Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

Riepilogo

La differenziazione delle cellule staminali in cellule insulari fornisce una soluzione alternativa al trattamento convenzionale del diabete e alla modellizzazione della malattia. Descriviamo un protocollo dettagliato di coltura di cellule staminali che combina un kit di differenziazione commerciale con un metodo precedentemente convalidato per aiutare a produrre isole derivate da cellule staminali secernenti insulina in un piatto.

Abstract

La differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in cellule beta secernenti insulina fornisce materiale per studiare la funzione delle cellule beta e il trattamento del diabete. Tuttavia, permangono sfide nell'ottenere cellule beta derivate da cellule staminali che imitano adeguatamente le cellule beta umane native. Sulla base di studi precedenti, sono state generate cellule insulari derivate da hPSC per creare un protocollo con risultati di differenziazione e coerenza migliorati. Il protocollo qui descritto utilizza un kit di progenitori pancreatici durante le fasi 1-4, seguito da un protocollo modificato da un articolo precedentemente pubblicato nel 2014 (denominato "protocollo R" di seguito) durante le fasi 5-7. Sono incluse procedure dettagliate per l'utilizzo del kit di progenitori pancreatici e piastre a micropozzetti da 400 μm di diametro per generare cluster di progenitori pancreatici, protocollo R per il differenziamento endocrino in un formato di sospensione statica a 96 pozzetti e caratterizzazione in vitro e valutazione funzionale di isole derivate da hPSC. Il protocollo completo richiede 1 settimana per l'espansione iniziale delle hPSC, seguita da ~5 settimane per ottenere le isole hPSC produttrici di insulina. Il personale con tecniche di coltura di base di cellule staminali e formazione in saggi biologici può riprodurre questo protocollo.

Introduzione

Le cellule beta pancreatiche secernono insulina rispondendo all'aumento dei livelli di glucosio nel sangue. I pazienti che non hanno una produzione sufficiente di insulina a causa della distruzione autoimmune delle cellule beta nel diabete di tipo 1 (T1D)¹, o a causa della disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 (T2D)², sono in genere trattati con la somministrazione di insulina esogena. Nonostante questa terapia salvavita, non può eguagliare con precisione lo squisito controllo della glicemia ottenuto dalla secrezione dinamica di insulina dalle cellule beta in buona fede. Pertanto, i pazienti spesso subiscono le conseguenze di episodi ipoglicemici potenzialmente letali e altre complicanze derivanti da escursioni iperglicemice croniche. Il trapianto di isole da cadavere umano ripristina con successo uno stretto controllo glicemico nei pazienti con diabete di tipo 1, ma è limitato dalla disponibilità di donatori di isole e dalle difficoltà nel purificare le isole sane per il trapianto ^3,4. Questa sfida può, in linea di principio, essere risolta utilizzando le hPSC come materiale di partenza alternativo.

Le attuali strategie per la generazione di isole che secernono insulina da hPSC in vitro spesso mirano a imitare il processo di sviluppo del pancreas embrionale in vivo ^5,6. Ciò richiede la conoscenza delle vie di segnalazione responsabili e l'aggiunta temporizzata di fattori solubili corrispondenti per imitare le fasi critiche del pancreas embrionale in via di sviluppo. Il programma pancreatico inizia con l'impegno nell'endoderma definitivo, che è caratterizzato dai fattori di trascrizione forkhead box A2 (FOXA2) e dalla regione Y-box 17 che determina il sesso (SOX17)⁷. La differenziazione successiva dell'endoderma definitivo comporta la formazione di un tubo intestinale primitivo, che si sviluppa in un intestino anteriore posteriore che esprime l'omeobox pancreatico e duodenale 1 (PDX1)^7,8,9 e l'espansione epiteliale nei progenitori pancreatici che co-esprimono PDX1 e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)^10,11.

Un ulteriore impegno per le cellule delle isole endocrine è accompagnato dall'espressione transitoria della neurogenina-3 (NGN3)12 e dall'induzione stabile dei fattori di trascrizione chiave della differenziazione neuronale 1 (NEUROD1) e dell'homeobox 2 NK2 (^NKX2.2)¹³. Le principali cellule che esprimono ormoni, come le cellule beta produttrici di insulina, le cellule alfa produttrici di glucagone, le cellule delta produttrici di somatostatina e le cellule PPY produttrici di polipeptidi pancreatici, vengono successivamente programmate. Con questa conoscenza, così come le scoperte di studi di screening farmacologico estesi e ad alto rendimento, i recenti progressi hanno permesso la generazione di isole hPSC con cellule simili alle cellule beta in grado di secernere insulina 14,15,16,17,18,19.

Sono stati riportati protocolli graduali per la generazione di cellule beta^sensibili al glucosio 6,14,18,19. Sulla base di questi studi, il presente protocollo prevede l'uso di un kit di progenitori pancreatici per la generazione di cellule progenitrici pancreatiche PDX1+/NKX6.1⁺ in una coltura planare, seguita dall'aggregazione di piastre a micropozzetti in cluster di dimensioni uniformi e da un'ulteriore differenziazione verso le isole hPSC secernenti insulina con il protocollo R in una coltura statica in sospensione 3D. Vengono eseguite analisi di controllo della qualità, tra cui citometria a flusso, immunocolorazione e valutazione funzionale, per una rigorosa caratterizzazione delle cellule differenzianti. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di ogni fase del differenziamento diretto e delinea gli approcci di caratterizzazione in vitro.

Protocollo

Questo protocollo si basa sul lavoro con linee hPSC, tra cui H1, HUES4 PDXeG e Mel1 INS^GFP/W, in condizioni di alimentazione libera. Una procedura passo-passo è descritta in dettaglio in questa sezione, con i dati di supporto della differenziazione di Mel1 INS^GFP/W nella sezione dei risultati rappresentativi. Si consiglia di eseguire un'ulteriore ottimizzazione quando si lavora con altre linee hPSC non indicate qui. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i reagenti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Preparazione dei mezzi e delle soluzioni di differenziazione

NOTA: Vedere la Tabella 1 per tutte le soluzioni da preparare e la Tabella 2 per i mezzi di differenziazione.

1. Preparare tutti i terreni e i reagenti per la coltura cellulare in una cabina sterile per la biosicurezza. Riscaldare brevemente le soluzioni relative alle colture cellulari e i terreni basali a 37 °C in un bagno prima dell'uso.
   NOTA: Come descritto di seguito, prepara ogni giorno nuovi mezzi di differenziazione aggiungendo integratori e usali lo stesso giorno. In alternativa, il kit di progenitori pancreatici offre la possibilità di preparare in anticipo un volume maggiore che può essere utilizzato per diversi giorni seguendo il protocollo del produttore. Entrambi i metodi per la preparazione dei supporti si rivelano efficaci. Si noti che non è consigliabile lasciare i supporti per un tempo prolungato a bagnomaria. Quando si preparano terreni freschi ogni giorno, si consiglia di aliquotare gli integratori per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo.

2. Differenziazione delle hPSCs in cellule progenitrici pancreatiche

1. Mantenere le hPSC indifferenziate sui vasi rivestiti di Matrigel nel terreno completo mTeSR1 ed eseguire cambi di terreno ogni giorno. Durante la coltura di mantenimento, le hPSC passano ogni 3-4 giorni quando le cellule raggiungono ~70% di confluenza utilizzando il reagente di dissociazione cellulare seguendo il protocollo del produttore. Per avviare la differenziazione, dissociare le cellule in singole cellule e seminarle su piastre trattate con coltura tissutale a 6 o 12 pozzetti (con volumi di terreno rispettivamente di 2 mL o 1 mL per pozzetto).
   NOTA: Vedere la Tabella 1 per le istruzioni relative alla conservazione del terreno basale dell'endoderma e delle sue aliquote.
2. Prerivestire i pozzetti di coltura con Matrigel qualificato hESC (diluito in DMEM/F12 ghiacciato come raccomandato dal protocollo del produttore) e porre la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ per 30 min.
3. Portare la piastra rivestita in Matrigel a temperatura ambiente (utilizzare entro 3 ore).
4. Aspirare il terreno esausto dalla coltura hPSC e risciacquare una volta con DPBS. Dissociare la coltura di hPSC in singole cellule con enzima di dissociazione cellulare a 37 °C per 3-5 minuti. Risciacquare le cellule aggiungendo un terreno caldo DMEM/F12, trasferire in una provetta conica da 15 mL o 50 mL e centrifugare a 300 × g per 5 min.
5. Risospendere il pellet cellulare con terreno completo di cellule staminali più 10 μM Y-27632 ed eseguire il conteggio delle cellule vive (tripano blu negativo) con un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Aspirare Matrigel diluito e seminare immediatamente cellule vive ad una densità di 1,60-1,80 × 10⁵/^cm2 su pozzetti rivestiti di Matrigel e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore. Procedere alla fase 1.
   NOTA: Ciò si tradurrà in una confluenza iniziale del ~95% per avviare la differenziazione. Secondo il protocollo del produttore, si consiglia una densità di semina di 2,6 × 10⁵/cm² . Si consiglia di testare varie densità di semina per determinare il valore ottimale per una linea cellulare e per verificare la vitalità cellulare. Se la redditività è inferiore all'80%, non procedere con la differenziazione. La bassa vitalità cellulare può essere il risultato di un'eccessiva digestione o di un'eccessiva triturazione durante la raccolta o di lasciare le cellule per un tempo prolungato nel terreno DMEM/F12 prima della semina.
6. Nella fase 1 giorno 1, riscaldare brevemente il mezzo basale dell'endoderma a 37 °C in un bagno e scongelare il supplemento MR e CJ. Preparare il terreno di fase 1A aggiungendo il supplemento MR e CJ al terreno basale dell'endoderma. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
7. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 1A e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.
   NOTA: Le fasi di lavaggio non sono necessarie. Rimuovere tutte le cellule non attaccate dalla coltura agitando delicatamente la piastra di coltura prima dello scambio di terreno. Evitare di rompere il monostrato non toccando il puntale della pipetta con il fondo del pozzetto durante la rimozione del fluido e aggiungendo delicatamente il fluido.
8. Nella fase 1 giorno 2, riscaldare brevemente il terreno basale endodermico in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento CJ. Preparare il terreno di Fase 1B aggiungendo il Supplemento CJ al terreno basale dell'endoderma. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
9. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 1B e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.
10. Nella fase 1 giorno 3, ripetere i passaggi 2.8-2.9. Procedere alla fase 2.
11. Nella fase 2 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico Stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare i supplementi 2A e 2B. Preparare il terreno di fase 2A aggiungendo il supplemento 2A e 2B al terreno basale pancreatico stadio 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
12. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 2A e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO₂ per 24 ore.
13. Nella fase 2 giorno 2, riscaldare il terreno basale pancreatico Stage 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 2B. Preparare il terreno di fase 2B aggiungendo il supplemento 2B al terreno basale pancreatico Stage 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
14. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 2B e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.
15. Nella fase 2 giorno 3, ripetere i passaggi 2.13-2.14. Procedere alla fase 3.
16. Nella fase 3 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 3. Preparare il terreno di Stadio 3 aggiungendo l'Integratore 3 al terreno basale di Stadio pancreatico 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
17. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 3 e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO₂ per 24 ore.
18. Nella fase 3, giorno 2 e giorno 3, ripetere i passaggi 2.16-2.17. Procedi alla fase 4.
19. Nella fase 4 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 4. Preparare il terreno di Stadio 4 aggiungendo il Supplemento 4 al terreno basale di Stadio pancreatico 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
20. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 4 e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.
21. Nella fase 4 dal giorno 2 al giorno 4, ripetere i passaggi 2.19-2.20. Procedere con i passaggi di aggregazione.

3. Aggregazione in cluster di progenitori pancreatici utilizzando piastre a micropozzetti da 400 μm di diametro

1. Nella fase 4 giorno 5, pretrattare i micropozzetti (ad es. formato piastra a 24 pozzetti) con 500 μL di soluzione di risciacquo antiaderenza per pozzetto.
2. Preparare una piastra di bilanciamento e centrifugare la piastra per micropozzetti a 1.300 × g per 5 minuti.
   NOTA: Controllare la piastra al microscopio per assicurarsi che non rimangano bolle nei micropozzetti. Centrifugare di nuovo per altri 5 minuti se le bolle rimangono intrappolate nei micropozzetti.
3. Aspirare la soluzione di risciacquo antiaderente dai pozzetti e risciacquare una volta con 1 mL di DPBS. Aspirare il DPBS dai pozzetti e aggiungere 1 mL di terreno di aggregazione a ciascun pozzetto.
4. Rimuovere il terreno esausto dalle colture dei progenitori pancreatici e lavare una volta con DPBS. Dissociare le colture in singole cellule con reagente di dissociazione a 37 °C per 10-12 min. Risciacquare le cellule con DMEM/F12 caldo, trasferirle in un tubo e centrifugare a 300 × g per 5 min.
5. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di aggregazione ed eseguire il conteggio delle cellule vive. Inizializzare 2,4-3,6 milioni di cellule totali per pozzetto (cioè 2.000-3.000 cellule per micropozzetto) e aggiungere il terreno di aggregazione a ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di 2 mL per pozzetto.
6. Pipettare delicatamente le cellule su e giù più volte con un puntale per pipette P1000 per garantire una distribuzione uniforme delle cellule in tutto il pozzetto. Non introdurre bolle nei micropozzetti. Centrifugare la piastra per micropozzetti a 300 × g per 5 minuti per catturare le cellule nei micropozzetti. Incubare la piastra a micropozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO₂ per 24 ore di aggregazione e procedere alla differenziazione delle fasi 5-7.
   NOTA: Fare attenzione a non disturbare la piastra durante il tempo di aggregazione. Possono essere necessarie fino a 48 ore di incubazione per una formazione ottimale dell'aggregato.

4. Differenziamento di cluster di progenitori pancreatici derivati da kit in isole hPSC

1. Nella fase 5 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 5 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
2. Dopo la formazione dell'aggregato, pipettare delicatamente gli aggregati su e giù più volte con un puntale per pipette P1000 per far galleggiare le cellule non aggregate. Lasciare che gli aggregati si depositino per gravità (attendere ~1 min). Rimuovere delicatamente il più possibile il terreno esausto (contenente le cellule galleggianti non aggregate) dal pozzetto, evitando di aspirare gli aggregati.
3. Erogare energicamente il terreno fresco Stage 5 sulla superficie della piastra per micropozzetti per rimuovere gli aggregati dai micropozzetti. Trasferimento degli aggregati in 6 pozzetti a attacco ultrabasso (ULA). Risciacquare una volta con il terreno Stage 5 per recuperare completamente gli aggregati dai micropozzetti.
4. Raccogliere tutti gli aggregati nei 6 pozzetti dell'ULA, risospendere gli aggregati nel terreno di fase 5 e regolare la densità a 20 cluster per 100 μL (ad esempio, si prevede di recuperare ~1.200 cluster da ciascun pozzetto. Risospendere 1.200 cluster in 6 mL di terreno di fase 5). Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 50 μL di terreno Stage 5 in ciascun pozzetto di una piastra ULA a fondo piatto da 96 pozzetti. Riempire i pozzetti angolari e perimetrali con 200 μL di DPBS.
   NOTA: Evitare di utilizzare i pozzetti perimetrali per la coltura di aggregati poiché sono soggetti a una maggiore evaporazione; In caso contrario, utilizzare una piastra a 96 pozzetti progettata per ridurre al minimo l'evaporazione lungo i bordi (ad es. piastre a 96 pozzetti con fossati incorporati) o posizionare la piastra di coltura in un incubatore per colture cellulari ad alta umidità microclimatica.
5. Aggiungere 100 μL di risospensione del cluster in ciascun pozzetto della piastra a fondo piatto a 96 pozzetti ULA, ottenendo un totale di 150 μL di terreno di coltura contenente una media di 20 cluster per pozzetto.
   NOTA: Miscelare delicatamente la risospensione del cluster ogni volta prima di erogare in 96 pozzetti.
6. Posizionare le piastre di coltura su una superficie piana in un'incubatrice umidificata a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.
7. Nella fase 5 giorno 2, preparare la fase 5 media seguendo la fase 4.1.
8. Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL di terreno esausto da ciascun pozzetto e aggiornare con 100 μL di terreno di fase 5.
9. Nella fase 5 giorno 3, ripetere i passaggi 4.7-4.8. Procedi alla fase 6.
10. Nella fase 6 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 6 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
11. Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL del terreno esausto e aggiornare con 100 μL di terreno Stage 6 per pozzetto.
12. Nella fase 6 dal giorno 2 al giorno 8, ripetere i passaggi 4.10-4.11. Procedi alla fase 7.
13. Nella fase 7 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 7 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
14. Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL di terreno esausto e aggiornare con 100 μL di terreno Stage 7 per pozzetto.
15. Nella fase 7 dal giorno 2 al giorno 12, ripetere i passaggi 4.13-4.14. Procedere alla caratterizzazione in vitro .

5. Analisi citofluorimetrica

1. Rimuovere i terreni di coltura e lavarli una volta con DPBS. Dissociare le colture (cellule progenitrici planari o cluster differenzianti) in singole cellule con reagente di dissociazione incubando a 37 °C per 10-12 min. Risciacquare con tampone FACS e centrifugare a 300 × g per 5 min.
2. Risospendere il pellet cellulare nel tampone FACS ed eseguire il conteggio delle cellule. Centrifugare le pile a 300 × g per 5 min. Risospendere le singole cellule in 500 μL di tampone Fix/Perm per 10 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Portare il tampone Fix/Perm a temperatura ambiente prima dell'uso. Il tampone Fix/Perm contiene paraformaldeide (PFA). Maneggiare con cura il PFA in una cappa aspirante e smaltirlo secondo le linee guida istituzionali.
3. Centrifugare a 500 × g per 3 min, lavare due volte con 500 μL di 1x tampone Perm/Wash e risospendere in 300 μL di 1x tampone Perm/Wash. Trasferire 100 μL di risospensione a singola cellula (ciascuna contenente 2,5-3 × 10⁵ cellule) in tre provette microfuge per il controllo non colorato, il controllo dell'isotipo e la colorazione degli anticorpi (vedere la tabella dei materiali per informazioni sugli anticorpi e sulla diluizione del campione). Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente e coprire con un foglio.
4. Centrifugare a 500 × g per 3 min. Lavare due volte con 500 μL di 1x tampone Perm/Wash. Risospendere i campioni in 100 μL di tampone FACS e analizzare le cellule colorate (vedere la tabella dei materiali per la colorazione intracellulare dei marcatori in fasi specifiche) con un citometro a flusso e un software (ad es. FlowJo).
   NOTA: Se i campioni non vengono analizzati immediatamente, conservarli a 4°C al riparo dalla luce. Per la strategia di gating, i dati di flusso vengono prima controllati dalle proprietà di dispersione (FSC-A e SSC-A) per rimuovere i piccoli detriti cellulari, seguite dalle proprietà FSC-A e FSC-width per identificare i singoletti. Il gating positivo e negativo è determinato dai controlli con cellule staminali e/o dai controlli isotipici non colorati.

6. Immunocolorazione a montaggio intero

1. Raccogli i grappoli in un tubo di microfuga. Sedimentare gli ammassi per gravità. Aspirare il terreno esausto e risciacquare una volta con 1 mL di PBS (con calcio e magnesio). Fissare i cluster con 1 mL di PFA al 4% a 4°C per una notte.
2. Risciacquare una volta con PBST e permeabilizzare 20-30 cluster con 500 μL di TritonX-100 allo 0,3% in una provetta microfuge a temperatura ambiente per almeno 6 ore su uno scuotitore inclinabile.
   NOTA: Per i cluster di grandi dimensioni è necessario un tempo di permeabilizzazione più lungo (fino a 24 ore).
3. Incubare i cluster in 100 μL di tampone bloccante a temperatura ambiente per 1 ora su un tilt shaker. Rimuovere il tampone bloccante e incubare i cluster con 100 μL di anticorpi primari diluiti in tampone di diluizione anticorpale a temperatura ambiente per una notte su un tilt shaker.
   NOTA: Se il fondo è forte durante l'imaging, incubare con anticorpi primari a 4 °C.
4. Lavare accuratamente 3 x 30 min con 500 μL di PBST su uno scuotitore inclinabile (angolo di inclinazione impostato su 8, velocità impostata su 20).
5. Incubare i cluster con 100 μL di anticorpi secondari in tampone di diluizione anticorpale a temperatura ambiente per una notte su un tilt shaker. Coprire i tubi con un foglio.
   NOTA: Se il fondo è forte durante l'imaging, incubare con anticorpi secondari a 4 °C.
6. Risciacquare una volta con 500 μL di PBST. Aggiungere 100 μL di soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (10 μg/mL in PBST) e colorare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Coprire con un foglio di alluminio e proteggere dalla luce.
7. Lavare accuratamente 3 x 30 min con 500 μL di PBST su uno scuotitore inclinabile. Coprire i tubi con un foglio durante la fase di lavaggio.
8. Fissare i cluster sui vetrini della camera di imaging (vedere la tabella dei materiali) prerivestiti con adesivo per tessuti secondo il protocollo del produttore e i protocolli pubblicati^20,21.
9. Montare con un terreno di purificazione dei tessuti (glicerolo all'80% in soluzione PBS) e coprire con vetrini coprioggetti. Proteggere dalla luce fino all'imaging confocale.
   NOTA: Se i campioni non vengono acquisiti immediatamente, conservarli a 4 °C al riparo dalla luce.

7. Saggio statico GSIS

1. Tampone caldo di bicarbonato di Kreb a basso contenuto di glucosio (3,3 G KRB), tampone KRB ad alto contenuto di glucosio (16,7 G) e tampone KRB KCl da 30 mM in un bagno a 37 °C.
2. Prelevare a mano i cluster di dimensioni corrispondenti e risciacquare con 2 mL di tampone KRB caldo da 3,3 G. Trasferire i cluster in una piastra a 6 pozzetti non trattata con coltura tissutale ed equilibrarli in un tampone KRB da 2 mL o caldo da 3,3 G per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ .
3. Dopo l'equilibrazione, riempire la camera del saggio (vedere la tabella dei materiali) con 100 μL di tampone caldo KRB da 3,3 G. Prelevare a mano cinque grappoli e trasferirli al centro della camera del saggio. Incubare per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ .
   NOTA: Utilizzare puntali per pipette da 10 μL per il trasferimento di cluster con volume di terreno minimo.
4. Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservarlo a -30 °C fino alla misurazione della secrezione basale di insulina (vedere punto 7.9). Non asciugare o perdere i grappoli in questa fase. Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone KRB caldo da 16,7 G nella camera del saggio e incubare gli stessi cluster per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO₂ .
5. Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservarlo a -30 °C fino alla misurazione della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (vedere punto 7.9). Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone caldo 30 mM KCl KRB nella camera del saggio e incubare gli stessi cluster per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO₂ .
6. Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservare a -30 °C fino alla misurazione della secrezione di insulina stimolata da KCl (vedere punto 7.9). Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone di lisi RIPA nella camera del saggio e trasferire il tampone di lisi contenente tutti e cinque i cluster in una provetta per microfuge.
7. Facoltativo) Rompere manualmente i cluster mediante una vigorosa triturazione con un puntale per pipette P200. Vortice per 30 secondi e incubazione su ghiaccio per 30 minuti seguiti da altri 30 secondi di vortice.
   NOTA: Garantire una lisi completa mediante vortex e un tempo sufficiente di incubazione sul ghiaccio.
8. Centrifugare a 8.000 × g per 1 min. Raccogliere il surnatante e conservare a -30 °C fino alla misurazione del contenuto totale di insulina (vedere punto 7.9).
9. Misurare l'insulina umana nei campioni surnatanti utilizzando un kit ELISA per insulina umana secondo il protocollo del produttore e i protocolli pubblicati^20,22.
   NOTA: Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti dei campioni surnatanti. I campioni con più di tre cicli di congelamento e disgelo non devono essere analizzati.

Risultati

Abbiamo sviluppato una strategia ibrida per differenziare le cellule staminali in isole hPSC secernenti insulina in sette fasi, che utilizza un kit di progenitori pancreatici per i primi quattro stadi in coltura planare, seguito da un protocollo modificato basato su un metodo⁶ precedentemente riportato in una coltura in sospensione statica per gli ultimi tre stadi (Figura 1). Con questo protocollo, garantire una coltura vicina alla confluenza (90%-100%) a 24 ore dalla...

Discussione

Questo documento descrive un protocollo ibrido a sette stadi che consente la generazione di isole hPSC in grado di secernere insulina in seguito a provocazione del glucosio entro 40 giorni dalla coltura in vitro. Tra queste molteplici fasi, si ritiene che l'induzione efficiente dell'endoderma definitivo costituisca un importante punto di partenza per gli esiti finali della differenziazione^18,27,28. Nel protocollo del pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma	T6397	Thyroid hormone
4% PFA solution	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom	Corning Costar (VWR)	CLS3474	Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates	STEMCELL Technologies	34415	400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates	STEMCELL Technologies	34815	800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)	R&D Systems	IC2400G	1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control	R&D Systems	IC108G	1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)	BD Sciences	566032	1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control	R&D Systems	IC0041G	1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)	BD Pharmingen	565831	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565689	1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	563338	1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	562594	1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	557714	1:50 in flow cytometry
ALK5i II	Cayman Chemicals	14794	TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Microwell Rinsing Solution
Assay chamber	Cellvis	D35-10-1-N	For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	BP1600-100	For immunostaining procedure
CK19 antibody	DAKO	M0888	1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose	Sigma	G8769	Medium supplement
DAPI	Sigma	D9542	For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330032	Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555	Life technologies	A21432	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647	Life technologies	A21447	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555	Life technologies	A31570	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Life technologies	A31571	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555	Life technologies	A31572	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647	Life technologies	A31573	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647	Life technologies	A21448	1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS	Sigma	D8537	Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human	Alpco	80-INSHU-E01.1	For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA	Proliant	68700	Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit	BD Sciences	554714	Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody	Sigma	G2654	1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA1-37782	1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)	Gibco	35050061	L-glutamine supplement
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-4	For tissue clearing and mounting
GSi XX	Sigma Millipore	565789	Notch inhibitor
Heparin	Sigma	H3149	Medium supplement
ITS-X (100x)	Thermo Fisher Scientific	51500056	Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189	STEMCELL Technologies	72147	BMP antagonist
MAFA antibody	Abcam	ab26405	1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium	Life technologies	10372019	Base medium
mTeSR1 Complete Kit	STEMCELL Technologies	85850	stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)	Sigma	A9165	Antioxidant
NaHCO3	Sigma	S6297	Medium supplement
NEUROD1 antibody	R&D Systems	AF2746	1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody	DSHB	F55A12-c	1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody	R&D Systems	AF6297	1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS	Sigma	D8662	With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody	Abcam	ab47267	1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565860	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	563023	1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	562161	1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	554680	1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)	BD Sciences	564563	1:200 in flow cytometry
R428	Cayman Chemicals	21523	AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans	Sigma	R2625	Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x	Sigma	20-188	For hormone extraction
SANT-1	Sigma	S4572	SHH inhibitor
SLC18A1 antibody	Sigma	HPA063797	1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody	Sigma	HPA019472	1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit	STEMCELL Technologies	05120	Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody	Novus	NB120-16659	1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100	Sigma	X100	For permeabilization
Trolox	Sigma Millipore	648471	Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express	Life technologies	12604-021	cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody	R&D Systems	AF3586	1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304	ROCK inhibitor
Zinc sulfate	Sigma	Z0251	Medium supplement