İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

Özet

3 boyutlu kolonoidlerin gelişimi için murin kolonik kriptlerinin izolasyonunu detaylandıran bir protokol açıklıyoruz. Yerleşik kolonoidler daha sonra, enflamatuar bir meydan okuma almadan veya bir epitelyal tek tabaka oluşturmaya yönlendirilmeden önce konakçı epitelinin hücresel bileşimini yansıtacak şekilde terminal olarak farklılaştırılabilir.

Özet

Bağırsak epiteli, insan sağlığında önemli bir rol oynar ve konakçı ile dış ortam arasında bir bariyer sağlar. Bu son derece dinamik hücre tabakası, mikrobiyal ve immün popülasyonlar arasındaki ilk savunma hattını sağlar ve bağırsak immün tepkisini modüle etmeye yardımcı olur. Epitel bariyerinin bozulması, inflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) ayırt edici özelliğidir ve terapötik hedefleme için ilgi çekicidir. 3 boyutlu kolonoid kültür sistemi, IBD patogenezinde bağırsak kök hücre dinamiği ve epitel hücre fizyolojisini incelemek için son derece yararlı bir in vitro modeldir. İdeal olarak, hayvanların iltihaplı epitel dokusundan kolonoidlerin oluşturulması, hastalık üzerindeki genetik ve moleküler etkilerin değerlendirilmesinde en faydalı olacaktır. Bununla birlikte, akut inflamasyonu olan farelerden oluşturulan kolonoidlerde in vivo epitelyal değişikliklerin mutlaka tutulmadığını gösterdik. Bu sınırlamayı ele almak için, kolonoidleri tipik olarak IBD sırasında yükselen bir inflamatuar mediatör kokteyli ile tedavi etmek için bir protokol geliştirdik. Bu sistem çeşitli kültür koşullarına her yerde uygulanabilirken, bu protokol hem farklılaşmış kolonoidler hem de yerleşik kolonoidlerden türetilen 2 boyutlu tek tabakalar üzerinde tedaviyi vurgular. Geleneksel bir kültür ortamında, kolonoidler bağırsak kök hücreleri ile zenginleştirilir ve kök hücre nişini incelemek için ideal bir ortam sağlar. Bununla birlikte, bu sistem, bariyer fonksiyonu gibi bağırsak fizyolojisinin özelliklerinin analizine izin vermez. Ayrıca, geleneksel kolonoidler, terminal olarak farklılaşmış epitel hücrelerinin proinflamatuar uyaranlara hücresel yanıtını inceleme fırsatı sunmaz. Burada sunulan yöntemler, bu sınırlamaları ele almak için alternatif bir deneysel çerçeve sağlar. 2 boyutlu tek katmanlı kültür sistemi, ex vivo terapötik ilaç taraması için de bir fırsat sunar. Bu polarize hücre tabakası, hücrenin bazal tarafında enflamatuar mediatörlerle ve IBD tedavisinde yararlılıklarını belirlemek için apikal olarak varsayılan terapötiklerle birlikte tedavi edilebilir.

Giriş

İnflamatuar barsak hastalığı (IBD), inflamasyon ve klinik sessizlik atakları ile karakterize kronik, remisyonlu ve tekrarlayan bir hastalıktır. İBH'nin etiyolojisi multifaktöriyeldir, ancak hastalığın temel karakteristik özellikleri arasında epitel bölmesinde aktive olan proinflamatuar sinyal kaskadlarına ek olarak kusurlu bariyer fonksiyonu ve bağırsak epitelinin artmış geçirgenliği yer alır ^1,2. IBD sırasında epitel yanıtını özetlemek için hücre kültürü ve inflamasyonun murin modelleri de dahil olmak üzere çeşitli in vitro ve in vivo modeller kullanılmıştır³. Bununla birlikte, tüm bu sistemlerin, İBH⁴ sırasındaki epitelyal değişiklikleri özetleme yeteneklerini sınırlayan önemli eksiklikleri vardır. IBD'yi incelemek için kullanılan hücre dizilerinin çoğu dönüştürülür, tek tabaka oluşturma yeteneğine sahiptir ve^3'ü ayırt edebilir, ancak konakçıdaki dönüştürülmemiş bağırsak epitel hücrelerinden farklı şekilde özünde yayılır. IBD'yi incelemek için birkaç farklı fare inflamasyon modeli kullanılır, bunlardan bazıları nakavt modelleri, enfeksiyöz modeller, kimyasal enflamatuar modeller ve T hücresi transfer modelleri^5,6,7,8'i içerir. Her biri IBD'nin genetik yatkınlıklar, bariyer disfonksiyonu, immün deregülasyon ve mikrobiyom gibi belirli etiyolojik yönlerini inceleyebilse de, hastalığın multifaktöriyel doğasını inceleme yetenekleri sınırlıdır.

Enteroidler ve kolonoidler de dahil olmak üzere bağırsak organoidleri, son on yılda, sadece bağırsak kök hücrelerinin dinamiklerini değil, aynı zamanda bağırsak epitelinin bariyer bütünlüğünü ve işlevini bağırsak homeostazı ve hastalığında oynadıkları rolü incelemek için yararlı bir in vitro model olarak kurulmuştur. Bu antiteler, İBH^9'un patogenezini anlamamıza önemli ölçüde katkıda bulunmuş ve kişiselleştirilmiş tıp için yeni fırsatlar açmıştır. Kolonoidler veya kolondan kök hücre türevi, kendi kendini organize eden doku kültürleri, bağırsak kriptlerinde bulunan kök hücrelerin süresiz olarak yayılmasına ve muhafaza edilmesine izin veren bir süreçte hem murin hem de insan dokusundan geliştirilmiştir¹⁰. Kök hücre nişi in vivo büyümesini desteklemek için hücre dışı faktörlere, özellikle kanonik Wnt sinyaline ve kemik-morfojenik protein sinyal yollarına^{dayanır 11}. Bu faktörlerin eklenmesi, kolonoidlerin sağlığını ve uzun ömürlülüğünü destekler, ancak aynı zamanda kültürü, hem kendi kendini yenileyen hem de terminal olarak farklılaşmış hücrelerden oluşan in vivo epitelyal hücresel mimariyi yansıtmayan kök hücre benzeri bir duruma doğru yönlendirir^12,13. Bağırsak epitelinin işlevselliği, kök hücre bölmesi ile farklılaşmış hücreler arasındaki sürekli karışmaya bağlı olsa da, bir kolonoid kültür sisteminde her ikisine de sahip olma yeteneği oldukça sınırlıdır. Bu sınırlamalara rağmen, organoid kültür sistemi, epitelin içsel özelliklerini ex vivo olarak incelemek için altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, eldeki bilimsel soruyu cevaplamak için alternatif kültür stratejilerinin düşünülmesi gerekebilir.

Sürekli 7 günlük bir dekstran sodyum sülfat (DSS) rejimindeki farelerin hem epitel iltihabı hem de bariyer disfonksiyonu geliştirdiği^{gösterilmiştir 14}. Ayrıca, insan IBD'sinde belirgin olduğu gösterilen mitokondriyal biyogenez yetmezliği ve bağırsak epitelinde metabolik yeniden programlama da bu DSS kolit¹⁵ modelinde yakalanmıştır. Bununla birlikte, ön verilerimiz, mitokondriyal biyogenez başarısızlığının özelliklerinin, DSS ile tedavi edilen hayvanların kriptlerinden türetilen kolonoidlerde korunmadığını göstermektedir (Ek Şekil 1). Bu nedenle, inflamasyonun murin bağırsak iltihabı sırasında epitel değişikliklerini nasıl yönlendirdiğini incelerken alternatif kültür yöntemleri kullanılmalıdır. Burada, 1) murin kolonoidlerinin kurulması için tüm kolon dokusundan kriptlerin nasıl izole edileceğini, 2) hücre popülasyonunu in vivo olarak yansıtmak için bu hücre popülasyonunun terminal olarak nasıl ayırt edileceğini ve 3) bu in vitro modelde inflamasyonun nasıl indükleneceğini açıklayan bir protokolü özetliyoruz. İltihaplı epitel içindeki ilaç etkileşimlerini incelemek için, temel olarak inflamatuar mediatörlerle tedavi edilebilen ve ilaç tedavileri ile apikal olarak tedavi edilebilen murin kolonoidlerinden 2-dimensonal (2D) tek tabakalar oluşturmak için bir protokol geliştirdik.

Protokol

Burada açıklanan fare dokuları kullanılarak yapılan tüm deneyler, Pittsburgh Üniversitesi'ndeki Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı ve Pittsburgh Üniversitesi'ndeki Hayvan Araştırma ve Bakım Komitesi ve UPMC tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak yürütüldü.

1. Kültür için hazırlık

NOT: Tüm reaktifler Malzeme Tablosu bölümünde listelenmiştir ve tüm çözelti bileşimleri çözelti bileşimi tablosunda bulunabilir (Tablo 1).

1. Fare yıkama ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. 4°C'de 2 aya kadar saklayın.
2. Tablo 1'de açıklandığı gibi crypt izolasyon arabelleği 1'i (CIB1) hazırlayın. 4°C'de 2 aya kadar saklayın.
   DİKKAT: Ditiyotreitol (DTT), yutulduğunda potansiyel akut toksisite ve bu alanlara maruz kalırsa cilt ve göz hasarı nedeniyle OSHA Tehlike İletişim Standardı tarafından tehlikeli olarak kabul edilir. Bu kimyasalla çalışırken koruyucu eldiven, göz koruması ve yüz koruması kullanılmalıdır.
3. Tablo 1'de açıklandığı gibi crypt izolasyon arabelleği 2'yi (CIB2) hazırlayın. 4°C'de 2 aya kadar saklayın.
4. L-WRN koşullu ortamı daha önce yayınlanmış bir protokole^{göre hazırlayın 16}.
5. Tablo 1'de tarif edildiği gibi tam kolonoid ortamı hazırlayın. Tam kolonoid büyüme ortamı, aktivite kaybı olmadan 4 ° C'de 5 güne kadar saklanabilir.
6. Farklılaşma ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Bu protokol daha önce yayınlanmış bir makaleden^{değiştirilmiştir 17}. Farklılaşma ortamı, aktivite kaybı olmadan 4°C'de 5 güne kadar saklanabilir.
7. Enflamasyon aracı ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Bu protokol daha önce yayınlanmış bir makaleden^{değiştirilmiştir 18}. Enflamasyon aracı ortamı, aktivite kaybı olmadan 4 ° C'de 5 güne kadar saklanabilir.
8. Murin tek katmanlı ortamı hazırlayın. Tek katmanlara enflamatuar faktörler ve/veya ilaç(lar) ile meydan okurken Y-27632'yi atlayın. Murin tek katmanlı besiyeri, aktivite kaybı olmadan 4°C'de 5 güne kadar saklanabilir.
9. Enflamasyon aracı tek tabakalı ortamı hazırlayın. Enflamasyon aracısı tek tabakalı ortam, aktivite kaybı olmadan 4 ° C'de 5 güne kadar saklanabilir.

2. Murin kolon dokusundan kript izolasyonu

NOT: Dokuyu buz üzerine aktarın. Uygun miktarda bazal membran matrisini −20°C'lik depodan çıkarın ve buz üzerinde çözdürün. Her 24 oyuk, 15 μL bazal membran matrisi ile kaplanmıştır. Bölüm 1'de açıklandığı gibi CIB1, CIB2 ve tam kolonoid büyüme ortamını hazırlayın.

1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokole göre bir C57BL / 6J fareyi (6-8 haftalık) ötenazi yapın ve temiz cımbız ve makas kullanarak kolonun distal ucunu (yaklaşık 5-7 cm) çıkarın.
   NOT: Bu çalışmada, deneklere 2-3 dakika karbondioksit odası inkübasyonu ve ardından servikal çıkık kullanılarak ötenazi uygulandı.
   1. Bunun için fareyi sırt üstü yatırın, göğüs kafesinin hemen altına yatay bir kesi yapın ve ardından karın boşluğunu ortaya çıkarmak için yatay kesiğin ortasından kuyruğun tabanına doğru dikey bir kesi yapın.
   2. Cımbızla ince bağırsağı alandan çıkarın, kolonu tanımlayın ve kuyruğun tabanına kadar takip edin. Gerekirse distal kolonu tamamen ortaya çıkarmak için pelvisi makasla kırın. Kolonun en distal 5-7 cm'sini kesmek için makası kullanın.
2. Kolon dokusunu temiz bir yüzeye yerleştirin. Kolonu çevreleyen fazla serozal yağı çıkarın. 18 G 1 1/2 iğneye bağlı bir şırınga kullanarak kolonun lümen içeriğini Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile yıkayarak dışkı maddesini çıkarın. Ardından, kolonu 10 mL buz gibi soğuk DPBS içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin.
   NOT: Kolonu birden fazla hayvandan izole ediyorsanız, bir sonraki hayvana devam etmeden önce dokuyu buzun üzerine yerleştirin.
3. Kolon dokusunu 10 mL buz gibi soğuk DPBS içeren bir Petri kabına aktarın ve bir P1.000 pipet kullanarak lümeni DPBS ile iki kez sulayın.
4. Kolonu makas kullanarak uzunlamasına açın ve kalan dışkı içeriğini çıkarmak için DPBS'de ~30 saniye boyunca cımbız kullanarak hafifçe sallayın.
5. Dokuyu 10 mL buz gibi soğuk DPBS içeren yeni bir Petri kabına aktarın ve kolonu makas kullanarak 2 cm'lik parçalara ayırmadan ve 7 mL buz gibi soğuk CIB1 ile 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirmeden önce cımbız kullanarak tekrar hafifçe çalkalayın. CIB1'deki dokuyu 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: Kalan adımlar biyolojik bir güvenlik kabini içinde gerçekleştirilir.
6. Dokuyu cımbız kullanarak 7 mL CIB2 içeren önceden ısıtılmış 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin.
7. Dokunun konik tüpün dibine yerleşmesine izin vererek ve ardından CIB2'yi pipetleyerek CIB2'yi 50 mL'lik konik tüpten çıkarın. Ardından, aynı konik tüpe 10 mL buz gibi soğuk fare yıkama ortamı ekleyin.
8. Yeni bir 50 mL konik tüp alın ve açık tüpün üzerine 70 μm'lik bir filtre yerleştirin.
9. Tüpü kolon içeriği ile tutarken, elinizi yaklaşık 45° döndürün. Kriptoları serbest bırakmak için tüpü 45 saniye boyunca sallanan ve kuvvetli bir şekilde sallayın. Ardından, kript süspansiyonunu 70 μm hücre süzgecinden 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dökün.
10. Cımbız kullanarak, kolon dokusunu boş 50 mL konik tüpe geri yerleştirin ve 10 mL buz gibi soğuk fare yıkama ortamı ekleyin. Yeni bir 70 μm hücre süzgeci edinin ve önceki filtrelenmiş çözeltiyi içeren 50 mL'lik konik tüpün üzerine yerleştirin.
11. Yine, kript parçalarını içeren 50 mL'lik tüpü alın ve adım 2.9'daki gibi sallayın. Ortamı 70 μm hücre süzgecinden geçirerek 50 mL'lik konik tüpe süzün ve daha önce filtrelenmiş kriptlerle birleştirin.
    NOT: Kript verimi düşükse, dokuyu 10 mL fare yıkama ortamı ile boş bir 50 mL konik tüpe yerleştirerek kolon dokusunu bir süre daha sallayın. Kriptoları serbest bırakmak için dokuyu 45-50 saniye sallayın. Ayrıca, kript verimi düşükse, sallamanın gücünü arttırın. Son olarak, genel kript verimi düşükse, dokunun plastiğe yapışmasını önlemek için hem pipetler hem de tüpler fetal sığır serumu (FBS) ile kaplanabilir.
12. Filtrelenmiş kriptleri içeren 50 mL'lik konik tüpü 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    NOT: 50 mL konik tüpün dibinde bir pelet gözlenmelidir.
13. Pipetleme yoluyla ortamı boşaltın, 10 mL buz gibi soğuk fare yıkama ortamıyla yukarı ve aşağı pipetleyerek kriptleri yeniden süspanse edin ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
14. Daha temiz bir preparat elde etmek için, kriptleri ek 10 mL fare yıkama ortamıyla yıkayın. Önceki ortamı boşaltın ve 10 mL fare yıkama ortamında yukarı ve aşağı pipetleyerek kriptleri yeniden süspanse edin. 15 mL'lik bir konik tüp kullanarak 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Ortamı pipetlerken dikkatli olunmalıdır çünkü bazen pelet sıkıca santrifüjlenmez. Pelet sıkı değilse, 500 μL ila 1 mL bırakarak ortamın çoğunu pipetleyin. Ardından, 10 mL fare yıkama ortamında pipetleyerek peleti yeniden süspanse edin ve solüsyonu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Daha küçük bir konik tüpte santrifüjleme, peletin sıkılığını artırabilir.
15. Ortamı boşaltın ve 10 mL buz gibi soğuk fare yıkama ortamıyla yukarı ve aşağı pipetleyerek kriptoları yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alındıktan sonra, ortamın 10 μL'sini hemen bir cam slayt üzerine pipetleyerek kriptleri parlak alan mikroskobu altında sayın.
    1. Slaytın ayrı uçlarına iki adet 10 μL'lik damla yerleştirin ve her damlacıktaki kript sayısını sayın. 10 μL başına kript sayısını belirlemek için iki damla arasındaki sayıların ortalamasını alın. 100 mL'deki kript sayısını elde etmek için bu sayıyı 1 ile çarpın.
       NOT: Doğru sayım için, yeniden süspansiyondan hemen sonra 10 μL kript süspansiyonu çıkarılmalıdır. Aksi takdirde, kriptler tüpün dibine düşecek ve bu da yanlış bir sayıma neden olacaktır.
16. Kuyucuk başına 300-500 kript kaplama hedefiyle, fare yıkama ortamında yeniden süspanse edilen uygun hacimdeki kriptleri yeni bir 15 mL'lik konik tüpe aktarın ve buz gibi soğuk fare yıkama ortamıyla 10 mL'ye getirin. Tüpü 300 x g'da 5 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Tüpün dibinde küçük bir pelet görünmelidir.
17. Süpernatanı bir elektrikli pipetle çıkarın. Kalan ortamı dikkatlice çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın ve geriye yalnızca pelet bırakın.
18. Pelet, uygun miktarda buz gibi bazal membran matrisinde yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Kript peletini yeniden askıya alırken kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Plaka 300-500 kript / 15 μL bazal membran matrisi bir plakanın her kuyucuğunda. Kaplamadan sonra, doku kültürü plakasını ters çevirin ve 10-20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre koyun.
19. Plakayı geri çevirin ve her bir oyuğa 500 μL tam fare kolonoid ortamı ekleyin. Ortamı geçmeye hazır olana kadar her gün değiştirin. Kolonları her 3-5 günde bir geçirin.

3. Kolonların geçirilmesi

NOT: Her kuyu genellikle orijinal kuyunun yoğunluğuna göre 1:4 ila 1:6 arasında geçilebilir. Uygun miktarda bazal membran matrisini −20°C'den çıkarın ve çözülmesi için buzun üzerine koyun. Kolonoidler iki geçişten sonra deneyler için kullanılabilir. Kolonoidleri geçirirken, kontaminasyonu önlemek için adımlar biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.

1. Ortamı geçilecek kuyulardan çıkarın.
   1. Bazal membran matrisi içinde, ilk izolasyon sırasında meydana gelebilecek kalıntılar varsa, kalıntıları temizlemek için aşağıdaki protokol kullanılabilir:
      1. Her bir oyuğa Ca²⁺ veya Mg²⁺ olmadan DPBS'de 1 mL buz gibi% 0.1 sığır serum albümini (BSA) ekleyin. Biyolojik güvenlik kabininde 5 dakika bekletin.
      2. Bazal membran matrisini bozmak için bir P1000 pipet kullanarak üç ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve kuyucukların içeriğini 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Kolonoidleri Ca 2 + veya Mg^{2 +} olmadan DPBS'de toplam 5-10 mL% 0.1 BSA'da santrifüjleyin. % 0.1 BSA ile uygun hacme kadar yapın.
      3. Kolonoidleri peletlemek için 150 x g'da 4 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin, ancak döküntüleri değil.
      4. DPBS'yi pipetleyerek boşaltın ve peleti bırakın. 1 mL oda sıcaklığında (RT) enzimatik ayrışma reaktifi ekleyin ve üç ila beş kez pipetleyin.
      5. 15 mL'lik konik tüpü enzimatik ayrışma reaktifi ve bozulmuş kolonoidlerle birlikte 37 ° C'lik bir su banyosunda 3-4 dakika yerleştirin.
      6. Tüpü su banyosundan çıkarın, 3-5 kez pipetleyin ve ardından fare yıkama ortamıyla 10 mL'ye getirin. Adım 3.6'ya geçin.
2. Her oyuğa 500 μL RT enzimatik ayrışma reaktifi yerleştirin ve bazal membran matrisini bozmak için üç ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetlemeden önce yaklaşık 1 dakika bekletin.
3. Plakayı 37 ° C'lik bir inkübatöre 3-4 dakika yerleştirin.
4. Plakayı inkübatörden çıkarın ve kolonoidleri ayırmak için bir P1000 pipeti kullanarak üç ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
5. İçeriği 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve buz gibi soğuk fare yıkama ortamıyla 10 mL'ye kadar hazırlayın.
6. Numuneyi 300 x g'da 5°C'de 4 dakika santrifüjleyin.
7. Konik tüpte yalnızca bir pelet kalacak şekilde gerektiğinde bir elektrikli pipet ve bir P200 pipeti kullanarak ortamı çıkarın.
8. Uygun miktarda buz gibi soğuk bazal membran matrisinde, kaç kuyu kaplanacağına göre hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Pipetleme sırasında kabarcık oluşturmayın. Kolonoid fragmanlarını oyuk başına 15 μL bazal membran matris damlasına yerleştirin.
9. Kriptleri kaplayın, doku kültürü plakasını ters çevirin ve ardından plakayı 10-20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
10. Son olarak, plakayı ters çevirin ve her bir oyuğa 500 μL tam fare kolonoid ortamı ekleyin. Ortamı, yaklaşık 3-5 gün içinde tekrar geçilebilecek kadar büyüyene kadar her gün değiştirin.

4. Kolonoid hücrelerin terminal olarak farklılaşması

1. Kolonoidleri yukarıdaki gibi geçirin ve her bir oyuğa 500 μL tam fare kolonoid ortamı ekleyin.
2. Geçişten en az 48 saat sonra, fare kolonoid ortamının tamamını çıkarın ve her bir oyuğa 500 μL farklılaştırıcı ortam ekleyin (bkz. bölüm 1).
3. Kolonları farklılaşma ortamı ile 48 saat inkübe edin, daha sonra RNA ve protein toplanması da dahil olmak üzere deneylerde kullanılabilirler.
   NOT: Kolonoidler, RNA toplanarak ve kantitatif ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yoluyla sırasıyla bir kök hücre belirteci ve hücre proliferasyon belirteci olan Lgr5 ve Ki67'nin ekspresyonunu değerlendirerek farklılaşma açısından değerlendirilebilir. Terminal olarak farklılaşmış hücreler, hücrelerin daha kök benzeri olduğu geleneksel kolonoid ortamda yetiştirilen kolonoidlere kıyasla nispeten düşük bir Lgr5 ve Ki67 ekspresyonuna sahip olmalıdır. Kolonoidlerin farklılaşma ortamında inkübe edilmesi gereken sürenin her bir laboratuvar için optimize edilmesi gerekebilir. Primerlerin listesi için Ek Tablo 1'e bakın.

5. İnflamatuar mediatörlerle farklılaşmış kolonoidlerde inflamasyonun indüklenmesi

1. Kolonoidler farklılaşma ortamı ile 2-3 gün inkübe edildikten sonra, mevcut ortamı çıkarın ve her bir oyuğa 500 μL inflamasyon aracı ortamı ekleyin.
2. RNA ve proteini toplamadan (veya diğer aşağı akış parametrelerini değerlendirmeden) önce kuyucukların 24-72 saat inkübe etmesine izin verin. Ortamı her gün değiştirin.

6. Yerleşik murin kolonoidlerinden türetilen bağırsak epitelyal tek tabakaları

NOT: Murin bağırsak epitelyal tek katmanları, en az iki kez geçen murin kolonoidlerinden türetilir. 3-5 gün içinde başarılı bir tek tabaka oluşumuna izin vermek için, kolonoidleri tek hücrelere ayırmamak zorunludur. Enzimatik olarak hücresel kümelere ayrışmış parçalanmış organoidler büyüme için idealdir.

1. Deneye başlamadan önce tüm reaktifleri hazırlayın. Bazal membran matrisini buz üzerinde çözün. Murin tek katmanlı ortamını bölüm 1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Çözülmüş bazal membranı 1:20 oranında soğuk murin tek katmanlı ortam ile seyreltin. Buzda kal.
2. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının tek bir oyuğuna 0,4 μm şeffaf hücre kültürü eki yerleştirmek için steril forseps kullanın (Malzeme Tablosu). Ek parçanın bir köşe ucunu tutun ve kuyuya aktarın. Kültür için uygun sayıda hücre kültürü eki mevcut olana kadar tekrarlayın.
   NOT: Ek bir kontrol kuyusunu yalnızca bazal membran matrisi ile kapladığınızdan emin olun. Bu hücre kültürü eki, sonraki adımda (adım 6.3) açıklandığı gibi, hücreler olmadan hücre kültürü ekinin arka plan direncini ölçmek için kullanılacaktır.
3. Bir P200 pipeti kullanarak, her bir hücre kültürü ekinin apikal (üst) yüzeyini 150 μL seyreltilmiş bazal membran matrisi ile kaplayın. Pipet ucunu, uçun membranına dokunmadan ekin ortasına yerleştirin ve çözeltiyi nazikçe dışarı atın. Plakayı en az 1 saat boyunca% 5 CO₂ içeren steril bir 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
4. Kullanmadan önce bazal membran matrisini nazikçe çıkarın ve hücre kültürü eklerinin en az 10 dakika biyolojik güvenlik kabininde kurumasını bekleyin.
   1. Bazal membran matrisini çıkarmak için 24 oyuklu plakayı 45° açıyla döndürün. Ucu sabitlemek için tek parmağınızı çatalın köşesine yerleştirin ve bir P200 pipet kullanarak pipet ucunu ucun alt tarafına yavaşça yerleştirin ve matrisi çıkarın.
   2. Her bir hücre kültürü ekini Ca²⁺ veya Mg²⁺ içermeyen 150 μL steril DPBS ile yıkayarak fazla kalıntıları giderin.
5. 10 dakika kuruduktan sonra, hücre kültürü ekinin altına 400 μL murin tek tabakalı ortam ve üstüne 75 μL ekleyin. Tüm hücre kültürü ekleri daldırılana kadar tekrarlayın. Plakayı biyolojik güvenlik kabininde bırakın veya ihtiyaç duyulana kadar inkübatöre geri koyun.
6. 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatörden 24 oyuklu olgun (büyümenin 5-5. gününde organoidler) bağırsak kolonoidleri plakasını çıkarın ve biyolojik güvenlik kabininin altına yerleştirin. Steril uçlar kullanarak ortamı çıkarın ve her birini 1 mL RT steril DPBS (Ca 2 + veya Mg^{2 +} olmadan) ile iyice yıkayın.
   NOT: 75-125 olgun kolonoidden oluşan tek bir kuyu 1:4 oranında bölünür.
7. Steril uçlar kullanarak^Ca2 + veya Mg²⁺ içermeyen DPBS'yi çıkarın ve geçilecek her oyuğa 500 μL RT enzimatik ayrışma reaktifi yerleştirerek bazal membran matrisinin her bir tapasını sindirin.
8. Fişi kırmak için her birini yaklaşık 6-10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Fişi çıkarmak için plakanın altını çizmeyin. Bunun yerine, 24 oyuklu plakayı 45°'lik bir açıyla döndürün, pipetin ucunu tapanın kenarına yerleştirin ve yavaşça yerinden çıkarın.
9. 24 oyuklu plakayı 3-4 dakika boyunca steril bir 37 ° C,% 5_CO2 inkübatöre geri yerleştirin.
10. Plakayı çıkarın ve enzimatik ayrışma reaktifini biyolojik bir güvenlik kabini altındaki her kuyucuk için beş ila yedi kez yukarı ve aşağı pipetleyin. İlişkisiz kolonoidleri her bir kuyucuktan steril, 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Buz gibi soğuk fare yıkama ortamı ile 10 mL'lik bir hacme kadar getirin.
11. Kısmen sindirilmiş kolonoidleri 300 x g'de 4°C'de 5 dakika boyunca sallanan bir kova santrifüjünde santrifüjleyin.
12. Biyolojik güvenlik kabininin altında, 10 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı peletten çıkarın. Kalan ortamı bir P200 pipeti kullanarak çıkarın. Kolonoid peletini murin tek tabakalı ortamda yeniden süspanse edin. Kaplanacak parçalanmış kolonoidlerin her hücre kültürü eki başına 75 μL ortam ekleyin.
13. Her hücre kültürü ekinin merkezine 75 μL kolonoid süspansiyon ekleyin. Her bir oyuğa kolonoid süspansiyonu eklemeden önce, 75 μL'yi çıkarmadan önce bir veya iki kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin, bu da daha homojen bir kaplama sağlar.
14. Hücre kültürü eki boyunca homojen dağılıma izin vermek için hücre kültürü eklerine sahip 24 oyuklu plakayı 10 dakika boyunca dönen bir platforma yerleştirin.
15. Plakayı steril 37°C, %5_CO2 inkübatöre yerleştirin.
16. Ertesi gün (Gün 1), ortamı bir P200 pipeti ile üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleyerek bağlanmamış kolonoid parçalarını yerinden çıkarın. Bağlı bağırsak hücrelerini bozmamak için ucu yavaşça hücre kültürü ekinin iç kısmına yerleştirin. Ortama kabarcıklar sokmayın, çünkü bu, bağlanmamış tüm parçaların çıkarılmasını önler.
17. Ortam ve kolonoid karışımını hemen çıkarın. Tüm hücre kültürü ekleri temizlenene kadar tekrarlayın.
18. Her bir hücre kültürü ekinin apikal tarafına yavaşça 150 μL önceden ısıtılmış murin tek tabakalı ortam ekleyin. Yeni bir 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 400 μL ısıtılmış murin tek tabakalı ortam ekleyin. Steril forseps kullanarak çatalını tutarak hücre kültürü ekini yeni plakaya aktarın. Ortamı izdiham oluşana kadar her gün değiştirin.
    NOT: Kolonoid fragmanları, kaplamadan 3-5 gün sonra birleşik bir tek tabaka oluşturmalıdır.

7. Tek tabakalı kültürün 3 - 5. günlerinde bir voltohmmetre kullanarak epitelyal tek tabakaların net direncinin ölçülmesi

NOT: Çubuk elektrotları forsepslere benzer ve asimetrik uzunluktadır. Probun uzun kolu bazolateral elektrottur ve daha kısa kolu apikal elektrottur. Probun, hücre kültürü ekinin içi ve dışı arasına yerleştirilmesi zor olabilir. Probun yerleştirildikten sonra hafif bir açıyla yerleştirilmesi ve ardından probun dikey olarak doğrultulması, probun sıkışmasını önleyecektir. Değerleri etkileyebileceğinden, her bir hücre kültürü ekinin net direncini benzer bir açıyla okuduğunuzdan emin olun.

1. Voltohmmetreyi ve tüm reaktifleri biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin.
   1. Voltohmmetreyi en yakın AC prizine takın ve elektrot probunun plastik modüler konektörünü ön ekrandaki GİRİŞ jakına takın.
   2. Voltohmmetreyi 45° açıyla yerleştirmek için, ekipmanın arka tarafındaki metal kolu yerine kilitlenene kadar dışarı doğru çevirin.
   3. Şimdi, ön ekrandaki güç anahtarını YUKARI çevirerek voltohmmetreyi açın. Son olarak, bu metrikteki okumayı görüntülemek için anahtarı OHMS'ye doğru çevirin.
2. 24 oyuklu plakayı 37°C, %5_CO2 inkübatörden çıkarın ve plakayı biyolojik güvenlik kabinine düz bir şekilde yerleştirin. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) sıcaklığa duyarlıdır. Plakayı yalnızca TEER okunmadan hemen önce çıkarın.
3. Elektrot probunu önceden ısıtılmış %70 etanol içinde 30 s ila 1 dakika arasında sterilize edin. Probu çıkarın, ters çevirin ve fazla etanolü çıkarmak için bir ila iki kez hafifçe vurun. Probun yaklaşık 30 saniye kurumasını bekleyin.
4. Prob üzerinde kalan etanolü önceden ısıtılmış fare yıkama ortamıyla yıkayın.
   DİKKAT: Prob üzerinde daha yüksekte kalan etanol damlacıklarının hücre kültürü ekine düşmesine izin vermeyin. Etanolü ortamla yıkarken, ortamın steril etanol alanının üzerine çıkmasına izin vermeyin. Bu, kontamine ortamın hücre kültürü ekine girmesine neden olabilir.
5. Probu hücre kültürü ekine dik tutun. Bazolateral elektrodu (probun daha uzun ucu) 24 oyuklu plakanın tabanına değene kadar hücre kültürü ekinin dışına yerleştirin. Apikal elektrodu (probun kısa ucu) hücre kültürü ekine kaydırın. İki elektrotun mesafesini kuyudan kuyuya değiştirmeyin. Bu, TEER ölçümünü etkileyecektir.
6. TEER'i okumadan önce apikal elektrotun hücre kültürü ekinin tabanına temas etmediğini doğrulayın. Arka plan denetimi hücre kültürü ekiyle başlayın ve değeri kaydedin. Değer, voltohmmetrenin ön tarafında otomatik olarak dijital olarak görüntülenecektir.
7. Her hücre kültürü eki için 7.5-7.6 arasındaki adımları yineleyin.
   NOT: Hücre kültürü ekleri arasında farklı deney koşulları varsa, probu her yeni koşul arasında sterilize edin. Adım 7.1'den başlayın ve adımlarda sayısal olarak ilerleyin.
8. Tüm TEER ölçümleri kaydedildikten sonra 24 oyuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin.
9. 350 Ω veya daha yüksek net değerler, tek tabaka oluşumunun göstergesidir. Tek tabaka oluşumu sağlanana kadar sonraki günlerde tekrarlayın.
   NOT: Genel olarak, 3. günde 1.000 Ω veya daha büyük değerler yakalanabilir, ancak zamanla hepsi 350 Ω civarında daha düşük bir sayıya yakınsayacaktır.

8. Voltohmmetreden net direnç ölçümlerini kullanarak TEER'in hesaplanması

NOT: Kolonoidlerin başarılı tek tabaka oluşumu, 115 Ω ·^cm2'den büyük TEER ölçümleri verecektir.

1. Bireysel net direnç değerlerini alın ve net direnci arka plandan çıkarın. Bazal matris membranı ile kaplanmış hücre kültürü ekleri, yaklaşık 100 Ω'lik bir net okuma verecektir.
2. Arka plandan çıkarılan net direnç ölçümlerini alın ve bunları hücre kültürü ekinin yüzey alanıyla çarpın. 24 oyuklu bir hücre kültürü eki, 0.33^cm2'lik bir yüzey alanına sahiptir.
3. Değerler 115 Ω ·^cm2 veya daha büyükse, aşağı akış deneysel tahlillerine geçin.

9. Enflamatuar mediatörler ile epitelyal tek tabakalarda inflamasyonun indüklenmesi

1. Başarılı tek tabakalar oluştuktan sonra, kültürün bazal tarafındaki kültüre inflamatuar mediatörler ekleyin. Adım 1.9'da açıklandığı gibi inflamasyon aracısı tek tabakalı ortamı hazırlayın ve yeni bir 24 oyuklu plakada her bir oyuğa 400 μL ekleyin.
2. Ortamı hücre kültürü ekinin apikal tarafından çıkarın ve Y-27632 olmadan 150 μL murin tek katmanlı ortam ekleyin. Bu tarafı enflamatuar mediatörlerle takviye etmeyin. Bununla birlikte, hücre ölümü aşırı görünüyorsa, Y-27632'yi medyada bırakın. Bu, son kullanıcı tarafından belirlenmelidir.
3. Hücre kültürü eklerini yeni bir 24 oyuklu plakaya aktarın ve bunları inflamasyon aracısı tek tabakalı ortam ile desteklenmiş kuyucuklara yerleştirin.
4. Deneye bağlı olarak, tek katmanları 24-72 saat boyunca enflamatuar mediatörlerle uyarın.
5. Bu enflamatuar modeli kullanarak ilaç yanıtlarını test etmek için, hücre kültürü ekinin apikal tarafındaki tek katmanlı ortamı tercih edilen ilaçla destekleyin. İlaç, ilacın etki mekanizmasına ve değerlendirilecek aşağı akış parametrelerine bağlı olarak deneyin herhangi bir noktasında eklenebilir.

Sonuçlar

3D bağırsak kolonoid kültür sistemi, epitelin bağırsak mukozal homeostazına içsel katkısını incelemek için paha biçilmez bir araçtır. Açıklanan protokol, 8 haftalıkken C57BL/6J (WT) farelerinden kriptlerin nasıl izole edileceğine ve birden fazla aşağı akış uygulaması için manipüle edilebilen uzun vadeli bir kolonoid kültür sisteminin nasıl kurulacağına dair ayrıntılı talimatlar sağlar. Bazal membran matrisindeki kriptlerin izolasyonu ve kaplanması üzerine, kriptler parlak alan mikro...

Tartışmalar

Organoid gelişimi, bilimsel topluluğun organ sistemlerini in vitro olarak inceleme biçiminde devrim yarattı ve hücresel yapıyı ve işlevi bir tabaktaki bir hayvandan veya insandan kısmen özetleme yeteneği ile değiştirdi. Ayrıca, hastalıkları olan insanlardan elde edilen organoid sistemler, terapötik karar verme sürecine rehberlik edebilecek kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir araç sunmaktadır. Burada, iyi çalışan bir kript izolasyon protokolünü açıklıyoruz ve kaplamadan ö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)