quantità appropriata di matrice della membrana basale da -20°C e metterla sul ghiaccio per scongelarla. I colonoidi possono essere utilizzati per esperimenti dopo due passaggi. Quando si passano i coloidi, i passaggi vengono eseguiti in un armadio di sicurezza biologica per prevenire la contaminazione.

1. Rimuovere il mezzo dai pozzetti da far passare.
   1. Se ci sono detriti all'interno della matrice della membrana basale, che può verificarsi durante l'isolamento iniziale, è possibile utilizzare il seguente protocollo per ripulire i detriti:
      1. Aggiungere 1 mL di albumina sierica bovina (BSA) ghiacciata allo 0,1% in DPBS senza Ca 2⁺ o Mg²⁺ a ciascun pozzetto. Lasciare riposare per 5 minuti nell'armadietto di sicurezza biologica.
      2. Pipettare su e giù da tre a sette volte utilizzando una pipetta P1000 per interrompere la matrice della membrana basale e raccogliere il contenuto dei pozzetti in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare i colonoidi in un totale di 5-10 ml di BSA allo 0,1% in DPBS senza Ca 2+ o Mg²⁺. Portare al volume appropriato con lo 0,1% BSA.
      3. Centrifugare a 150 x g per 5 minuti a 4°C per pellettare i colonoidi ma non i detriti.
      4. Decantare il DPBS mediante pipettaggio, lasciando il pellet. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione enzimatica a temperatura ambiente (RT) e pipettare da tre a cinque volte.
      5. Posizionare il tubo conico da 15 mL con il reagente di dissociazione enzimatica e i colonoidi interrotti in un bagnomaria a 37°C per 3-4 minuti.
      6. Rimuovere il tubo dal bagnomaria, pipettare 3-5 volte, quindi portare a 10 ml con il mezzo di lavaggio del mouse. Procedere al passaggio 3.6.
2. Posizionare 500 μL di reagente di dissociazione enzimatica RT in ciascun pozzetto e lasciarlo riposare per circa 1 minuto prima di pipettare su e giù da tre a sette volte per interrompere la matrice della membrana basale.
3. Posizionare la piastra in un incubatore a 37°C per 3-4 minuti.
4. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e pipettare su e giù da tre a sette volte usando una pipetta P1000 per dissociare i colonoidi.
5. Trasferire il contenuto in un tubo conico da 15 mL e portare a 10 mL con un mezzo di lavaggio del topo ghiacciato.
6. Centrifugare il campione a 300 x g per 5 minuti a 4°C.
7. Rimuovere il fluido utilizzando una pipetta di potenza e una pipetta P200 secondo necessità, in modo che nel tubo conico rimanga solo un pellet.
8. Risospendere in una quantità appropriata di matrice di membrana basale ghiacciata pipettando delicatamente su e giù in base a quanti pozzetti devono essere placcati. Non introdurre bolle durante il pipettaggio. Posizionare i frammenti di colonoide in 15 μL di gocce di matrice della membrana basale per pozzetto.
9. Placcare le cripte, capovolgere la piastra di coltura tissutale, quindi posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 ° C per 10-20 minuti.
10. Infine, invertire la piastra e aggiungere 500 μL di mezzo colonoide di topo completo a ciascun pozzetto. Cambiare il terreno a giorni alterni fino a quando non sono diventati abbastanza grandi da essere fatti passare di nuovo in circa 3-5 giorni.

4. Differenziazione terminale delle cellule colonoidi

1. Far passare i colonoidi come sopra e aggiungere 500 μL del mezzo completo del colonoide di topo a ciascun pozzetto.
2. Almeno 48 ore dopo il passaggio, rimuovere il mezzo colonoide di topo completo e aggiungere 500 μL del mezzo di differenziazione a ciascun pozzetto (vedere paragrafo 1).
3. Incubare i colonoidi con mezzi di differenziazione per 48 ore, dopo di che possono essere utilizzati in esperimenti, compresa la raccolta di RNA e proteine.
   NOTA: I colonoidi possono essere valutati per la differenziazione raccogliendo RNA e valutando l'espressione di Lgr5 e Ki67, un marcatore di cellule staminali e un marcatore di proliferazione cellulare, rispettivamente, tramite la reazione a catena quantitativa trascrittasi-polimerasi inversa (qPCR). Le cellule terminalmente differenziate dovrebbero avere un'espressione relativamente bassa di Lgr5 e Ki67 rispetto ai colonoidi coltivati nel mezzo colonoide tradizionale, dove le cellule sono più simili a staminali. La durata del tempo che i colonoidi devono incubare nel mezzo di differenziazione potrebbe dover essere ottimizzata per ogni singolo laboratorio. Fare riferimento alla Tabella supplementare 1 per l'elenco dei primer.

5. Indurre l'infiammazione nei colonoidi differenziati con mediatori infiammatori

1. Dopo che i colonoidi sono stati incubati per 2-3 giorni con il mezzo di differenziazione, rimuovere il mezzo esistente e aggiungere 500 μL del mezzo mediatore dell'infiammazione a ciascun pozzetto.
2. Lasciare incubare i pozzetti per 24-72 ore prima di raccogliere l'RNA e la proteina (o valutare altri parametri a valle). Cambia il mezzo ogni giorno.

6. Monostrati epiteliali intestinali derivati da colonoidi murini stabiliti

NOTA: I monostrati epiteliali intestinali murini derivano da colonoidi murini che sono stati fatti passare almeno due volte. Per consentire una formazione monostrato di successo in 3-5 giorni, è imperativo non separare i colonoidi in singole cellule. Gli organoidi frammentati che sono stati dissociati enzimaticamente in cluster cellulari sono ideali per la crescita.

1. Preparare tutti i reagenti prima di iniziare l'esperimento. Scongelare la matrice della membrana basale sul ghiaccio. Preparare il mezzo monostrato murino come descritto al paragrafo 1 . Diluire la membrana basale scongelata 1:20 con il mezzo monostrato murino freddo. Mantenere il ghiaccio.
2. Utilizzare una pinza sterile per posizionare un inserto di coltura cellulare trasparente da 0,4 μm in un singolo pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti (Tabella dei materiali). Prendi una punta angolare dell'inserto e trasferiscila nel pozzo. Ripetere l'operazione fino a quando non è disponibile il numero appropriato di inserti di coltura cellulare per la coltura.
   NOTA: Assicurarsi di rivestire un pozzetto di controllo aggiuntivo solo con la matrice della membrana basale . Questo inserto per coltura cellulare sarà utilizzato per misurare la resistenza di fondo dell'inserto di coltura cellulare senza cellule presenti, come descritto nella fase successiva (fase 6.3).
3. Utilizzando un pipetta P200, coprire la superficie apicale (superiore) di ciascun inserto di coltura cellulare con 150 μL di matrice di membrana basale diluita. Posizionare la punta del pipet al centro dell'inserto senza toccare la membrana dell'inserto ed espellere delicatamente la soluzione. Porre la piastra in un incubatore sterile a 37°C con il 5% di CO₂ per almeno 1 ora.
4. Rimuovere delicatamente la matrice della membrana basale prima dell'uso e lasciare asciugare gli inserti di coltura cellulare in un armadio di sicurezza biologica per un minimo di 10 minuti.
   1. Per rimuovere la matrice della membrana basale, ruotare la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45°. Posizionare un solo dito sull'angolo della punta per stabilizzare l'inserto e, utilizzando un pipet P200, posizionare delicatamente la punta del pipet lungo il lato inferiore dell'inserto e rimuovere la matrice.
   2. Rimuovere qualsiasi residuo in eccesso lavando ogni inserto di coltura cellulare con 150 μL di DPBS sterile senza Ca 2+ o Mg²⁺.
5. Dopo 10 minuti di essiccazione, aggiungere 400 μL di mezzo monostrato murino sul fondo dell'inserto di coltura cellulare e 75 μL sulla parte superiore. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli inserti di coltura cellulare sono immersi. Lasciare la piastra nell'armadio di sicurezza biologica o rimetterla nell'incubatore fino al momento del bisogno.
6. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti di colonoidi intestinali maturi (organoidi il giorno 3-5 della crescita) dall'incubatore a 37°C, 5% di CO₂ e posizionarla sotto l'armadio di sicurezza biologica. Rimuovere il terreno con punte sterili e lavare bene ogni pozzetto con 1 mL di DPBS sterile RT (senza Ca 2+ o Mg²⁺).
   NOTA: Un singolo pozzetto di 75-125 colonoidi maturi è diviso in un rapporto di 1:4.
7. Rimuovere il DPBS senza Ca 2+ o Mg²⁺ utilizzando punte sterili e digerire ogni tappo della matrice della membrana basale posizionando 500 μL di reagente di dissociazione enzimatica RT in ciascun pozzetto da far passare.
8. Pipet ogni pozzetto su e giù circa 6-10 volte per rompere la spina. Non graffiare il fondo della piastra per rimuovere la spina. Ruotare invece la piastra a 24 pozzetti con un angolo di 45°, posizionare la punta del pipet sul bordo della spina e spostarla delicatamente.
9. Riporre la piastra a 24 pozzetti in un incubatore sterile a 37°C, 5% CO₂ per 3-4 minuti.
10. Rimuovere la piastra e incanalare il reagente di dissociazione enzimatica su e giù da cinque a sette volte per ciascun pozzetto sotto un armadio di sicurezza biologica. Trasferire i colonoidi dissociati da ciascun pozzetto in un tubo conico sterile da 15 ml. Portare fino a un volume di 10 ml con un mezzo di lavaggio del mouse ghiacciato.
11. Centrifugare i colonoidi parzialmente digeriti a 300 x g a 4°C per 5 minuti in una centrifuga a secchio oscillante.
12. Sotto l'armadio di sicurezza biologica, rimuovere il surnatante dal pellet utilizzando un pipet da 10 ml. Rimuovere qualsiasi supporto rimanente utilizzando un pipet P200. Risospendere il pellet colonoide in mezzo monostrato murino. Aggiungere 75 μL di terreno per ogni inserto di coltura cellulare di colonoidi frammentati da placcare.
13. Aggiungere 75 μL di sospensione di colonoide al centro di ciascun inserto di coltura cellulare. Prima di aggiungere la sospensione di colonoide a ciascun pozzetto, sollevare e scendere delicatamente una o due volte prima di rimuovere i 75 μL, che consentono una placcatura più uniforme.
14. Posizionare la piastra a 24 pozzetti con inserti di coltura cellulare su una piattaforma rotante per 10 minuti per consentire ulteriormente una dispersione uniforme attraverso l'inserto di coltura cellulare.
15. Posizionare la piastra in un incubatore sterile a 37°C, 5% CO₂ .
16. Il giorno successivo (giorno 1), rimuovere i frammenti di colonoide non attaccati pipettando il mezzo su e giù da tre a cinque volte con un pipet P200. Posizionare delicatamente la punta accanto all'interno dell'inserto di coltura cellulare per non interrompere le cellule intestinali attaccate. Non introdurre bolle nel mezzo, in quanto ciò impedisce la rimozione di tutti i frammenti non attaccati.
17. Rimuovere immediatamente la miscela di mezzo e colonide. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli inserti di coltura cellulare sono stati puliti.
18. Aggiungere delicatamente 150 μL di mezzo monostrato murino preriscaldato sul lato apicale di ciascun inserto di coltura cellulare. Aggiungere 400 μL di mezzo monostrato murino riscaldato a ciascun pozzetto di una nuova piastra a 24 pozzetti. Trasferire l'inserto di coltura cellulare sulla nuova piastra afferrando la sua punta usando una pinza sterile. Cambiare il mezzo a giorni alterni fino alla confluenza.
    NOTA: I frammenti di colonoide dovrebbero formare un monostrato confluente 3-5 giorni dopo la placcatura.

7. Misurazione della resistenza netta dei monostrati epiteliali utilizzando un voltohmmetro nei giorni 3 - 5 di coltura monostrato

NOTA: Gli elettrodi delle bacchette assomigliano a una pinza e sono di lunghezza asimmetrica. Il braccio più lungo della sonda è l'elettrodo basolaterale e il braccio più corto è l'elettrodo apicale. La sonda può essere difficile da inserire tra l'interno e l'esterno dell'inserto di coltura cellulare. Posizionare la sonda con una leggera angolazione al momento dell'inserimento, seguito dal raddrizzamento verticale della sonda, eviterà che la sonda si blocchi. Assicurati di leggere la resistenza netta di ciascun inserto di coltura cellulare con un'angolazione simile, poiché ciò può influire sui valori.

1. Posizionare il voltohmmetro e tutti i reagenti all'interno di un armadio di sicurezza biologica.
   1. Collegare il voltohmmetro alla presa CA più vicina e collegare il connettore modulare in plastica della sonda dell'elettrodo nel jack INPUT sul display anteriore.
   2. Per posizionare il voltohmmetro con un angolo di 45°, ruotare il braccio metallico sul retro dell'apparecchiatura fino a quando non si blocca in posizione.
   3. Ora, accendi il voltohmmetro capovolgendo l'interruttore di alimentazione UP sul display anteriore. Infine, ruota l'interruttore verso l'alto verso OHMS per visualizzare la lettura in questa metrica.
2. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti dall'incubatore a 37°C, 5% di CO₂ e posare la piastra piatta nell'armadio di sicurezza biologica. La resistenza elettrica transepiteliale (TEER) è sensibile alla temperatura. Rimuovere la piastra solo immediatamente prima che il TEER venga letto.
3. Sterilizzare la sonda dell'elettrodo in etanolo preriscaldato al 70% per 30 s a 1 min. Rimuovere la sonda, capovolgerla e sfiorarla una o due volte per rimuovere l'etanolo in eccesso. Lasciare asciugare la sonda all'aria per circa 30 secondi.
4. Lavare l'etanolo residuo rimasto sulla sonda con un mezzo di lavaggio del mouse preriscaldato.
   ATTENZIONE: Non lasciare che nessuna delle goccioline di etanolo rimanenti più in alto sulla sonda cada nell'inserto della coltura cellulare. Quando si lava via l'etanolo con il mezzo, non lasciare che il mezzo vada sopra il campo di etanolo sterile. Ciò potrebbe causare l'ingresso di terreno contaminato nell'inserto della coltura cellulare.
5. Tenere la sonda perpendicolare all'inserto della coltura cellulare. Inserire l'elettrodo basolaterale (estremità più lunga della sonda) all'esterno dell'inserto di coltura cellulare fino a quando non tocca la base della piastra a 24 pozzetti. Far scorrere l'elettrodo apicale (estremità più corta della sonda) nell'inserto della coltura cellulare. Non variare la distanza dei due elettrodi da pozzo a pozzo. Ciò avrà un impatto sulla misurazione TEER.
6. Verificare che l'elettrodo apicale non tocchi la base dell'inserto di coltura cellulare prima di leggere il TEER. Iniziare con l'inserto per colture cellulari di controllo in background e registrare il valore. Il valore verrà visualizzato automaticamente digitalmente sulla parte anteriore del voltohmmetro.
7. Ripetere i passaggi 7.5-7.6 per ogni inserto di coltura cellulare.
   NOTA: Se esistono diverse condizioni sperimentali tra gli inserti di coltura cellulare, sterilizzare la sonda tra ogni nuova condizione. Iniziare dal passaggio 7.1 e procedere numericamente attraverso i passaggi.
8. Riposizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore una volta registrate tutte le misurazioni TEER.
9. I valori netti a 350 Ω o superiori sono indicativi della formazione di monostrati. Ripetere nuovamente nei giorni successivi fino al raggiungimento della formazione del monostrato.
   NOTA: Generalmente, valori di 1.000 Ω o superiori possono essere acquisiti il giorno 3, ma nel tempo convergeranno tutti su un numero inferiore intorno a 350 Ω.

8. Calcolo del TEER utilizzando le misure di resistenza netta dal voltohmmetro

NOTA: La riuscita formazione monostrato dei colonoidi darà misure TEER superiori a 115 Ω·cm².

1. Prendi i singoli valori di resistenza netta e sottrai bene la resistenza netta dallo sfondo. Gli inserti di coltura cellulare rivestiti con la membrana della matrice basale daranno una lettura netta di circa 100 Ω.
2. Prendi le misurazioni della resistenza netta sottratta dallo sfondo e moltiplicale per la superficie dell'inserto di coltura cellulare. Un inserto per coltura cellulare a 24 pozzetti ha una superficie di 0,33 cm².
3. Se i valori sono pari o superiori a 115 Ω cm² , procedere alle prove sperimentali a valle.

9. Indurre l'infiammazione nei monostrati epiteliali con mediatori infiammatori

1. Una volta che si sono formati monostrati di successo, aggiungere mediatori infiammatori alla coltura sul lato basale della coltura. Preparare il mezzo monostrato mediatore dell'infiammazione, come descritto al punto 1.9, e aggiungere 400 μL a ciascun pozzetto in una nuova piastra a 24 pozzetti.
2. Rimuovere il mezzo dal lato apicale dell'inserto di coltura cellulare e aggiungere 150 μL del mezzo monostrato murino senza Y-27632. Non integrare questo lato con mediatori infiammatori. Tuttavia, se la morte cellulare sembra eccessiva, lasciare l'Y-27632 nei media. Questo deve essere determinato dall'utente finale.
3. Trasferire gli inserti di coltura cellulare in una nuova piastra a 24 pozzetti e posizionarli nei pozzetti integrati con il mezzo monostrato mediatore dell'infiammazione.
4. Stimolare i monostrati con mediatori infiammatori per 24-72 ore, a seconda dell'esperimento.
5. Per testare le risposte ai farmaci utilizzando questo modello infiammatorio, integrare il mezzo monostrato sul lato apicale dell'inserto di coltura cellulare con il farmaco di scelta. Il farmaco può essere aggiunto in qualsiasi momento dell'esperimento, a seconda del meccanismo d'azione del farmaco e dei parametri a valle da valutare.

Risultati

Il sistema di coltura di colonoidi intestinali 3D è uno strumento prezioso per studiare il contributo intrinseco dell'epitelio all'omeostasi della mucosa intestinale. Il protocollo descritto fornisce istruzioni dettagliate su come isolare le cripte dai topi C57BL / 6J (WT) a 8 settimane di età e stabilire un sistema di coltura di colonoidi a lungo termine che può essere manipolato per più applicazioni a valle. Dopo l'isolamento e la placcatura delle cripte nella matrice della membrana basale, le cripte appaiono dense...

Discussione

Lo sviluppo di organoidi ha rivoluzionato il modo in cui la comunità scientifica studia i sistemi di organi in vitro con la capacità di ricapitolare parzialmente la struttura e la funzione cellulare di un animale o di un essere umano in un piatto. Inoltre, i sistemi organoidi derivati da esseri umani con malattie offrono uno strumento promettente per la medicina personalizzata che potrebbe guidare il processo decisionale terapeutico. Qui, descriviamo un protocollo di isolamento della cripta che funziona bene e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)