Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

Resumo

Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.

Resumo

O epitélio intestinal desempenha um papel essencial na saúde humana, fornecendo uma barreira entre o hospedeiro e o meio externo. Esta camada celular altamente dinâmica fornece a primeira linha de defesa entre as populações microbiana e imune e ajuda a modular a resposta imune intestinal. A ruptura da barreira epitelial é uma característica da doença inflamatória intestinal (DII) e é de interesse para direcionamento terapêutico. O sistema de cultura colonóide tridimensional é um modelo in vitro extremamente útil para o estudo da dinâmica das células-tronco intestinais e da fisiologia das células epiteliais na patogênese das DII. Idealmente, o estabelecimento de colonoides a partir do tecido epitelial inflamado de animais seria mais benéfico na avaliação das influências genéticas e moleculares na doença. No entanto, mostramos que alterações epiteliais in vivo não são necessariamente retidas em colonoides estabelecidos em camundongos com inflamação aguda. Para abordar essa limitação, desenvolvemos um protocolo para tratar colonoides com um coquetel de mediadores inflamatórios que são tipicamente elevados durante a DII. Embora este sistema possa ser aplicado de forma ubíqua a várias condições de cultura, este protocolo enfatiza o tratamento tanto em colonóides diferenciados quanto em monocamadas bidimensionais derivadas de colonoides estabelecidos. Em um ambiente de cultura tradicional, os colonoides são enriquecidos com células-tronco intestinais, proporcionando um ambiente ideal para estudar o nicho de células-tronco. No entanto, esse sistema não permite uma análise das características da fisiologia intestinal, como a função de barreira. Além disso, os colonoides tradicionais não oferecem a oportunidade de estudar a resposta celular de células epiteliais terminalmente diferenciadas a estímulos pró-inflamatórios. Os métodos aqui apresentados fornecem uma estrutura experimental alternativa para abordar essas limitações. O sistema de cultura monocamada bidimensional 2-dimensional também oferece uma oportunidade para triagem terapêutica ex vivo. Esta camada polarizada de células pode ser tratada com mediadores inflamatórios na face basal da célula e concomitantemente com terapêutica putativa apicamente para determinar sua utilidade no tratamento da DII.

Introdução

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica, remitente, recidivante, caracterizada por episódios de inflamação e quiescência clínica. A etiologia das DII é multifatorial, mas as principais características da doença incluem função de barreira defeituosa e aumento da permeabilidade do epitélio intestinal, além de cascatas de sinalização pró-inflamatórias ativadas dentro do compartimento^epitelial1,2. Vários modelos in vitro e in vivo têm sido utilizados para recapitular a resposta epitelial durante a DII, incluindo cultura celular e modelos murinos de^{inflamação3}. No entanto, todos esses sistemas apresentam deficiências importantes que limitam sua capacidade de recapitular as alterações epiteliais durante a^DII4. A maioria das linhagens celulares usadas para estudar a DII são transformadas, têm a capacidade de formar uma monocamada e podem diferenciar³, mas intrinsecamente se propagam de forma diferente das células epiteliais intestinais não transformadas no hospedeiro. Vários modelos murinos de inflamação são usados para estudar DII, alguns dos quais incluem modelos knockout, modelos infecciosos, modelos inflamatórios químicos e modelos de transferência de células T 5,6,7,8. Embora cada um possa estudar certos aspectos etiológicos da DII, como predisposições genéticas, disfunção de barreira, desregulação imunológica e microbioma, eles são limitados em sua capacidade de estudar a natureza multifatorial da doença.

Os organoides intestinais, incluindo enteróides e colonoides, têm se estabelecido na última década como um modelo in vitro útil para estudar não apenas a dinâmica das células-tronco intestinais, mas também seu papel que a integridade da barreira e a função do epitélio intestinal desempenham na homeostase e doença intestinal. Essas entidades têm contribuído significativamente para o nosso entendimento da patogênese da DII⁹ e têm aberto novas oportunidades para a medicina personalizada. Colonoides, ou culturas de tecidos auto-organizáveis derivados de células-tronco do cólon, têm sido desenvolvidos a partir de tecido murino e humano, em um processo que permite que células-tronco localizadas dentro de criptas intestinais se propaguem e sejam mantidas indefinidamente¹⁰. O nicho de células-tronco in vivo depende de fatores extracelulares para suportar seu crescimento, notadamente as vias canônicas de sinalização Wnt e osteomorfogênicas¹¹. A adição desses fatores promove a saúde e a longevidade dos colonoides, mas também direciona a cultura para um estado semelhante ao das células-tronco que não reflete a arquitetura celular epitelial in vivo, que consiste tanto em células auto-renovadoras quanto terminalmente diferenciadas^12,13. Enquanto a funcionalidade do epitélio intestinal é dependente do crosstalk contínuo entre o compartimento de células-tronco e células diferenciadas, a capacidade de ter ambos em um sistema de cultura colonóide é bastante limitada. Apesar dessas limitações, o sistema de cultura organoide continua sendo o padrão-ouro para o estudo das propriedades intrínsecas do epitélio ex vivo. No entanto, estratégias alternativas de cultura podem precisar ser consideradas para responder à questão científica em questão.

Foi demonstrado que camundongos em um regime contínuo de 7 dias de sulfato de sódio de dextran (DSS) desenvolvem inflamação epitelial e disfunção de barreira¹⁴. Além disso, a falha na biogênese mitocondrial e a reprogramação metabólica dentro do epitélio intestinal, que têm se mostrado evidentes na DII humana, também foram capturadas neste modelo de colite por DSS¹⁵. No entanto, nossos dados preliminares demonstram que as características de falha da biogênese mitocondrial não são retidas em colonoides derivados das criptas de animais tratados com DSS (Figura 1 Suplementar). Assim, métodos alternativos de cultura devem ser usados ao examinar como a inflamação conduz alterações epiteliais durante a inflamação intestinal murina. Aqui, delineamos um protocolo que desenvolvemos que descreve 1) como isolar criptas de todo o tecido colônico para o estabelecimento de colonoides murinos, 2) como diferenciar terminalmente essa população celular para refletir a população celular como ela está in vivo, e 3) como induzir inflamação neste modelo in vitro . Para estudar as interações medicamentosas dentro do epitélio inflamado, desenvolvemos um protocolo para estabelecer monocamadas 2-dimensonais (2D) de colonoides murinos que podem ser tratadas basalmente com mediadores inflamatórios e tratadas apicamente com terapias medicamentosas.

Protocolo

Toda a experimentação com tecidos murinos aqui descrita foi aprovada pelo Comitê de Revisão Institucional da Universidade de Pittsburgh e conduzida de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Pesquisa e Cuidado Animal da Universidade de Pittsburgh e UPMC.

1. Preparação para a cultura

NOTA: Todos os reagentes estão listados na seção Tabela de materiais e todas as composições de solução podem ser encontradas na tabela de composição da solução (Tabela 1).

1. Preparar o meio de lavagem do rato, conforme descrito na Tabela 1. Conservar a 4°C por até 2 meses.
2. Prepare o buffer de isolamento de criptografia 1 (CIB1) conforme descrito na Tabela 1. Conservar a 4°C por até 2 meses.
   CUIDADO: O ditiotreitol (TDT) é considerado perigoso pelo Padrão de Comunicação de Perigos da OSHA devido à toxicidade aguda potencial se ingerido e danos à pele e aos olhos se essas áreas forem expostas a ele. Luvas de proteção, proteção ocular e proteção facial devem ser usadas ao manusear esse produto químico.
3. Prepare o buffer de isolamento de criptografia 2 (CIB2) conforme descrito na Tabela 1. Conservar a 4°C por até 2 meses.
4. Preparar meio condicionado com L-WRN de acordo com protocolo previamente publicado¹⁶.
5. Preparar o meio colonóide completo conforme descrito na Tabela 1. O meio de crescimento colonóide completo pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.
6. Preparar o meio de diferenciação conforme descrito na Tabela 1. Esse protocolo foi modificado a partir de um trabalho publicado^{anteriormente17}. O meio de diferenciação pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.
7. Preparar o meio mediador da inflamação conforme descrito na Tabela 1. Esse protocolo foi modificado a partir de um trabalho publicado^{anteriormente18}. O meio mediador da inflamação pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.
8. Prepare o meio de monocamada murino. Omitir Y-27632 ao desafiar as monocamadas com fatores inflamatórios e/ou medicamento(s). O meio monocamada murino pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.
9. Preparar o mediador de inflamação meio monocamada. O meio mediador da inflamação monocamada pode ser armazenado por até 5 dias a 4°C sem perda de atividade.

2. Isolamento de criptas do tecido colônico murino

NOTA: Transfira o tecido no gelo. Retire a quantidade apropriada de matriz de membrana basal do armazenamento de -20°C e descongele no gelo. Cada poço de 24 é revestido com 15 μL de matriz de membrana basal. Preparar CIB1, CIB2 e meio de crescimento colonóide completo conforme descrito na seção 1.

1. Eutanasiar um camundongo C57BL/6J (6-8 semanas de idade) de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais, e extrair a extremidade distal (aproximadamente 5-7 cm) do cólon usando pinça e tesoura limpas.
   NOTA: Neste estudo, os indivíduos foram eutanasiados usando incubação da câmara de dióxido de carbono por 2-3 min seguida de deslocamento cervical.
   1. Para isso, coloque o mouse de costas, faça uma incisão horizontal logo abaixo da caixa torácica e, em seguida, uma incisão vertical do meio da incisão horizontal em direção à base da cauda para expor a cavidade abdominal.
   2. Com uma pinça, mova o intestino delgado para fora do campo, identifique o cólon e siga-o até a base da cauda. Quebre a pelve com tesoura para expor totalmente o cólon distal, se necessário. Use a tesoura para cortar os 5-7 cm mais distais do cólon.
2. Coloque o tecido do cólon em uma superfície limpa. Remova o excesso de gordura serosa que envolve o cólon. Remova a matéria fecal lavando o conteúdo luminal do cólon com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco usando uma seringa conectada a uma agulha 18 G 1 1/2. Em seguida, coloque o cólon em um tubo cônico de 50 mL contendo 10 mL de DPBS gelada e coloque-o sobre gelo.
   NOTA: Se isolar o cólon de mais de um animal, coloque o tecido no gelo antes de continuar para o próximo animal.
3. Transferir o tecido do cólon para uma placa de Petri com 10 mL de DPBS gelada e irrigar o lúmen duas vezes com DPBS usando uma pipeta P1.000.
4. Abra o cólon longitudinalmente usando uma tesoura e agite suavemente usando uma pinça por ~30 s no DPBS para remover qualquer conteúdo fecal restante.
5. Transferir o tecido para uma nova placa de Petri com 10 mL de DPBS gelada e, novamente, agitar suavemente com uma pinça antes de cortar o cólon em pedaços de 2 cm com tesoura e colocá-los em um tubo cônico de 50 mL com 7 mL de CIB1 gelado. Incubar o tecido em CIB1 sobre gelo por 20 min.
   NOTA: As demais etapas são realizadas dentro de um gabinete de segurança biológica.
6. Transferir o tecido com uma pinça para um tubo cônico pré-aquecido de 50 mL contendo 7 mL de CIB2 e incubar em banho-maria a 37°C por 5 min.
7. Remova a CIB2 do tubo cônico de 50 mL deixando o tecido se acomodar no fundo do tubo cônico e, em seguida, pipetando a CIB2. Em seguida, adicione 10 mL de meio de lavagem gelado ao mesmo tubo cônico.
8. Obter um novo tubo cônico de 50 mL e colocar um filtro de 70 μm sobre o tubo aberto.
9. Ao segurar o tubo com o conteúdo do cólon, gire a mão aproximadamente 45°. Agite o tubo de forma agitada e vigorosa por 45 s para liberar as criptas. Em seguida, despeje a suspensão da cripta através do filtro de células de 70 μm em um novo tubo cônico de 50 mL.
10. Usando uma pinça, coloque o tecido do cólon de volta no tubo cônico vazio de 50 mL e adicione 10 mL de meio de lavagem gelado do rato. Obter um novo filtro celular de 70 μm e colocá-lo sobre o tubo cônico de 50 mL contendo a solução filtrada anterior.
11. Novamente, pegue o tubo de 50 mL que contém os fragmentos da cripta e agite-o de maneira idêntica à do passo 2.9. Filtrar o meio através do filtro celular de 70 μm para o tubo cônico de 50 mL para combinar com as criptas previamente filtradas.
    NOTA: Se o rendimento da cripta for baixo, agite o tecido do cólon mais uma vez colocando o tecido num tubo cónico vazio de 50 ml com 10 ml de meio de lavagem em rato. Agite o tecido por 45-50 s para liberar as criptas. Além disso, se o rendimento da cripta for baixo, aumente a vigorosidade do tremor. Finalmente, se o rendimento geral das criptas for baixo, tanto os pipets quanto os tubos podem ser revestidos com soro fetal bovino (FBS) para evitar a aderência do tecido ao plástico.
12. Centrifugar o tubo cônico de 50 mL contendo as criptas filtradas a 300 x g por 5 min a 4°C.
    NOTA: Um pellet deve ser observado no fundo do tubo cônico de 50 mL.
13. Decantar o meio por pipetagem, ressuspender as criptas pipetando para cima e para baixo com 10 mL de meio de lavagem de camundongo gelado e transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4°C.
14. Para obter uma preparação mais limpa, lave as criptas com mais 10 mL de meio de lavagem do rato. Decantar o meio anterior e ressuspender as criptas pipetando para cima e para baixo em 10 mL de meio de lavagem do rato. Centrifugar a 300 x g por 5 min a 4°C usando um tubo cônico de 15 mL.
    NOTA: Deve-se ter cuidado ao pipetar fora do meio porque, às vezes, o pellet não é centrifugado firmemente. Se o pellet não estiver apertado, pipetar a maior parte do meio, deixando 500 μL a 1 mL. Em seguida, ressuspenda o pellet por pipetagem em 10 mL de meio de lavagem em camundongo e transfira a solução para um tubo cônico de 15 mL. A centrifugação em um tubo cônico menor pode melhorar a estanqueidade do pellet.
15. Decantar o meio e ressuspender as criptas pipetando para cima e para baixo com 10 mL de meio de lavagem de camundongo gelado. Uma vez ressuspensas, conte as criptas sob um microscópio de campo claro pipetando imediatamente 10 μL do meio em uma lâmina de vidro.
    1. Coloque duas gotas de 10 μL em extremidades separadas da lâmina e conte o número de criptas em cada gota. Faça a média dos números entre as duas gotas para determinar o número de criptas por 10 μL. Multiplique esse número por 100 para obter o número de criptas em 1 mL.
       NOTA: Para uma contagem precisa, 10 μL da suspensão da cripta devem ser imediatamente removidos após a resuspensão. Caso contrário, as criptas cairão no fundo do tubo, o que resultará em uma contagem imprecisa.
16. Com o objetivo de chapear 300-500 criptas por poço, transfira o volume apropriado de criptas ressuspensas no meio de lavagem do mouse para um novo tubo cônico de 15 mL e leve para 10 mL com meio de lavagem de camundongo gelado. Centrifugar o tubo a 300 x g durante 5 min a 4°C. Um pequeno pellet deve ser visível no fundo do tubo.
17. Retire o sobrenadante com uma pipeta de alimentação. Use uma pipeta P200 para remover cuidadosamente qualquer meio residual, deixando apenas o pellet.
18. Ressuspenda o pellet na quantidade apropriada de matriz de membrana basal gelada pipetando lentamente para cima e para baixo. Tenha cuidado para não introduzir bolhas ao ressuspender a pelota da cripta. Placa 300-500 criptas/15 μL de matriz de membrana basal em cada poço de uma placa. Após o plaqueamento, inverter a placa de cultura de tecidos e colocá-la em estufa a 37°C por 10-20 min.
19. Reverter a placa e adicionar 500 μL do meio colonóide completo do rato a cada poço. Troque o meio a cada dois dias até que estejam prontos para a passagem. Passe os colonóides a cada 3-5 dias.

3. Passagem dos colonóides

NOTA: Cada poço geralmente pode ser passado de 1:4 a 1:6 de acordo com a densidade do poço original. Retire a quantidade adequada de matriz da membrana basal de -20°C e coloque-a no gelo para descongelar. Os colonóides podem ser usados para experimentos após duas passagens. Ao passar colonoides, as etapas são realizadas em um gabinete de segurança biológica para evitar contaminação.

1. Retire o meio dos poços a serem passados.
   1. Se houver detritos dentro da matriz da membrana basal, o que pode acontecer durante o isolamento inicial, o seguinte protocolo pode ser usado para limpar os detritos:
      1. Adicionar 1 mL de albumina de soro bovino (BSA) gelada a 0,1% em DPBS sem Ca 2+ ou Mg²⁺ em cada poço. Deixe descansar por 5 min no armário de segurança biológica.
      2. Pipetar para cima e para baixo três a sete vezes usando uma pipeta P1000 para romper a matriz da membrana basal e coletar o conteúdo dos poços em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar os colonóides em um total de 5-10 mL de BSA 0,1% em DPBS sem Ca 2+ ou Mg²⁺. Completar até ao volume adequado com 0,1% de BSA.
      3. Centrifugar a 150 x g durante 5 min a 4°C para peletizar os colonóides, mas não os detritos.
      4. Decantar o DPBS por pipetagem, deixando o pellet. Adicionar 1 mL de reagente de dissociação enzimática à temperatura ambiente (TR) e pipetar três a cinco vezes.
      5. Colocar o tubo cônico de 15 mL com o reagente de dissociação enzimática e colonoides rompidos em banho-maria a 37°C por 3-4 min.
      6. Retire o tubo do banho-maria, pipeta 3-5 vezes e, em seguida, leve para 10 mL com meio de lavagem do rato. Prossiga para a etapa 3.6.
2. Coloque 500 μL do reagente de dissociação enzimática RT em cada poço e deixe descansar por aproximadamente 1 min antes de pipetar para cima e para baixo três a sete vezes para romper a matriz da membrana basal.
3. Coloque a placa em uma incubadora a 37°C por 3-4 min.
4. Retire a placa da incubadora e pipete para cima e para baixo três a sete vezes usando uma pipeta P1000 para dissociar os colonoides.
5. Transfira o conteúdo para um tubo cônico de 15 mL e perfaça até 10 mL com meio de lavagem de camundongo gelado.
6. Centrifugar a amostra a 300 x g durante 5 min a 4°C.
7. Remova o meio usando uma pipeta de alimentação e uma pipeta P200, conforme necessário, para que apenas um pellet seja deixado no tubo cônico.
8. Ressuspenda em uma quantidade apropriada de matriz de membrana basal gelada, pipetando suavemente para cima e para baixo de acordo com quantos poços devem ser chapeados. Não introduza bolhas ao pipetar. Colocar os fragmentos colonoides em 15 μL de gotas de matriz da membrana basal por poço.
9. Plaqueie as criptas, inverta a placa de cultura de tecidos e, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37°C por 10-20 min.
10. Finalmente, reverta a placa e adicione 500 μL de meio colonóide completo de camundongo a cada poço. Mude o meio a cada dois dias até que eles tenham crescido o suficiente para serem passados novamente em aproximadamente 3-5 dias.

4. Diferenciando terminalmente as células colonóides

1. Passe os colonóides como acima, e adicione 500 μL do meio colonóide completo do rato a cada poço.
2. Pelo menos 48 h após a passagem, remova o meio colonóide completo do rato e adicione 500 μL do meio diferenciador a cada poço (ver secção 1).
3. Incubar os colonóides com meios de diferenciação por 48 h, após o que poderão ser utilizados em experimentos, incluindo a coleta de RNA e proteína.
   NOTA: Os colonóides podem ser avaliados quanto à diferenciação através da coleta de RNA e avaliação da expressão de Lgr5 e Ki67, um marcador de células-tronco e marcador de proliferação celular, respectivamente, via transcriptase reversa quantitativa - reação em cadeia da polimerase (qPCR). Células terminalmente diferenciadas devem ter uma expressão relativamente baixa de Lgr5 e Ki67 em comparação com colonóides cultivados em meio colonóide tradicional, onde as células são mais semelhantes a tronco. A duração do tempo que os colonóides precisam para incubar no meio de diferenciação pode precisar ser otimizada para cada laboratório individual. Consulte a Tabela Suplementar 1 para obter a lista de cartilhas.

5. Indução de inflamação em colonóides diferenciados com mediadores inflamatórios

1. Após os colonóides terem sido incubados por 2-3 dias com o meio de diferenciação, remova o meio existente e adicione 500 μL do meio mediador da inflamação a cada poço.
2. Permitir que os poços incubem por 24-72 h antes de coletar o RNA e a proteína (ou avaliar outros parâmetros a jusante). Mude o meio todos os dias.

6. Monocamadas epiteliais intestinais derivadas de colonóides murinos estabelecidos

NOTA: As monocamadas epiteliais intestinais murinas são derivadas de colonóides murinos que foram passados pelo menos duas vezes. Para permitir a formação bem-sucedida de monocamadas em 3-5 dias, é imperativo não separar os colonoides em células únicas. Organoides fragmentados que foram enzimaticamente dissociados em aglomerados celulares são ideais para o crescimento.

1. Preparar todos os reagentes antes de iniciar o experimento. Descongelar a matriz da membrana basal no gelo. Preparar o meio de monocamada murino conforme descrito na secção 1 . Diluir a membrana basal descongelada 1:20 com o meio monocamada murino frio. Continue no gelo.
2. Use pinça estéril para colocar uma pastilha de cultura de células transparente de 0,4 μm em um único poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços (Tabela de Materiais). Pegue um pino de canto da pastilha e transfira-a para o poço. Repetir até que o número apropriado de inserções de cultura celular esteja disponível para cultura.
   NOTA: Certifique-se de revestir um poço de controle adicional apenas com a matriz da membrana basal. Esta inserção de cultura celular será usada para medir a resistência de fundo da inserção de cultura celular sem células presentes, conforme descrito na etapa subsequente (etapa 6.3).
3. Usando uma pipeta P200, cubra a superfície apical (superior) de cada pastilha de cultura celular com 150 μL de matriz de membrana basal diluída. Coloque a ponta da pipeta no centro da inserção sem tocar na membrana da inserção e expulse suavemente a solução. Coloque a placa em uma incubadora estéril a 37°C com 5% de CO₂ por pelo menos 1 h.
4. Remova suavemente a matriz da membrana basal antes do uso e deixe as inserções de cultura celular secarem em um gabinete de segurança biológica por um mínimo de 10 min.
   1. Para remover a matriz da membrana basal, gire a placa de 24 poços em um ângulo de 45°. Coloque um único dedo no canto da pinça para estabilizar a inserção e, usando uma pipeta P200, coloque suavemente a ponta da pipeta ao longo do lado inferior da pastilha e remova a matriz.
   2. Remova qualquer resíduo em excesso lavando cada pastilha de cultura celular com 150 μL de DPBS estéril sem Ca 2+ ou Mg²⁺.
5. Após 10 min de secagem, adicionar 400 μL do meio monocamada murino ao fundo da pastilha de cultura celular e 75 μL por cima. Repita até que todas as inserções de cultura celular estejam imersas. Deixe a placa no armário de segurança biológica ou coloque-a de volta na incubadora até que seja necessário.
6. Remova a placa de 24 poços de colonoides intestinais maduros (organoides no Dia 3-5 de crescimento) da incubadora de 37°C, 5% CO₂ e coloque-a sob o gabinete de segurança biológica. Retire o meio com pontas estéreis e lave bem cada um com 1 mL de RT DPBS estéril (sem Ca 2+ ou Mg²⁺).
   NOTA: Um poço individual de 75-125 colonóides maduros é dividido em uma proporção de 1:4.
7. Remover a DPBS sem Ca 2+ ou Mg²⁺ usando pontas estéreis e digerir cada plugue da matriz da membrana basal colocando 500 μL do reagente de dissociação enzimática RT em cada poço a ser passado.
8. Pipete cada poço para cima e para baixo aproximadamente 6-10 vezes para quebrar o plugue. Não risque o fundo da placa para remover o plugue. Em vez disso, gire a placa de 24 poços em um ângulo de 45°, coloque a ponta da tubulação na borda do plugue e desaloje-a suavemente.
9. Coloque a placa de 24 poços de volta em uma incubadora estéril a 37°C, 5% CO₂ por 3-4 min.
10. Remova a placa e pipete o reagente de dissociação enzimática para cima e para baixo cinco a sete vezes para cada poço sob um armário de segurança biológica. Transfira os colonoides dissociados de cada poço para um tubo cônico estéril de 15 mL. Levar até um volume de 10 mL com meio de lavagem gelado do rato.
11. Centrifugar os colonóides parcialmente digeridos a 300 x g a 4°C por 5 min em uma centrífuga de balde oscilante.
12. Sob o gabinete de segurança biológica, remova o sobrenadante do pellet usando uma pipeta de 10 mL. Remova qualquer meio restante usando um pipet P200. Ressuspender o pellet colonóide em meio monocamada murina. Adicionar 75 μL de meio por cada cultura celular inserida de colonóides fragmentados a serem plaqueados.
13. Adicionar 75 μL de suspensão colonóide ao centro de cada inserção de cultura celular. Antes de adicionar a suspensão colonóide a cada poço, pipete suavemente para cima e para baixo uma ou duas vezes antes de remover os 75 μL, o que permite um revestimento mais uniforme.
14. Coloque a placa de 24 poços com inserções de cultura celular em uma plataforma giratória por 10 min para permitir uma dispersão uniforme através da inserção de cultura celular.
15. Coloque a placa em uma incubadora estéril a 37°C, 5% CO₂ .
16. No dia seguinte (Dia 1), desalojar os fragmentos colonoides não aderidos pipetando o meio para cima e para baixo três a cinco vezes com uma pipeta P200. Coloque suavemente a ponta ao lado do interior da inserção da cultura celular para não perturbar as células intestinais anexadas. Não introduza bolhas no meio, pois isso impede a remoção de todos os fragmentos não anexados.
17. Retire imediatamente a mistura de meio e colonóide. Repita até que todas as pastilhas de cultura celular tenham sido limpas.
18. Adicionar suavemente 150 μL de meio monocamada murino pré-aquecido ao lado apical de cada inserção de cultura celular. Adicionar 400 μL de meio monocamada murino aquecido a cada poço de uma nova placa de 24 poços. Transfira a pastilha de cultura celular para a nova placa agarrando sua pinça usando pinça estéril. Troque o meio a cada dois dias até a confluência.
    NOTA: Os fragmentos colonoides devem formar uma monocamada confluente 3-5 dias após o plaqueamento.

7. Mensuração da resistência líquida das monocamadas epiteliais utilizando um voltômetro nos dias 3 - 5 de cultura da monocamada

NOTA: Os eletrodos de pauzinho assemelham-se a pinças e são assimétricos em comprimento. O braço mais longo da sonda é o eletrodo basolateral e o braço mais curto é o eletrodo apical. A sonda pode ser difícil de inserir entre o interior e o exterior da inserção da cultura celular. Colocar a sonda em um leve ângulo após a inserção, seguido de retificação vertical da sonda, evitará que a sonda fique presa. Certifique-se de ler a resistência líquida de cada inserção de cultura de células em um ângulo semelhante, pois isso pode afetar os valores.

1. Coloque o voltohmímetro e todos os reagentes dentro de um armário de segurança biológica.
   1. Conecte o voltohmímetro à tomada CA mais próxima e conecte o conector modular de plástico da sonda do eletrodo ao conector INPUT no visor frontal.
   2. Para colocar o voltômetro em um ângulo de 45°, gire o braço de metal na parte traseira do equipamento para fora até que ele trave no lugar.
   3. Agora, ligue o voltômetro acionando o interruptor de energia UP no display frontal. Por fim, vire o interruptor para cima em direção ao OHMS para exibir a leitura nessa métrica.
2. Remova a placa de 24 poços da incubadora de 37°C, 5% de CO₂ e coloque a placa plana no armário de segurança biológica. A resistência elétrica transepitelial (TEER) é sensível à temperatura. Apenas remova a placa imediatamente antes da leitura do TESE.
3. Esterilizar a sonda do eletrodo em etanol 70% pré-aquecido por 30 s a 1 min. Retire a sonda, inverta e mexa-a uma a duas vezes para remover o excesso de etanol. Deixe a sonda secar ao ar por aproximadamente 30 s.
4. Lave o etanol restante deixado na sonda com meio de lavagem pré-aquecido do rato.
   CUIDADO: Não deixe que nenhuma das gotículas de etanol restantes mais acima na sonda caia na inserção da cultura celular. Ao lavar o etanol com meio, não deixe o meio passar acima do campo de etanol estéril. Isso poderia fazer com que o meio contaminado entrasse na inserção da cultura celular.
5. Segure a sonda perpendicularmente à inserção da cultura celular. Insira o eletrodo basolateral (extremidade mais longa da sonda) na parte externa da pastilha de cultura celular até que ele toque a base da placa de 24 poços. Deslize o eletrodo apical (extremidade mais curta da sonda) para dentro do inserto de cultura celular. Não varie a distância dos dois eletrodos de poço para poço. Isso impactará a medição TESE.
6. Verifique se o eletrodo apical não está tocando a base da inserção de cultura celular antes de ler o TEER. Comece com a inserção da cultura de célula de controle em segundo plano e registre o valor. O valor será exibido automaticamente digitalmente na parte frontal do voltômetro.
7. Repita as etapas 7.5-7.6 para cada inserção de cultura celular.
   NOTA: Se existirem condições experimentais diferentes entre as inserções de cultura celular, esterilizar a sonda entre cada nova condição. Comece na etapa 7.1 e prossiga numericamente pelas etapas.
8. Coloque a placa de 24 poços de volta na incubadora depois que todas as medições TEER tiverem sido registradas.
9. Os valores líquidos a 350 Ω ou mais são indicativos de formação de monocamadas. Repetir novamente nos dias subsequentes até que a formação de monocamada tenha sido alcançada.
   NOTA: Geralmente, valores de 1.000 Ω ou mais podem ser capturados no Dia 3, mas com o tempo, todos eles convergirão para um número menor em torno de 350 Ω.

8. Cálculo do TEER utilizando medidas de resistência líquida do voltômetro

NOTA: A formação bem sucedida de monocamada dos colonóides dará medidas TEER superiores a 115 Ω·cm².

1. Pegue os valores individuais de resistência líquida e subtraia bem a resistência líquida do plano de fundo. As inserções de cultura celular revestidas com a membrana da matriz basal darão uma leitura líquida de cerca de 100 Ω.
2. Pegue as medidas de resistência líquida subtraídas em segundo plano e multiplique-as pela área de superfície da inserção de cultura celular. Uma pastilha de cultura celular de 24 poços tem uma área de superfície de 0,33^cm2.
3. Se os valores forem iguais ou superiores a 115 Ω·cm² , proceder aos ensaios experimentais a jusante.

9. Indução de inflamação nas monocamadas epiteliais com mediadores inflamatórios

1. Uma vez formadas as monocamadas bem-sucedidas, adicione mediadores inflamatórios à cultura no lado basal da cultura. Preparar o meio monocamada mediador da inflamação, conforme descrito na etapa 1.9, e adicionar 400 μL a cada poço em uma nova placa de 24 poços.
2. Remova o meio do lado apical da inserção de cultura celular e adicione 150 μL do meio monocamada murino sem Y-27632. Não complemente este lado com mediadores inflamatórios. No entanto, se a morte celular parecer excessiva, deixe o Y-27632 na mídia. Isso deve ser determinado pelo usuário final.
3. Transfira as pastilhas de cultura celular para uma nova placa de 24 poços e coloque-as nos poços suplementados com o meio monocamada mediador da inflamação.
4. Estimular as monocamadas com mediadores inflamatórios por 24-72 h, dependendo do experimento.
5. Para testar as respostas a drogas usando este modelo inflamatório, suplemente o meio monocamada no lado apical da inserção de cultura celular com a droga de escolha. O fármaco pode ser adicionado em qualquer ponto do experimento, dependendo do mecanismo de ação do fármaco e dos parâmetros a jusante a serem avaliados.

Resultados

O sistema de cultura colonóide intestinal 3D é uma ferramenta valiosa para estudar a contribuição intrínseca do epitélio para a homeostase da mucosa intestinal. O protocolo descrito fornece instruções detalhadas sobre como isolar criptas de camundongos C57BL/6J (WT) com 8 semanas de idade e estabelecer um sistema de cultura de colonoides de longo prazo que pode ser manipulado para múltiplas aplicações a jusante. Após o isolamento e plaqueamento das criptas na matriz da membrana basal, as criptas apresentam-se...

Discussão

O desenvolvimento de organoides revolucionou a forma como a comunidade científica estuda sistemas orgânicos in vitro com a capacidade de recapitular parcialmente a estrutura e a função celular de um animal ou humano em um prato. Além disso, sistemas organoides derivados de humanos com doenças oferecem uma ferramenta promissora para a medicina personalizada que pode orientar a tomada de decisões terapêuticas. Aqui, descrevemos um protocolo de isolamento de cripta que funciona bem e introduz etapas importa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)