Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en grupos de islotes productores de insulina

Resumen

La diferenciación de las células madre en células de los islotes proporciona una solución alternativa al tratamiento convencional de la diabetes y al modelado de la enfermedad. Describimos un protocolo detallado de cultivo de células madre que combina un kit de diferenciación comercial con un método previamente validado para ayudar a producir islotes derivados de células madre secretores de insulina en una placa.

Resumen

La diferenciación de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) en células beta secretoras de insulina proporciona material para investigar la función de las células beta y el tratamiento de la diabetes. Sin embargo, sigue habiendo desafíos para obtener células beta derivadas de células madre que imiten adecuadamente a las células beta humanas nativas. Sobre la base de estudios previos, se han generado células de islotes derivadas de hPSC para crear un protocolo con mejores resultados de diferenciación y consistencia. El protocolo descrito aquí utiliza un kit de progenitores pancreáticos durante las etapas 1-4, seguido de un protocolo modificado de un artículo publicado previamente en 2014 (denominado "protocolo R" en adelante) durante las etapas 5-7. Se incluyen procedimientos detallados para el uso del kit de progenitores pancreáticos y placas de micropocillos de 400 μm de diámetro para generar grupos de progenitores pancreáticos, el protocolo R para la diferenciación endocrina en un formato de suspensión estática de 96 pocillos, y la caracterización in vitro y la evaluación funcional de los islotes derivados de hPSC. El protocolo completo tarda 1 semana para la expansión inicial de la hPSC, seguida de ~5 semanas para obtener islotes de hPSC productores de insulina. Este protocolo puede ser reproducido por personal con técnicas básicas de cultivo de células madre y formación en ensayos biológicos.

Introducción

Las células beta pancreáticas secretan insulina en respuesta a los aumentos en los niveles de glucosa en sangre. Los pacientes que carecen de suficiente producción de insulina debido a la destrucción autoinmune de las células beta en la diabetes tipo 1 (DT1)¹, o debido a la disfunción de las células beta en la diabetes tipo 2 (DT2)², suelen ser tratados con la administración de insulina exógena. A pesar de esta terapia que salva vidas, no puede igualar con precisión el exquisito control de la glucosa en sangre que se logra mediante la secreción dinámica de insulina de las células beta de buena fe. Como tal, los pacientes a menudo sufren las consecuencias de episodios de hipoglucemia potencialmente mortales y otras complicaciones resultantes de excursiones hiperglucémicas crónicas. El trasplante de islotes cadavéricos humanos restaura con éxito un estricto control glucémico en pacientes con diabetes Tipo 1, pero está limitado por la disponibilidad de donantes de islotes y las dificultades para purificar islotes sanos para trasplante ^3,4. Este reto puede, en principio, resolverse mediante el uso de hPSC como material de partida alternativo.

Las estrategias actuales para generar islotes secretores de insulina a partir de hPSCs in vitro a menudo apuntan a imitar el proceso de desarrollo embrionario del páncreas in vivo ^5,6. Esto requiere el conocimiento de las vías de señalización responsables y la adición programada de los factores solubles correspondientes para imitar las etapas críticas del páncreas embrionario en desarrollo. El programa pancreático se inicia con el compromiso con el endodermo definitivo, que está marcado por los factores de transcripción forkhead box A2 (FOXA2) y la región determinante del sexo Y-box 17 (SOX17)⁷. La diferenciación sucesiva del endodermo definitivo implica la formación de un tubo intestinal primitivo, que se modela en un intestino anterior posterior que expresa el homeobox 1 pancreático y duodenal (PDX1)^7,8,9, y la expansión epitelial en progenitores pancreáticos que coexpresan PDX1 y homeobox 1 NK6 (NKX6.1)^10,11.

Un mayor compromiso con las células endocrinas de los islotes se acompaña de la expresión transitoria del regulador maestro proendocrino neurogenina-3 (NGN3)12 y la inducción estable de los factores de transcripción clave diferenciación neuronal 1 (NEUROD1) y NK2 homeobox 2 (^NKX2.2)¹³. Posteriormente, se programan las principales células que expresan hormonas, como las células beta productoras de insulina, las células alfa productoras de glucagón, las células delta productoras de somatostatina y las células PPY productoras de polipéptidos pancreáticos. Con este conocimiento, así como con los descubrimientos de extensos estudios de cribado de fármacos de alto rendimiento, los avances recientes han permitido la generación de islotes hPSC con células parecidas a las células beta capaces de secreción de insulina 14,15,16,17,18,19.

Se han reportado protocolos escalonados para generar células beta sensibles a la glucosa 6,14,18,19. Sobre la base de estos estudios, el presente protocolo implica el uso de un kit de progenitores pancreáticos para generar células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1⁺ en un cultivo plano, seguido de la agregación de placas de micropocillos en grupos de tamaño uniforme y una mayor diferenciación hacia islotes de hPSC secretoras de insulina con el protocolo R en un cultivo estático en suspensión 3D. Se realizan análisis de control de calidad, incluida la citometría de flujo, la inmunotinción y la evaluación funcional, para una caracterización rigurosa de las células diferenciadoras. Este artículo proporciona una descripción detallada de cada paso de la diferenciación dirigida y describe los enfoques de caracterización in vitro.

Protocolo

Este protocolo se basa en el trabajo con líneas hPSC, incluyendo H1, HUES4 PDXeG y Mel1 INS^GFP/W, en condiciones libres de alimentadores. En esta sección se detalla un procedimiento paso a paso, con datos de apoyo de la diferenciación de Mel1 INS^GFP/W en la sección de resultados representativos. Recomendamos que se necesite una mayor optimización cuando se trabaje con otras líneas hPSC que no se indican aquí. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los reactivos y soluciones utilizados en este protocolo.

1. Preparación de medios y soluciones de diferenciación

NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver todas las soluciones que se deben preparar y la Tabla 2 para los medios de diferenciación.

1. Prepare todos los medios y reactivos para el cultivo celular en una cabina de bioseguridad estéril. Calentar brevemente las soluciones relacionadas con el cultivo celular y los medios basales a 37 °C en un baño antes de su uso.
   NOTA: Como se describe a continuación, haga nuevos medios de diferenciación diariamente agregando suplementos y utilícelos el mismo día. Alternativamente, el kit de progenitores pancreáticos ofrece la opción de preparar un volumen mayor con anticipación que se puede usar durante varios días siguiendo el protocolo del fabricante. Ambos métodos para la preparación de los medios de comunicación han demostrado funcionar bien. Tenga en cuenta que no se recomienda dejar los medios durante un tiempo prolongado en el baño de agua. Al preparar medios frescos cada día, se recomienda alícuotas de suplementos para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.

2. Diferenciación de hPSCs en células progenitoras pancreáticas

1. Mantener hPSC indiferenciadas en vasos recubiertos de Matrigel, en medio completo mTeSR1 y realizar cambios de medio diariamente. Durante el cultivo de mantenimiento, pase las hPSC cada 3-4 días cuando las células alcancen ~70% de confluencia utilizando el reactivo de disociación celular siguiendo el protocolo del fabricante. Para iniciar la diferenciación, disocie las células en células individuales y siembrójelas en placas tratadas con cultivo de tejidos de 6 o 12 pocillos (con volúmenes de medios de 2 ml o 1 ml por pocillo, respectivamente).
   NOTA: Consulte la Tabla 1 para obtener instrucciones relacionadas con el almacenamiento del medio basal del endodermo y sus alícuotas.
2. Precubra los pocillos de cultivo con Matrigel calificado hESC (diluido en DMEM/F12 helado según lo recomendado por el protocolo del fabricante) y coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 30 min.
3. Mueva la placa recubierta de Matrigel a temperatura ambiente (úsela dentro de las 3 h).
4. Aspire el medio gastado del cultivo de hPSC y enjuague una vez con DPBS. Disociar el cultivo de hPSC en células individuales con la enzima de disociación celular a 37 °C durante 3-5 min. Enjuague las células agregando medio DMEM/F12 tibio, transfiéralas a un tubo cónico de 15 ml o 50 ml y centrifugue a 300 × g durante 5 minutos.
5. Vuelva a suspender el gránulo celular con medio completo de células madre más 10 μM Y-27632 y realice el recuento de células vivas (azul de tripano negativo) con un hemocitómetro o contador de células automatizado. Aspirar Matrigel diluido e inmediatamente sembrar células vivas a una densidad de 1,60-1,80 × 10⁵/^cm2 en pocillos recubiertos de Matrigel e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h. Continúe con la Etapa 1.
   NOTA: Esto dará como resultado una confluencia inicial de ~95% para iniciar la diferenciación. De acuerdo con el protocolo del fabricante, se recomienda una densidad de siembra de 2,6 × 10⁵/^cm2 . Se recomienda probar varias densidades de siembra para determinar el valor óptimo de una línea celular y comprobar la viabilidad celular. Si la viabilidad es inferior al 80%, no proceda con la diferenciación. La baja viabilidad celular puede ser el resultado de una digestión excesiva o una trituración excesiva durante la cosecha o de dejar las células durante un tiempo prolongado en medio DMEM/F12 antes de la siembra.
6. En la etapa 1 día 1, calentar brevemente el medio basal del endodermo a 37 °C en un baño y descongelar el suplemento MR y CJ. Prepare el medio de la etapa 1A agregando Supplement MR y CJ al medio basal del endodermo. Mezclar bien y usar inmediatamente.
7. Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 1A e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
   NOTA: Los pasos de lavado son innecesarios. Retire las células no adheridas del cultivo agitando suavemente la placa de cultivo antes del intercambio de medios. Evite alterar la monocapa al no tocar la punta de la pipeta con el fondo del pocillo durante la extracción del medio y mediante la adición suave del medio.
8. En la etapa 1 día 2, calentar brevemente el medio basal del endodermo en un baño a 37 °C y descongelar Suplemento CJ. Prepare el medio de la etapa 1B agregando el suplemento CJ al medio basal del endodermo. Mezclar bien y usar inmediatamente.
9. Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 1B e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
10. En la Etapa 1 día 3, repita los pasos 2.8-2.9. Continúe con la Etapa 2.
11. En el día 1 de la Etapa 2, calentar el medio basal pancreático Etapa 2-4 en un baño a 37 °C y descongelar el Suplemento 2A y 2B. Prepare el medio de la Etapa 2A agregando el Suplemento 2A y 2B al medio basal pancreático Etapa 2-4. Mezclar bien y usar inmediatamente.
12. Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 2A e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
13. En el día 2 de la Etapa 2, calentar el medio basal pancreático Etapa 2-4 en un baño a 37 °C y descongelar el Suplemento 2B. Prepare el medio de la Etapa 2B agregando el Suplemento 2B al medio basal pancreático Etapa 2-4. Mezclar bien y usar inmediatamente.
14. Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 2B e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
15. En la Etapa 2 día 3, repita los pasos 2.13-2.14. Continúe con la Etapa 3.
16. En la Etapa 3 día 1, calentar el medio basal pancreático Etapa 2-4 en un baño a 37 °C y descongelar el Suplemento 3. Prepare el medio de la Etapa 3 agregando el Suplemento 3 al medio basal de la Etapa 2-4 del páncreas. Mezclar bien y usar inmediatamente.
17. Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 3 e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
18. En la etapa 3, día 2 y día 3, repita los pasos 2.16-2.17. Continúe con la etapa 4.
19. En la Etapa 4 día 1, calentar el medio basal pancreático Etapa 2-4 en un baño a 37 °C y descongelar el Suplemento 4. Prepare el medio de la Etapa 4 agregando el Suplemento 4 al medio basal de la Etapa 2-4 del páncreas. Mezclar bien y usar inmediatamente.
20. Aspirar el medio gastado de los pocillos, añadir el medio Stage 4 e incubar en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
21. En la etapa 4 del día 2 al día 4, repita los pasos 2.19-2.20. Continúe con los pasos de agregación.

3. Agregación en grupos de progenitores pancreáticos utilizando placas de micropocillos de 400 μm de diámetro

1. En la etapa 4 del día 5, pretrate los micropocillos (p. ej., formato de placa de 24 pocillos) con 500 μL de solución de enjuague antiadherente por pocillo.
2. Prepare una placa de equilibrio y centrifugue la placa de micropocillos a 1.300 × g durante 5 min.
   NOTA: Revise la placa bajo un microscopio para asegurarse de que no queden burbujas en los micropocillos. Vuelva a centrifugar durante otros 5 minutos si quedan burbujas atrapadas en algún micropocillo.
3. Aspire la solución de enjuague antiadherente de los pocillos y enjuague una vez con 1 ml de DPBS. Aspire el DPBS de los pocillos y agregue 1 ml de medio de agregación a cada pocillo.
4. Retire el medio gastado de los cultivos de progenitores pancreáticos y lávese una vez con DPBS. Disociar los cultivos en células individuales con reactivo de disociación a 37 °C durante 10-12 min. Enjuague las células con DMEM/F12 tibio, transfiéralas a un tubo y centrifugue a 300 × g durante 5 minutos.
5. Vuelva a suspender el gránulo de células en el medio de agregación y realice el recuento de células vivas. Siembre 2,4-3,6 millones de células totales por pocillo (es decir, 2.000-3.000 células por micropocillo) y agregue medio de agregación a cada pocillo para lograr un volumen final de 2 ml por pocillo.
6. Pipetee suavemente las células hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta de pipeta P1000 para garantizar una distribución uniforme de las células por todo el pocillo. No introduzca burbujas en los micropocillos. Centrifugar la placa de micropocillos a 300 × g durante 5 min para capturar las células en los micropocillos. Incubar la placa de micropocillos en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h de agregación y proceder a la diferenciación de las etapas 5-7.
   NOTA: Tenga cuidado de no alterar la placa durante el tiempo de agregación. Pueden ser necesarias hasta 48 h de tiempo de incubación para una formación óptima de agregados.

4. Diferenciación de grupos de progenitores pancreáticos derivados del kit en islotes hPSC

1. En la Etapa 5 día 1, calentar el medio basal de la Etapa 5-7 en un baño a 37 °C y descongelar suplementos (ver Tabla 1 y Tabla 2). Prepare el medio de la Etapa 5 agregando suplementos (a las concentraciones finales de trabajo) al medio basal de la Etapa 5-7. Mezclar bien y usar inmediatamente.
2. Después de la formación de agregados, pipetee suavemente los agregados hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta de pipeta P1000 para hacer flotar cualquier celda no agregada. Deje que los agregados se asienten por gravedad (espere ~ 1 min). Retire suavemente el medio gastado (que contiene las células flotantes no agregadas) del pocillo tanto como sea posible mientras evita aspirar agregados.
3. Dispense el medio fresco de la Etapa 5 vigorosamente sobre la superficie de la placa de micropocillos para desalojar los agregados de los micropocillos. Transfiera los agregados a 6 pocillos de fijación ultrabajo (ULA). Enjuague una vez con el medio Stage 5 para recuperar completamente los agregados de los micropocillos.
4. Recoja todos los agregados en los 6 pocillos de ULA, vuelva a suspender los agregados en el medio de la etapa 5 y ajuste la densidad a 20 grupos por 100 μL (por ejemplo, se espera que se recuperen ~ 1,200 grupos de cada pozo. Resuspender 1.200 racimos en 6 mL de medio Stage 5). Utilice una pipeta multicanal para dispensar 50 μL de medio de la etapa 5 en cada pocillo de una placa ULA de fondo plano de 96 pocillos. Llene los pocillos de las esquinas y los bordes con 200 μL de DPBS.
   NOTA: Evite usar los pozos de borde para cultivar agregados, ya que son propensos a una mayor evaporación; De lo contrario, use una placa de 96 pocillos que esté diseñada para minimizar la evaporación a lo largo de los bordes (por ejemplo, placas de 96 pocillos con fosos incorporados) o coloque la placa de cultivo en una incubadora de cultivo celular de microclima de alta humedad.
5. Agregue 100 μL de la resuspensión del racimo en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de fondo plano de ULA, lo que da como resultado un total de 150 μL de medio de cultivo que contiene un promedio de 20 racimos por pocillo.
   NOTA: Mezcle suavemente la resuspensión del racimo cada vez antes de dispensar en 96 pocillos.
6. Coloque las placas de cultivo sobre una superficie nivelada en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
7. En el día 2 de la Etapa 5, prepare el medio de la Etapa 5 siguiendo el paso 4.1.
8. Utilice una pipeta multicanal para eliminar ~90 μL del medio gastado de cada pocillo y refresque con 100 μL de medio de la Etapa 5.
9. En la etapa 5 del día 3, repita los pasos 4.7-4.8. Continúe con la etapa 6.
10. En la etapa 6 del día 1, calentar el medio basal de la etapa 5-7 en un baño a 37 °C y descongelar suplementos (ver Tabla 1 y Tabla 2). Prepare el medio de la Etapa 6 agregando suplementos (a las concentraciones finales de trabajo) al medio basal de la Etapa 5-7. Mezclar bien y usar inmediatamente.
11. Utilice una pipeta multicanal para eliminar ~90 μL del medio gastado y refresque con 100 μL de medio de la Etapa 6 por pocillo.
12. En la etapa 6, del día 2 al día 8, repita los pasos 4.10-4.11. Continúe con la etapa 7.
13. En la etapa 7 del día 1, calentar el medio basal de la etapa 5-7 en un baño a 37 °C y descongelar suplementos (ver Tabla 1 y Tabla 2). Prepare el medio de la Etapa 7 agregando suplementos (a las concentraciones finales de trabajo) al medio basal de la Etapa 5-7. Mezclar bien y usar inmediatamente.
14. Utilice una pipeta multicanal para eliminar ~90 μL del medio gastado y refresque con 100 μL de medio de la Etapa 7 por pocillo.
15. En la etapa 7 del día 2 al día 12, repita los pasos 4.13-4.14. Proceder a la caracterización in vitro .

5. Análisis citométrico de flujo

1. Retire el medio de cultivo y lávelo una vez con DPBS. Disociar los cultivos (células progenitoras planas o grupos diferenciadores) en células individuales con reactivo de disociación incubando a 37 °C durante 10-12 min. Enjuagar con tampón FACS y centrifugar a 300 × g durante 5 min.
2. Vuelva a suspender el gránulo de células en el tampón FACS y realice el recuento de células. Centrifugar las células a 300 × g durante 5 min. Vuelva a suspender las células individuales en 500 μL de tampón Fix/Perm durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Lleve el tampón Fix/Perm a temperatura ambiente antes de usarlo. El tampón Fix/Perm contiene paraformaldehído (PFA). Manipule con cuidado el PFA en una campana extractora y deséchelo de acuerdo con las pautas institucionales.
3. Centrifugar a 500 × g durante 3 min, lavar dos veces con 500 μL de 1x tampón Perm/Wash y volver a suspender en 300 μL de 1x tampón Perm/Wash. Transfiera 100 μL de resuspensión de una sola célula (cada una de las cuales contiene 2,5-3 × 10⁵ células) a tres tubos de microfuga para el control sin tinción, el control del isotipo y la tinción de anticuerpos (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre la muestra de anticuerpos y dilución). Incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente y cubrir con papel de aluminio.
4. Centrifugar a 500 × g durante 3 min. Lavar dos veces con 500 μL de 1x tampón Perm/Wash. Vuelva a suspender las muestras en 100 μL de tampón FACS y analice las células teñidas (consulte la Tabla de materiales para la tinción intracelular de marcadores en etapas específicas) con un citómetro de flujo y un software (p. ej., FlowJo).
   NOTA: Si las muestras no se analizan inmediatamente, guárdelas a 4 °C protegidas de la luz. Para la estrategia de compuertas, los datos de flujo se controlan primero mediante propiedades de dispersión (FSC-A y SSC-A) para eliminar pequeños desechos celulares, seguidas de propiedades de ancho FSC-A y FSC para identificar singletes. La activación positiva y negativa se determina mediante controles de células madre y/o controles de isotipo sin teñir.

6. Inmunotinción de montaje completo

1. Recoja los racimos en un tubo de microfuga. Asentamiento de cúmulos por gravedad. Aspirar el medio gastado y enjuagar una vez con 1 mL de PBS (con calcio y magnesio). Fije los racimos con 1 ml de PFA al 4% a 4 °C durante la noche.
2. Enjuagar una vez con PBST y permeabilizar 20-30 racimos con 500 μL de TritonX-100 al 0,3% en un tubo de microfuga a temperatura ambiente durante al menos 6 h en un agitador basculante.
   NOTA: Se necesita un tiempo de permeabilización más largo (hasta 24 h) para racimos grandes.
3. Incubar los racimos en 100 μL de tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h en un agitador basculante. Retire el tampón de bloqueo e incube los grupos con 100 μl de anticuerpos primarios diluidos en tampón de dilución de anticuerpos a temperatura ambiente durante la noche en un agitador basculante.
   NOTA: Si el fondo es fuerte durante la toma de imágenes, incubar con anticuerpos primarios a 4 °C.
4. Lavar 3 x 30 min con 500 μL de PBST a fondo en un agitador basculante (ángulo de inclinación ajustado a 8, velocidad ajustada a 20).
5. Incubar los grupos con 100 μL de anticuerpos secundarios en tampón de dilución de anticuerpos a temperatura ambiente durante la noche en un agitador basculante. Cubre los tubos con papel de aluminio.
   NOTA: Si el fondo es fuerte durante la toma de imágenes, incubar con anticuerpos secundarios a 4 °C.
6. Enjuague una vez con 500 μL de PBST. Añadir 100 μL de solución de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (10 μg/mL en PBST) y teñir a temperatura ambiente durante 10-15 min. Cubra con papel de aluminio y proteja de la luz.
7. Lavar 3 x 30 min con 500 μL de PBST a fondo en un agitador basculante. Cubra los tubos con papel de aluminio durante el paso de lavado.
8. Coloque los grupos en portaobjetos de la cámara de imágenes (consulte la Tabla de materiales) prerecubiertos con adhesivo tisular de acuerdo con el protocolo del fabricante y los protocolos publicados^20,21.
9. Montar con medio de limpieza de tejidos (80% de glicerol en solución de PBS) y cubrir con cubreobjetos de vidrio. Proteger de la luz hasta la obtención de imágenes confocal.
   NOTA: Si las muestras no se toman imágenes inmediatamente, guárdelas a 4 °C protegidas de la luz.

7. Ensayo GSIS estático

1. Calentar el tampón de bicarbonato Ringer de Kreb (3,3 g de KRB) bajo en glucosa, el tampón de KRB con alto contenido de glucosa (16,7 g) y el tampón KCl KRB de 30 mM en un baño a 37 °C.
2. Elija a mano los racimos del mismo tamaño y enjuague con 2 ml de tampón tibio de 3,3 g de KRB. Transfiera los racimos a una placa de 6 pocillos no tratada con cultivo de tejidos y equilibre en tampón KRB de 2 ml o 3,3 g tibio durante 1 h en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ .
3. Después del equilibrio, llene la cámara de ensayo (consulte la Tabla de materiales) con 100 μL de tampón KRB tibio de 3,3 G. Elija a mano cinco grupos y transfiéralos al centro de la cámara de ensayo. Incubar durante 30 min en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ .
   NOTA: Utilice puntas de pipeta de 10 μL para transferir grupos con un volumen medio mínimo.
4. Recoja cuidadosamente ~100 μL del sobrenadante y guárdelo a -30 °C hasta la medición de la secreción basal de insulina (ver paso 7.9). No seque ni pierda ningún racimo en este paso. Añadir inmediatamente 100 μL de tampón KRB tibio de 16,7 g en la cámara de ensayo e incubar los mismos racimos durante 30 min en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ .
5. Recoja cuidadosamente ~100 μL del sobrenadante y guárdelo a -30 °C hasta la medición de la secreción de insulina estimulada por la glucosa (ver paso 7.9). Añadir inmediatamente 100 μL de tampón KCl KRB tibio de 30 mM en la cámara de ensayo e incubar los mismos racimos durante 30 min en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO₂ .
6. Recoja cuidadosamente ~100 μL del sobrenadante y guárdelo a -30 °C hasta la medición de la secreción de insulina estimulada por KCl (ver paso 7.9). Agregue inmediatamente 100 μL de tampón de lisis RIPA a la cámara de ensayo y transfiera el tampón de lisis que contiene los cinco grupos a un tubo de microfuga.
7. Opcional) Rompa los racimos manualmente mediante una trituración vigorosa con una punta de pipeta P200. Vórtice durante 30 s e incube en hielo durante 30 minutos, seguido de otros 30 s de vórtice.
   NOTA: Asegure la lisis completa por vórtice y un tiempo suficiente de incubación en hielo.
8. Girar a 8.000 × g durante 1 min. Recoger el sobrenadante y almacenar a -30 °C hasta la medición del contenido total de insulina (ver paso 7.9).
9. Medir la insulina humana en las muestras sobrenadantes utilizando un kit ELISA de insulina humana de acuerdo con el protocolo del fabricante y los protocolos publicados^20,22.
   NOTA: Evite la congelación y descongelación repetida de las muestras sobrenadantes. No se deben analizar muestras con más de tres ciclos de congelación y descongelación.

Resultados

Desarrollamos una estrategia híbrida para diferenciar las células madre en islotes hPSC secretores de insulina en siete pasos, que utiliza un kit progenitor pancreático para las primeras cuatro etapas en cultivo plano, seguido de un protocolo modificado basado en un método 6 previamente informado en un cultivo^{estático en suspensión} para las últimas tres etapas (Figura 1). Con este protocolo, asegurar un cultivo cercano a la confluencia (90%-100%) a las 24 h des...

Discusión

En este trabajo se describe un protocolo híbrido de siete etapas que permite la generación de islotes hPSC capaces de secretar insulina tras la exposición a la glucosa dentro de los 40 días posteriores al cultivo in vitro. Entre estos múltiples pasos, se cree que la inducción eficiente del endodermo definitivo establece un punto de partida importante para los resultados finales de diferenciación^18,27,28. En el pr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma	T6397	Thyroid hormone
4% PFA solution	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom	Corning Costar (VWR)	CLS3474	Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates	STEMCELL Technologies	34415	400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates	STEMCELL Technologies	34815	800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)	R&D Systems	IC2400G	1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control	R&D Systems	IC108G	1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)	BD Sciences	566032	1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control	R&D Systems	IC0041G	1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)	BD Pharmingen	565831	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565689	1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	563338	1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	562594	1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	557714	1:50 in flow cytometry
ALK5i II	Cayman Chemicals	14794	TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Microwell Rinsing Solution
Assay chamber	Cellvis	D35-10-1-N	For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	BP1600-100	For immunostaining procedure
CK19 antibody	DAKO	M0888	1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose	Sigma	G8769	Medium supplement
DAPI	Sigma	D9542	For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330032	Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555	Life technologies	A21432	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647	Life technologies	A21447	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555	Life technologies	A31570	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Life technologies	A31571	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555	Life technologies	A31572	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647	Life technologies	A31573	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647	Life technologies	A21448	1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS	Sigma	D8537	Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human	Alpco	80-INSHU-E01.1	For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA	Proliant	68700	Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit	BD Sciences	554714	Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody	Sigma	G2654	1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA1-37782	1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)	Gibco	35050061	L-glutamine supplement
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-4	For tissue clearing and mounting
GSi XX	Sigma Millipore	565789	Notch inhibitor
Heparin	Sigma	H3149	Medium supplement
ITS-X (100x)	Thermo Fisher Scientific	51500056	Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189	STEMCELL Technologies	72147	BMP antagonist
MAFA antibody	Abcam	ab26405	1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium	Life technologies	10372019	Base medium
mTeSR1 Complete Kit	STEMCELL Technologies	85850	stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)	Sigma	A9165	Antioxidant
NaHCO3	Sigma	S6297	Medium supplement
NEUROD1 antibody	R&D Systems	AF2746	1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody	DSHB	F55A12-c	1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody	R&D Systems	AF6297	1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS	Sigma	D8662	With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody	Abcam	ab47267	1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565860	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	563023	1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	562161	1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	554680	1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)	BD Sciences	564563	1:200 in flow cytometry
R428	Cayman Chemicals	21523	AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans	Sigma	R2625	Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x	Sigma	20-188	For hormone extraction
SANT-1	Sigma	S4572	SHH inhibitor
SLC18A1 antibody	Sigma	HPA063797	1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody	Sigma	HPA019472	1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit	STEMCELL Technologies	05120	Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody	Novus	NB120-16659	1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100	Sigma	X100	For permeabilization
Trolox	Sigma Millipore	648471	Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express	Life technologies	12604-021	cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody	R&D Systems	AF3586	1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304	ROCK inhibitor
Zinc sulfate	Sigma	Z0251	Medium supplement