Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

Resumo

Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.

Resumo

O epitélio intestinal desempenha um papel essencial na saúde humana, fornecendo uma barreira entre o hospedeiro e o meio externo. Esta camada celular altamente dinâmica fornece a primeira linha de defesa entre as populações microbiana e imune e ajuda a modular a resposta imune intestinal. A ruptura da barreira epitelial é uma característica da doença inflamatória intestinal (DII) e é de interesse para direcionamento terapêutico. O sistema de cultura colonóide tridimensional é um modelo in vitro extremamente útil para o estudo da dinâmica das células-tronco intestinais e da fisiologia das células epiteliais na patogênese das DII. Idealmente, o estabelecimento de colonoides a partir do tecido epitelial inflamado de animais seria mais benéfico na avaliação das influências genéticas e moleculares na doença. No entanto, mostramos que alterações epiteliais in vivo não são necessariamente retidas em colonoides estabelecidos em camundongos com inflamação aguda. Para abordar essa limitação, desenvolvemos um protocolo para tratar colonoides com um coquetel de mediadores inflamatórios que são tipicamente elevados durante a DII. Embora este sistema possa ser aplicado de forma ubíqua a várias condições de cultura, este protocolo enfatiza o tratamento tanto em colonóides diferenciados quanto em monocamadas bidimensionais derivadas de colonoides estabelecidos. Em um ambiente de cultura tradicional, os colonoides são enriquecidos com células-tronco intestinais, proporcionando um ambiente ideal para estudar o nicho de células-tronco. No entanto, esse sistema não permite uma análise das características da fisiologia intestinal, como a função de barreira. Além disso, os colonoides tradicionais não oferecem a oportunidade de estudar a resposta celular de células epiteliais terminalmente diferenciadas a estímulos pró-inflamatórios. Os métodos aqui apresentados fornecem uma estrutura experimental alternativa para abordar essas limitações. O sistema de cultura monocamada bidimensional 2-dimensional também oferece uma oportunidade para triagem terapêutica ex vivo. Esta camada polarizada de células pode ser tratada com mediadores inflamatórios na face basal da célula e concomitantemente com terapêutica putativa apicamente para determinar sua utilidade no tratamento da DII.

Introdução

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica, remitente, recidivante, caracterizada por episódios de inflamação e quiescência clínica. A etiologia das DII é multifatorial, mas as principais características da doença incluem função de barreira defeituosa e aumento da permeabilidade do epitélio intestinal, além de cascatas de sinalização pró-inflamatórias ativadas dentro do compartimento^epitelial1,2. Vários modelos in vitro e in vivo têm sido utilizados para recapitular a resposta epitelial durante a DII, incluindo cultura celular e modelos murinos de^{inflamação3....}

Protocolo

Toda a experimentação com tecidos murinos aqui descrita foi aprovada pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade de Pittsburgh e conduzida de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Pesquisa e Cuidado Animal da Universidade de Pittsburgh e UPMC.

1. Preparação para a cultura

NOTA: Todos os reagentes estão listados na seção Tabela de materiais e todas as composições de solução podem ser encontradas na tabela de composição da solução (Tabela 1).

1. Preparar o meio de lavagem do rato, conforme descrito na Tabela 1. Conse....

Discussão

O desenvolvimento de organoides revolucionou a forma como a comunidade científica estuda sistemas orgânicos in vitro com a capacidade de recapitular parcialmente a estrutura e a função celular de um animal ou humano em um prato. Além disso, sistemas organoides derivados de humanos com doenças oferecem uma ferramenta promissora para a medicina personalizada que pode orientar a tomada de decisões terapêuticas. Aqui, descrevemos um protocolo de isolamento de cripta que funciona bem e introduz etapas importa.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)