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摘要

干细胞分化为胰岛细胞为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了另一种解决方案。我们描述了一种详细的干细胞培养方案，该方案将商业分化试剂盒与先前验证的方法相结合，以帮助在培养皿中产生分泌胰岛素的干细胞衍生胰岛。

摘要

人类多能干细胞 （hPSC） 分化为分泌胰岛素的 β 细胞为研究 β 细胞功能和糖尿病治疗提供了材料。然而，在获得充分模拟天然人类β细胞的干细胞衍生的β细胞方面仍然存在挑战。在先前研究的基础上，已经生成了 hPSC 衍生的胰岛细胞，以创建具有改进的分化结果和一致性的方案。这里描述的方案在第 1-4 阶段使用胰腺祖细胞试剂盒，然后在第 5-7 阶段使用根据 2014 年发表的论文修改的方案（以下简称"R 协议"）。包括使用胰祖细胞试剂盒和 400 μm 直径微孔板生成胰祖细胞簇的详细程序、用于 96 孔静态悬浮形式内分泌分化的 R 方案，以及 hPSC 衍生胰岛的 体外 表征和功能评估。完整的方案需要 1 周进行初始 hPSC 扩增，然后需要 ~5 周才能获得产生胰岛素的 hPSC 胰岛。具有基本干细胞培养技术和生物测定培训的人员可以重现该协议。

引言

胰腺β细胞分泌胰岛素，对血糖水平的升高做出反应。由于 1 型糖尿病 （T1D）1 中 β 细胞的自身免疫性破坏或 2 型糖尿病 （T2D）2 中 β 细胞功能障碍而缺乏足够胰岛素分泌的患者通常使用外源性胰岛素进行治疗。尽管这种疗法可以挽救生命，但它无法精确地与真正的β细胞动态分泌胰岛素所实现的血糖精确控制相媲美。因此，患者经常遭受危及生命的低血糖发作和慢性高血糖波动引起的其他并发症的后果。人类尸体胰岛的移植成功地恢复了 T1D 患者的严格血糖控制，但受到胰岛供体可用性和纯化健康胰岛进行移植的困难的限制 3,4。原则上，这一挑战可以通过使用hPSC作为替代起始材料来解决。

目前在体外从 hPSC 产生胰岛素分泌胰岛的策略通常旨在模拟体内胚胎胰腺发育的过程 5,6。这需要了解负责任的信号通路，并定时添加相应的可溶性因子，以模拟发育中的胚胎胰腺的关键阶段。胰腺程序从确定的内胚层开始，其标志是转录因子叉头盒 A2 （FOXA2） 和性别决定区 Y-box 17 （SOX17）7。最终内胚层的连续分化包括形成原始肠管，形成表达胰腺和十二指肠同源框 1 （PDX1）7,8,9 的后前肠，以及上皮扩张为共表达 PDX1 和 NK6 同源框 1 （NKX6.1）10,11 的胰腺祖细胞。

对内分泌胰岛细胞的进一步承诺伴随着促内分泌主调节因子神经原蛋白-3 （NGN3）12 的瞬时表达以及关键转录因子神经元分化 1 （NEUROD1） 和 NK2 同源框 2 （NKX2.2） 13 的稳定诱导。随后对主要的激素表达细胞进行编程，例如产生胰岛素的 β 细胞、产生胰高血糖素的 α 细胞、产生生长抑素的 delta 细胞和产生胰腺多肽的 PPY 细胞。凭借这些知识，以及广泛的高通量药物筛选研究的发现，最近的进展使 hPSC 胰岛能够产生类似于 β 细胞的细胞，能够分泌胰岛素 14,15,16,17,18,19。

已经报道了产生葡萄糖反应性 β 细胞的分步方案 6,14,18,19。基于这些研究，本方案涉及使用胰腺祖细胞试剂盒在平面培养物中产生 PDX1+/NKX6.1+ 胰腺祖细胞，然后将微孔板聚集成大小均匀的簇，并在静态 3D 悬浮培养物中使用 R 方案进一步分化为分泌胰岛素的 hPSC 胰岛。进行质量控制分析，包括流式细胞术、免疫染色和功能评估，以严格表征分化细胞。本文详细介绍了定向分化的每个步骤，并概述了体外表征方法。

研究方案

该协议基于在无饲养层条件下使用 hPSC 系，包括 H1、HUES4 PDXeG 和 Mel1 INSGFP/W。本节详细介绍了分步过程，并在代表性结果部分提供了来自Mel1 INSGFP/W 区分的支持数据。我们建议在使用此处未说明的其他 hPSC 细胞系时需要进一步优化。有关本方案中使用的所有试剂和溶液的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 分化培养基及溶液的制备

注:有关要制备的所有溶液，请参见表 1 ，有关分化培养基，请参见 表2 。

  1. 在无菌生物安全柜中制备用于细胞培养的所有培养基和试剂。使用前，将细胞培养相关溶液和基础培养基在浴中短暂加热至37°C。
    注意:如下所述，每天通过添加补充剂来制作新鲜的分化培养基，并在同一天使用。或者，胰腺祖细胞试剂盒提供了提前制备更大体积的选项，可以按照制造商的方案在几天内使用。事实证明，这两种培养基制备方法都行之有效。请注意，不建议将培养基长时间留在水浴中。每天准备新鲜培养基时，建议等分补充剂以避免反复冻融循环。

2. hPSCs分化为胰腺祖细胞

  1. 在mTeSR1完全培养基中维持基质胶包被血管上的未分化hPSC，并每天进行培养基更换。在维持培养期间，当细胞达到 ~70% 汇合度时，每 3-4 天传代一次 hPSC，使用遵循制造商方案的细胞解离试剂。为了开始分化，将细胞解离成单细胞，并将它们接种到6孔或12孔组织培养处理的板上（每孔的培养基体积分别为2 mL或1 mL）。
    注意:有关内胚层基础培养基及其等分试样的储存相关说明，请参见 表 1 。
  2. 用符合hESC标准的基质胶（按照制造商的方案在冰冷的DMEM / F12中稀释）预包被培养孔，并将板置于潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中30分钟。
  3. 将基质胶包被的板移至室温（在3小时内使用）。
  4. 从 hPSC 培养物中吸出用过的培养基，并用 DPBS 冲洗一次。在37°C下用细胞解离酶将hPSC培养物解离到单细胞中3-5分钟。加入温热的 DMEM/F12 培养基冲洗细胞，转移到 15 mL 或 50 mL 锥形管中，并以 300 × g 旋转 5 分钟。
  5. 用干细胞完全培养基加10μM Y-27632重悬细胞沉淀，并用血细胞计数器或自动细胞计数仪进行活细胞（台盼蓝阴性）计数。吸出稀释的基质胶，并立即在基质凝胶包被的孔上以1.60-1.80×105 /cm 2的密度接种活细胞，并在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。进入第 1 阶段。
    注意:这将导致 ~95% 的起始汇合以启动分化。根据制造商的协议，建议接种密度为 2.6 × 105/cm2 。建议测试各种接种密度，以确定细胞系的最佳值并检查细胞活力。如果存活率低于 80%，则不要进行分化。细胞活力低可能是由于收获过程中过度消化或过度研磨，或在接种前将细胞长时间留在 DMEM/F12 培养基中。
  6. 在第 1 阶段第 1 天，在浴中短暂加热内胚层基础培养基至 37°C 并解冻补充 MR 和 CJ。通过向内胚层基础培养基中加入补充 MR 和 CJ 来制备 1A 期培养基。搅拌均匀，立即使用。
  7. 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 1A培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
    注意: 洗涤步骤是不必要的。在培养基更换前轻轻摇晃培养板，从培养物中去除任何未附着的细胞。在培养基去除过程中，不要将移液器吸头接触孔底，并通过温和的培养基添加，避免破坏单层。
  8. 在第 1 阶段第 2 天，在 37 °C 浴中短暂加热内胚层基础培养基并解冻补充剂 CJ。通过向内胚层基础培养基中加入补充CJ来制备1B期培养基。搅拌均匀，立即使用。
  9. 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 1B培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
  10. 在第 1 阶段第 3 天，重复步骤 2.8-2.9。进入 第 2 阶段。
  11. 在第 2 阶段第 1 天，在 37 °C 浴中加热胰腺 2-4 期基础培养基并解冻补充剂 2A 和 2B。 通过将补充剂 2A 和 2B 添加到胰腺 2-4 期基础培养基中来制备 2A 期培养基。搅拌均匀，立即使用。
  12. 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 2A培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
  13. 在第 2 阶段第 2 天，在 37 °C 浴中加热胰腺 2-4 期基础培养基并解冻补充剂 2B。 通过将补充剂 2B 添加到胰腺 2-4 期基础培养基中来制备 2B 期培养基。搅拌均匀，立即使用。
  14. 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 2B培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
  15. 在第 2 阶段第 3 天，重复步骤 2.13-2.14。进入 第 3 阶段。
  16. 在第 3 阶段第 1 天，在 37 °C 浴中加热胰腺阶段 2-4 基础培养基并解冻补充剂 3。通过将补充剂 3 添加到胰腺 2-4 期基础培养基中来制备第 3 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
  17. 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 3培养基，并在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
  18. 在第 3 阶段第 2 天和第 3 天，重复步骤 2.16-2.17。进入 第 4 阶段。
  19. 在第 4 阶段第 1 天，在 37 °C 浴中加热胰腺 2-4 阶段基础培养基并解冻补充剂 4。通过将补充剂 4 添加到胰腺 2-4 期基础培养基中来制备第 4 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
  20. 从孔中吸出用过的培养基，加入Stage 4培养基，并在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
  21. 在第 4 阶段第 2 天到第 4 天，重复步骤 2.19-2.20。继续执行聚合步骤。

3. 使用直径为 400 μm 的微孔板聚集成胰腺祖细胞簇

  1. 在第 4 阶段第 5 天，每孔用 500 μL 抗粘附冲洗溶液预处理微孔（例如，24 孔板形式）。
  2. 制备平衡板并将微孔板以1,300× g 离心5分钟。
    注意:在显微镜下检查板，以确保微孔中没有气泡。如果气泡仍被困在任何微孔中，则再次离心5分钟。
  3. 从孔中吸出抗粘附冲洗液，并用 1 mL DPBS 冲洗一次。从孔中吸出 DPBS，并向每个孔中加入 1 mL 聚集培养基。
  4. 从胰腺祖细胞培养物中取出用过的培养基，并用DPBS洗涤一次。用解离试剂在37°C下将培养物解离成单细胞10-12分钟。用温热的DMEM / F12冲洗细胞，将它们转移到管中，并以300× g 旋转5分钟。
  5. 将细胞沉淀重悬于聚集培养基中并进行活细胞计数。接种每孔 2.4-360 万个细胞（即每微孔 2,000-3,000 个细胞），并向每个孔中加入聚集培养基，以达到每孔 2 mL 的最终体积。
  6. 用P1000移液器吸头轻轻地上下移液细胞数次，以确保细胞在整个孔中均匀分布。不要将气泡引入微孔中。将微孔板以300× g 离心5分钟，以捕获微孔中的细胞。将微孔板在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时，并进行第5-7阶段分化。
    注意: 注意不要在聚集期间打扰板。可能需要长达 48 小时的孵育时间才能实现最佳聚集体形成。

4. 试剂盒衍生的胰腺祖细胞簇分化为hPSC胰岛

  1. 在第5阶段第1天，在37°C浴中加热第 5-7阶段的基础培养基并解冻补充剂（见表 1 和 表2）。通过向 5-7 期基础培养基中添加添加剂（至最终工作浓度）来制备第 5 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
  2. 聚集体形成后，用P1000移液器吸头轻轻地上下移液聚集体数次，以浮动任何未聚集的细胞。让聚集体在重力作用下沉降（等待~1分钟）。尽可能轻轻地从孔中取出用过的培养基（含有漂浮的非聚集细胞），同时避免吸出聚集体。
  3. 将新鲜的 Stage 5 培养基用力分配到微孔板的表面上，以从微孔中去除聚集体。将聚集体转移到超低附着 （ULA） 6 孔中。用Stage 5培养基冲洗一次，以从微孔中完全回收聚集体。
  4. 收集 ULA 6 孔中的所有聚集体，将聚集体重悬于 Stage 5 培养基中，并将密度调整为每 100 μL 20 个簇（例如，预计从每个孔中回收 ~1,200 个簇。将 1,200 个簇重悬于 6 mL 第 5 阶段培养基中）。使用多通道移液器将 50 μL 第 5 阶段培养基分配到 ULA 平底 96 孔板的每个孔中。用 200 μL DPBS 填充角孔和边缘孔。
    注意:避免使用边缘孔培养聚集体，因为它们容易蒸发更多;否则，使用设计用于最大限度地减少沿边缘蒸发的 96 孔板（例如，带有内置护城河的 96 孔板）或将培养板置于高湿度微气候细胞培养箱中。
  5. 将 100 μL 簇重悬液加入 ULA 平底 96 孔板的每个孔中，得到总共 150 μL 培养基，平均每孔含有 20 个簇。
    注意:在分配到 96 孔中之前，每次轻轻混合簇重悬液。
  6. 将培养板放在湿润的37°C，5%CO2 培养箱中的水平表面上24小时。
  7. 在第 5 阶段第 2 天，按照步骤 4.1 制备第 5 阶段培养基。
  8. 使用多通道移液器从每个孔中取出~90 μL用过的培养基，并用100 μL Stage 5培养基刷新。
  9. 在第 5 阶段第 3 天，重复步骤 4.7-4.8。进入 第 6 阶段。
  10. 在第 6阶段第1天，在37°C浴中加热第5-7阶段的基础培养基并解冻补充剂（见表 1 和 表2）。通过向 5-7 期基础培养基中添加添加剂（至最终工作浓度）来制备第 6 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
  11. 使用多通道移液器取出 ~90 μL 用过的培养基，每孔用 100 μL 第 6 阶段培养基刷新。
  12. 在第 6 阶段第 2 天到第 8 天，重复步骤 4.10-4.11。进入 第 7 阶段。
  13. 在第7阶段第1天，在37°C浴中加热第 5-7阶段的基础培养基并解冻补充剂（见表 1 和 表2）。通过向第 5-7 阶段基础培养基中添加添加剂（至最终工作浓度）来制备第 7 阶段培养基。搅拌均匀，立即使用。
  14. 使用多通道移液器除去 ~90 μL 用过的培养基，每孔用 100 μL Stage 7 培养基刷新。
  15. 在第 7 阶段第 2 天到第 12 天，重复步骤 4.13-4.14。继续进行 体外 表征。

5. 流式细胞术分析

  1. 取出培养基并用DPBS洗涤一次。通过在37°C下孵育10-12分钟，将培养物（平面祖细胞或分化簇）解离为单细胞。用FACS缓冲液冲洗并以300× g 旋转5分钟。
  2. 将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中并进行细胞计数。以 300 × g 旋转细胞 5 分钟。在室温下将单个细胞重悬于 500 μL 固定/Perm 缓冲液中 10 分钟。
    注意:使用前将 Fix/Perm 缓冲液置于室温。Fix/Perm 缓冲液含有多聚甲醛 （PFA）。小心地在通风橱中处理 PFA，并按照机构指南进行处理。
  3. 以 500 × g 旋转 3 分钟，用 500 μL 1x Perm/Wash 缓冲液洗涤两次，然后重悬于 300 μL 1x Perm/Wash 缓冲液中。将 100 μL 单细胞重悬液（每个含有 2.5-3 × 105 个细胞）转移到三个微量离心管中，用于未染色对照、同种型对照和抗体染色（样品抗体和稀释信息参见 材料表 ）。在室温下孵育45分钟，并用箔覆盖。
  4. 以 500 × g 旋转 3 分钟。用 500 μL 1x Perm/Wash 缓冲液洗涤两次。将样品重悬于100μL的FACS缓冲液中，并用流式细胞仪和软件（例如FlowJo）分析染色的细胞（参见特定阶段标记物细胞内染色 的材料表 ）。
    注意:如果未立即测定样品，请将其储存在避光的 4°C 下。对于门控策略，首先通过散射特性（FSC-A 和 SSC-A）对流动数据进行门控，以去除小的细胞碎片，然后通过 FSC-A 和 FSC 宽度特性来识别单线态。阳性和阴性门控由干细胞对照和/或未染色的同型对照确定。

6. 全挂片免疫染色

  1. 将簇收集在微量离心管中。通过重力沉降集群。吸出用过的培养基，并用 1 mL PBS（含钙和镁）冲洗一次。用 1 mL 4% PFA 在 4°C 下固定簇过夜。
  2. 用PBST冲洗一次，并在环境温度下在微量离心管中用500μL0.3%TritonX-100在倾斜振荡器上透化20-30簇至少6小时。
    注意:大型簇需要更长的透化时间（长达 24 小时）。
  3. 将簇在环境温度下在100μL封闭缓冲液中在倾斜振荡器上孵育1小时。取出封闭缓冲液，并将簇与在室温下在抗体稀释缓冲液中稀释的 100 μL 一抗在倾斜振荡器上孵育过夜。
    注意:如果成像过程中背景很强，请与一抗在4°C下孵育。
  4. 在倾斜振荡器上用 500 μL PBST 彻底洗涤 3 x 30 分钟（倾斜角度设置为 8，速度设置为 20）。
  5. 将簇与100μL二抗在抗体稀释缓冲液中在室温下在倾斜振荡器上孵育过夜。用箔纸盖住管子。
    注意:如果成像过程中背景很强，请在4°C下与二抗一起孵育。
  6. 用 500 μL PBST 冲洗一次。加入 100 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 溶液（10 μg/mL 的 PBST 溶液），并在室温下染色 10-15 分钟。用箔纸盖住并避光。
  7. 在倾斜摇床上用 500 μL PBST 彻底洗涤 3 x 30 分钟。在洗涤步骤中用箔纸盖住管子。
  8. 根据制造商的方案和公布的方案20,21，将簇连接到预涂有组织粘合剂的成像室载玻片（参见材料表）上。
  9. 用组织透明培养基（PBS溶液中的80%甘油）安装，并用玻璃盖玻片盖住。在共聚焦成像之前避光。
    注意:如果样品未立即成像，请将其储存在避光的4°C下。

7. 静态GSIS测定

  1. 在37°C浴中加热低葡萄糖Kreb's Ringer碳酸氢盐（3.3G KRB）缓冲液，高葡萄糖（16.7G）KRB缓冲液和30mM KCl KRB缓冲液。
  2. 手工挑选大小匹配的簇，并用 2 mL 温热的 3.3G KRB 缓冲液冲洗。将簇转移到非组织培养处理的6孔板中，并在2mL或温热的3.3G KRB缓冲液中在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中平衡1小时。
  3. 平衡后，用 100 μL 温热的 3.3G KRB 缓冲液填充测定室（参见 材料表）。手动挑选五个簇并将它们转移到测定室的中心。在加湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育30分钟。
    注意:使用 10 μL 移液器吸头以最小的培养基体积转移簇。
  4. 小心地收集~100μL上清液并将其储存在-30°C，直到测量基础胰岛素分泌（参见步骤7.9）。在此步骤中，不要干燥或丢失任何簇。立即将100μL温热的16.7G KRB缓冲液加入测定室中，并在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育相同的簇30分钟。
  5. 小心地收集~100μL上清液并将其储存在-30°C，直到测量葡萄糖刺激的胰岛素分泌（参见步骤7.9）。立即将100μL温热的30mM KCl KRB缓冲液加入测定室中，并在潮湿的37°C，5%CO2 培养箱中孵育相同的簇30分钟。
  6. 小心地收集~100μL上清液并储存在-30°C，直到测量KCl刺激的胰岛素分泌（参见步骤7.9）。立即向测定室中加入 100 μL RIPA 裂解缓冲液，并将含有所有五个簇的裂解缓冲液转移到微量离心管中。
  7. 可选）用P200移液器吸头通过剧烈研磨手动打破簇。涡旋 30 秒，在冰上孵育 30 分钟，然后再涡旋 30 秒。
    注意:通过涡旋和足够的冰孵育时间确保完全裂解。
  8. 以 8,000 × g 旋转 1 分钟。收集上清液并储存在-30°C直至测量总胰岛素含量（参见步骤7.9）。
  9. 根据制造商的方案和公布的方案20,22，使用人胰岛素ELISA试剂盒测量上清液样品中的人胰岛素。
    注意:避免上清液样品反复冻融。不应测定超过三个冻融循环的样品。

结果

我们开发了一种混合策略，通过七个步骤将干细胞分化为分泌胰岛素的 hPSC 胰岛，该策略在平面培养的前四个阶段使用胰腺祖细胞试剂盒，然后在最后三个阶段的静态悬浮培养中以先前报道的方法6 为基础（图 1).使用该方案，确保在细胞接种后 24 小时（第 0 阶段）进行接近汇合 （90%-100%） 的培养对于启动大多数 hPSC 系的有效分化至关重要（

讨论

本文描述了一种七阶段混合方案，该方案允许在体外培养后 40 天内产生能够在葡萄糖激发时分泌胰岛素的 hPSC 胰岛。在这些多个步骤中，有效诱导最终内胚层被认为为最终分化结果设定了重要的起点 18,27,28。在制造商的方案中，建议接种密度为2.6×105 / cm 2以启动分化，并将细胞暴露于第1阶段培养基中2?...

披露声明

Timothy J. Kieffer 在准备这份手稿时是 ViaCyte 的一名员工。其他作者声明没有竞争利益。

致谢

我们非常感谢 STEMCELL Technologies、Michael Smith Health Research BC、Stem Cell Network、JDRF 和加拿大卫生研究院的支持。Jia Zhao 和 Shenghui Liang 是 Michael Smith Health Research BC 实习生奖的获得者。Mitchell J.S. Braam 是 Mitacs Accelerate Fellowship 的获得者。Diepiriye G. Iworima 是 Alexander Graham Bell 加拿大研究生奖学金和 CFUW 1989 年巴黎综合理工学院纪念奖的获得者。我们衷心感谢来自MCRI和莫纳什大学的Edouard G. Stanley博士分享Mel1 INS GFP / W 系和阿尔伯塔省糖尿病研究所胰岛核心分离和分布人类胰岛。我们还要感谢不列颠哥伦比亚大学生命科学研究所成像和流式细胞术设施的支持。 图 1 是使用 BioRender.com 创建的。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397Thyroid hormone
4% PFA solutionSanta Cruz Biotechnologysc-281692Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottomCorning Costar (VWR)CLS3474Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 platesSTEMCELL Technologies34415400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 platesSTEMCELL Technologies34815800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)R&D SystemsIC2400G1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR&D SystemsIC108G1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR&D SystemsIC0041G1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010Microwell Rinsing Solution
Assay chamberCellvisD35-10-1-NFor static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100For immunostaining procedure
CK19 antibodyDAKOM08881:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucoseSigmaG8769Medium supplement
DAPISigmaD9542For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in whole mount immunofluorescence
DPBSSigmaD8537Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, humanAlpco80-INSHU-E01.1For human insulin measurement
Fatty acid-free BSAProliant68700Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution KitBD Sciences554714Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies7174For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibodySigmaG26541:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibodyThermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-glutamine supplement
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4For tissue clearing and mounting
GSi XXSigma Millipore565789Notch inhibitor
HeparinSigmaH3149Medium supplement
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP antagonist
MAFA antibodyAbcamab264051:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualifiedThermo Fisher Scientific08-774-552Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 mediumLife technologies10372019Base medium
mTeSR1 Complete KitSTEMCELL Technologies85850stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3SigmaS6297Medium supplement
NEUROD1 antibodyR&D SystemsAF27461:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibodyDSHBF55A12-c1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibodyR&D SystemsAF62971:200 in whole mount immunofluorescence
PBSSigmaD8662With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibodyAbcamab472671:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)BD Sciences5630231:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BD Sciences5621611:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5546801:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)BD Sciences5645631:200 in flow cytometry
R428 Cayman Chemicals21523AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-transSigmaR2625Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10xSigma20-188For hormone extraction
SANT-1SigmaS4572SHH inhibitor
SLC18A1 antibodySigmaHPA0637971:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibodySigmaHPA0194721:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor KitSTEMCELL Technologies05120Basal media and supplements included
Synaptophysin antibodyNovusNB120-166591:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100SigmaX100For permeabilization
Trolox Sigma Millipore648471Vitamin E analog
TrypLE Enzyme ExpressLife technologies12604-021cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibodyR&D SystemsAF35861:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK inhibitor
Zinc sulfateSigmaZ0251Medium supplement

参考文献

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