Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.

Özet

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) insülin salgılayan beta hücrelerine farklılaşması, beta hücre fonksiyonunu ve diyabet tedavisini araştırmak için materyal sağlar. Bununla birlikte, doğal insan beta hücrelerini yeterince taklit eden kök hücre kaynaklı beta hücrelerinin elde edilmesinde zorluklar devam etmektedir. Önceki çalışmalara dayanarak, gelişmiş farklılaşma sonuçları ve tutarlılığı olan bir protokol oluşturmak için hPSC'den türetilmiş adacık hücreleri üretilmiştir. Burada açıklanan protokol, Aşama 1-4 sırasında bir pankreas progenitör kiti kullanır, ardından Aşama 5-7 sırasında daha önce 2014'te yayınlanan bir makaleden (bundan sonra "R-protokolü" olarak adlandırılacaktır) değiştirilmiş bir protokol kullanır. Pankreas progenitör kümeleri oluşturmak için pankreatik progenitör kiti ve 400 μm çaplı mikrokuyu plakaları, 96 oyuklu statik süspansiyon formatında endokrin farklılaşması için R protokolü ve hPSC'den türetilen adacıkların in vitro karakterizasyonu ve fonksiyonel değerlendirmesi için ayrıntılı prosedürler dahildir. Protokolün tamamı, ilk hPSC genişlemesi için 1 hafta sürer, ardından insülin üreten hPSC adacıkları elde etmek için ~ 5 hafta sürer. Temel kök hücre kültürü tekniklerine ve biyolojik tahliller konusunda eğitim almış personel bu protokolü çoğaltabilir.

Giriş

Pankreas beta hücreleri, kan şekeri seviyelerindeki artışlara yanıt vererek insülin salgılar. Tip 1 diyabette (T1D)1 beta hücrelerinin otoimmün yıkımı veya tip 2 diyabette (T2D)2 beta hücre disfonksiyonu nedeniyle yeterli insülin üretimi olmayan hastalar tipik olarak ekzojen insülin uygulaması ile tedavi edilir. Bu hayat kurtarıcı tedaviye rağmen, iyi niyetli beta hücrelerinden dinamik insülin sekresyonu ile elde edilen kan şekerinin mükemmel kontrolüyle tam olarak eşleşemez. Bu nedenle, hastalar genellikle hayatı tehdit eden hipoglisemik atakların ve kronik hiperglisemik gezilerden kaynaklanan diğer komplikasyonların so....

Protokol

Bu protokol, besleyicisiz koşullarda H1, HUES4 PDXeG ve Mel1 INSGFP/W dahil olmak üzere hPSC hatlarıyla çalışmaya dayanır. Bu bölümde, temsili sonuçlar bölümünde Mel1 INSGFP/W'nin farklılaşmasından elde edilen destekleyici verilerle birlikte adım adım bir prosedür detaylandırılmıştır. Burada belirtilmeyen diğer hPSC hatlarıyla çalışırken daha fazla optimizasyon gerektiğini öneririz. Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler ve çözeltilerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Farklılaştırma ortamı ve çözümlerinin hazırlanması

NOT: Hazırlanacak tüm ....

Sonuçlar

Kök hücreleri yedi adımda insülin salgılayan hPSC adacıklarına farklılaştırmak için hibrit bir strateji geliştirdik, bu da düzlemsel kültürde ilk dört aşama için bir pankreas progenitör kiti kullanıyor, ardından son üç aşama için statik bir süspansiyon kültüründe daha önce bildirilen bir yöntem6 üzerine inşa edilmiş değiştirilmiş bir protokol kullandık (Şekil 1). Bu protokolle, hücre tohumlamadan (Aşama 0) 24 saat sonra yakın .......

Tartışmalar

Bu makale, in vitro kültürden sonraki 40 gün içinde glikoz tehdidi üzerine insülin salgılayabilen hPSC adacıklarının üretilmesine izin veren yedi aşamalı bir hibrit protokolü açıklamaktadır. Bu çoklu adımlar arasında, kesin endodermin etkin indüksiyonunun, nihai farklılaşma sonuçlarıiçin önemli bir başlangıç noktası oluşturduğuna inanılmaktadır 18,27,28. Üreticinin protokolünde, fark.......

Açıklamalar

Timothy J. Kieffer, bu makalenin hazırlanması sırasında ViaCyte'ın bir çalışanıydı. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nin desteğini minnetle kabul ediyoruz. Jia Zhao ve Shenghui Liang, Michael Smith Sağlık Araştırmaları BC Stajyer Ödülü'nün sahipleridir. Mitchell J.S. Braam, Mitacs Hızlandırma Bursu'nun bir alıcısıdır. Diepiriye G. Iworima, Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu ve CFUW 1989 Ecole Polytechnique Hatıra Ödülü sahibidir. MCRI ve Monash Üniversitesi'nden Dr. Edouard G. Stanley'e Mel1 INS GFP/W hattını ve Alberta Diyabet Enstitüsü Adacık Çekirdeği'ni insan adacıklarını izole ettiği ve dağıttığı için içtenlikle teşekkür ederiz. Ay....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397Thyroid hormone
4% PFA solutionSanta Cruz Biotechnologysc-281692Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottomCorning Costar (VWR)CLS3474Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 platesSTEMCELL Technologies34415400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 platesSTEMCELL Technologies34815800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)R&D SystemsIC2400G1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR&D SystemsIC108G1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR&D SystemsIC0041G1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010Microwell Rinsing Solution
Assay chamberCellvisD35-10-1-NFor static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100For immunostaining procedure
CK19 antibodyDAKOM08881:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucoseSigmaG8769Medium supplement
DAPISigmaD9542For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in whole mount immunofluorescence
DPBSSigmaD8537Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, humanAlpco80-INSHU-E01.1For human insulin measurement
Fatty acid-free BSAProliant68700Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution KitBD Sciences554714Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies7174For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibodySigmaG26541:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibodyThermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-glutamine supplement
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4For tissue clearing and mounting
GSi XXSigma Millipore565789Notch inhibitor
HeparinSigmaH3149Medium supplement
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP antagonist
MAFA antibodyAbcamab264051:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualifiedThermo Fisher Scientific08-774-552Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 mediumLife technologies10372019Base medium
mTeSR1 Complete KitSTEMCELL Technologies85850stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3SigmaS6297Medium supplement
NEUROD1 antibodyR&D SystemsAF27461:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibodyDSHBF55A12-c1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibodyR&D SystemsAF62971:200 in whole mount immunofluorescence
PBSSigmaD8662With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibodyAbcamab472671:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)BD Sciences5630231:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BD Sciences5621611:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5546801:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)BD Sciences5645631:200 in flow cytometry
R428 Cayman Chemicals21523AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-transSigmaR2625Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10xSigma20-188For hormone extraction
SANT-1SigmaS4572SHH inhibitor
SLC18A1 antibodySigmaHPA0637971:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibodySigmaHPA0194721:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor KitSTEMCELL Technologies05120Basal media and supplements included
Synaptophysin antibodyNovusNB120-166591:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100SigmaX100For permeabilization
Trolox Sigma Millipore648471Vitamin E analog
TrypLE Enzyme ExpressLife technologies12604-021cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibodyR&D SystemsAF35861:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK inhibitor
Zinc sulfateSigmaZ0251Medium supplement

Referanslar

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 196ns lin retenAdac k K meleriBeta H creleriDiyabet TedavisiProtokolPankreatik Progenit r KitiR protokolMikrokuyu PlaklarEndokrin Farkl la mas96 oyuklu Statik S spansiyon Formatn Vitro KarakterizasyonFonksiyonel De erlendirmeHPSC Kaynakl Adac klarK k H cre K lt r TeknikleriBiyolojik Deneyler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır