Studiare gli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale in vitro su colonoidi murini accertati

Riepilogo

Descriviamo un protocollo che descrive in dettaglio l'isolamento delle cripte del colon murino per lo sviluppo di colonoidi tridimensionali. I colonoidi stabiliti possono quindi essere differenziati terminalmente per riflettere la composizione cellulare dell'epitelio ospite prima di ricevere una sfida infiammatoria o di essere diretti a stabilire un monostrato epiteliale.

Abstract

L'epitelio intestinale svolge un ruolo essenziale nella salute umana, fornendo una barriera tra l'ospite e l'ambiente esterno. Questo strato cellulare altamente dinamico fornisce la prima linea di difesa tra popolazioni microbiche e immunitarie e aiuta a modulare la risposta immunitaria intestinale. La rottura della barriera epiteliale è un segno distintivo della malattia infiammatoria intestinale (IBD) ed è di interesse per il targeting terapeutico. Il sistema di coltura di colonoidi tridimensionali è un modello in vitro estremamente utile per lo studio della dinamica delle cellule staminali intestinali e della fisiologia delle cellule epiteliali nella patogenesi delle IBD. Idealmente, stabilire colonoidi dal tessuto epiteliale infiammato degli animali sarebbe più utile per valutare le influenze genetiche e molecolari sulla malattia. Tuttavia, abbiamo dimostrato che i cambiamenti epiteliali in vivo non sono necessariamente mantenuti nei colonoidi stabiliti da topi con infiammazione acuta. Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato un protocollo per trattare i colonoidi con un cocktail di mediatori infiammatori che sono tipicamente elevati durante l'IBD. Mentre questo sistema può essere applicato ovunque a varie condizioni di coltura, questo protocollo enfatizza il trattamento sia su colonoidi differenziati che su monostrati 2-dimensionali derivati da colonoidi stabiliti. In un ambiente di coltura tradizionale, i colonoidi sono arricchiti con cellule staminali intestinali, fornendo un ambiente ideale per studiare la nicchia delle cellule staminali. Tuttavia, questo sistema non consente un'analisi delle caratteristiche della fisiologia intestinale, come la funzione di barriera. Inoltre, i colonoidi tradizionali non offrono l'opportunità di studiare la risposta cellulare delle cellule epiteliali terminalmente differenziate agli stimoli proinfiammatori. I metodi qui presentati forniscono un quadro sperimentale alternativo per affrontare queste limitazioni. Il sistema di coltura monostrato 2-dimensionale offre anche un'opportunità per lo screening terapeutico dei farmaci ex vivo. Questo strato polarizzato di cellule può essere trattato con mediatori infiammatori sul lato basale della cellula e in concomitanza con terapie putative apicalmente per determinare la loro utilità nel trattamento dell'IBD.

Introduzione

La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica, remittente e recidivante caratterizzata da episodi di infiammazione e quiescenza clinica. L'eziologia dell'IBD è multifattoriale, ma le caratteristiche chiave della malattia includono la funzione barriera difettosa e l'aumento della permeabilità dell'epitelio intestinale, oltre alle cascate di segnalazione proinfiammatoria attivate all'interno del compartimento epiteliale ^1,2. Diversi modelli in vitro e in vivo sono stati utilizzati per ricapitolare la risposta epiteliale durante l'IBD, compresi i modelli di coltura cellulare....

Protocollo

Tutte le sperimentazioni che utilizzano tessuti murini qui descritti sono state approvate dall'Institutional Review Board dell'Università di Pittsburgh e condotte in conformità con le linee guida stabilite dall'Animal Research and Care Committee dell'Università di Pittsburgh e da UPMC.

1. Preparazione alla cultura

NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nella sezione Tabella dei materiali e tutte le composizioni della soluzione sono disponibili nella tabella di composizione della soluzione (Tabella 1).

1. Preparare il mezzo di lavaggio del topo come descritto....

Discussione

Lo sviluppo di organoidi ha rivoluzionato il modo in cui la comunità scientifica studia i sistemi di organi in vitro con la capacità di ricapitolare parzialmente la struttura e la funzione cellulare di un animale o di un essere umano in un piatto. Inoltre, i sistemi organoidi derivati da esseri umani con malattie offrono uno strumento promettente per la medicina personalizzata che potrebbe guidare il processo decisionale terapeutico. Qui, descriviamo un protocollo di isolamento della cripta che funziona bene e.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)