JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kök hücrelerin adacık hücrelerine farklılaşması, geleneksel diyabet tedavisine ve hastalık modellemesine alternatif bir çözüm sunar. Bir tabakta insülin salgılayan, kök hücreden türetilen adacıkların üretilmesine yardımcı olmak için ticari bir farklılaşma kitini önceden onaylanmış bir yöntemle birleştiren ayrıntılı bir kök hücre kültürü protokolünü açıklıyoruz.

Özet

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) insülin salgılayan beta hücrelerine farklılaşması, beta hücre fonksiyonunu ve diyabet tedavisini araştırmak için materyal sağlar. Bununla birlikte, doğal insan beta hücrelerini yeterince taklit eden kök hücre kaynaklı beta hücrelerinin elde edilmesinde zorluklar devam etmektedir. Önceki çalışmalara dayanarak, gelişmiş farklılaşma sonuçları ve tutarlılığı olan bir protokol oluşturmak için hPSC'den türetilmiş adacık hücreleri üretilmiştir. Burada açıklanan protokol, Aşama 1-4 sırasında bir pankreas progenitör kiti kullanır, ardından Aşama 5-7 sırasında daha önce 2014'te yayınlanan bir makaleden (bundan sonra "R-protokolü" olarak adlandırılacaktır) değiştirilmiş bir protokol kullanır. Pankreas progenitör kümeleri oluşturmak için pankreatik progenitör kiti ve 400 μm çaplı mikrokuyu plakaları, 96 oyuklu statik süspansiyon formatında endokrin farklılaşması için R protokolü ve hPSC'den türetilen adacıkların in vitro karakterizasyonu ve fonksiyonel değerlendirmesi için ayrıntılı prosedürler dahildir. Protokolün tamamı, ilk hPSC genişlemesi için 1 hafta sürer, ardından insülin üreten hPSC adacıkları elde etmek için ~ 5 hafta sürer. Temel kök hücre kültürü tekniklerine ve biyolojik tahliller konusunda eğitim almış personel bu protokolü çoğaltabilir.

Giriş

Pankreas beta hücreleri, kan şekeri seviyelerindeki artışlara yanıt vererek insülin salgılar. Tip 1 diyabette (T1D)1 beta hücrelerinin otoimmün yıkımı veya tip 2 diyabette (T2D)2 beta hücre disfonksiyonu nedeniyle yeterli insülin üretimi olmayan hastalar tipik olarak ekzojen insülin uygulaması ile tedavi edilir. Bu hayat kurtarıcı tedaviye rağmen, iyi niyetli beta hücrelerinden dinamik insülin sekresyonu ile elde edilen kan şekerinin mükemmel kontrolüyle tam olarak eşleşemez. Bu nedenle, hastalar genellikle hayatı tehdit eden hipoglisemik atakların ve kronik hiperglisemik gezilerden kaynaklanan diğer komplikasyonların sonuçlarından muzdariptir. İnsan kadavra adacıklarının transplantasyonu, T1D hastalarında sıkı glisemik kontrolü başarılı bir şekilde geri kazandırır, ancak adacık donörlerinin mevcudiyeti ve transplantasyon için sağlıklı adacıkların saflaştırılmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlıdır 3,4. Bu zorluk, prensip olarak, alternatif bir başlangıç malzemesi olarak hPSC'ler kullanılarak çözülebilir.

İn vitro olarak hPSC'lerden insülin salgılayan adacıklar oluşturmak için mevcut stratejiler genellikle embriyonik pankreas gelişim sürecini in vivo 5,6 taklit etmeyi amaçlamaktadır. Bu, sorumlu sinyal yollarının bilinmesini ve gelişmekte olan embriyonik pankreasın kritik aşamalarını taklit etmek için karşılık gelen çözünür faktörlerin zamanlanmış eklenmesini gerektirir. Pankreas programı, transkripsiyon faktörleri çatal başlı kutu A2 (FOXA2) ve cinsiyet belirleyici bölge Y-kutusu 17 (SOX17)7 ile işaretlenen kesin endoderm taahhüdü ile başlar. Kesin endodermin ardışık farklılaşması, pankreas ve duodenal homeobox 1'i (PDX1)7,8,9 eksprese eden bir posterior ön bağırsağa desenlenen ilkel bir bağırsak tüpünün oluşumunu ve PDX1 ve NK6 homeobox 1'i (NKX6.1)10,11 birlikte eksprese eden pankreas progenitörlerine epitelyal genişlemeyi içerir.

Endokrin adacık hücrelerine daha fazla bağlılığa, pro-endokrin ana düzenleyici nörogenin-3'ün (NGN3)12 geçici ekspresyonu ve anahtar transkripsiyon faktörlerinin kararlı indüksiyonu eşlik eder: nöronal farklılaşma 1 (NEUROD1) ve NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. İnsülin üreten beta hücreleri, glukagon üreten alfa hücreleri, somatostatin üreten delta hücreleri ve pankreas polipeptit üreten PPY hücreleri gibi ana hormon eksprese eden hücreler daha sonra programlanır. Bu bilgi birikiminin yanı sıra kapsamlı, yüksek verimli ilaç tarama çalışmalarından elde edilen keşiflerle, son gelişmeler, insülin salgılayabilen beta hücrelerine benzeyen hücrelerle hPSC adacıklarının üretilmesini sağlamıştır 14,15,16,17,18,19.

Glikoza duyarlı beta hücreleri üretmek için adım adım protokoller bildirilmiştir 6,14,18,19. Bu çalışmalara dayanarak, mevcut protokol, düzlemsel bir kültürde PDX1 + / NKX6.1 + pankreas progenitör hücreleri oluşturmak için bir pankreas progenitör kitinin kullanılmasını, ardından tek tip boyutlu kümeler halinde mikrokuyu plakası agregasyonunu ve statik bir 3D süspansiyon kültüründe R protokolü ile insülin salgılayan hPSC adacıklarına doğru daha fazla farklılaşmayı içerir. Farklılaşan hücrelerin titiz karakterizasyonu için akış sitometrisi, immün boyama ve fonksiyonel değerlendirme dahil olmak üzere kalite kontrol analizleri yapılır. Bu makale, yönlendirilmiş farklılaşmanın her adımının ayrıntılı bir tanımını sağlar ve in vitro karakterizasyon yaklaşımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

Bu protokol, besleyicisiz koşullarda H1, HUES4 PDXeG ve Mel1 INSGFP/W dahil olmak üzere hPSC hatlarıyla çalışmaya dayanır. Bu bölümde, temsili sonuçlar bölümünde Mel1 INSGFP/W'nin farklılaşmasından elde edilen destekleyici verilerle birlikte adım adım bir prosedür detaylandırılmıştır. Burada belirtilmeyen diğer hPSC hatlarıyla çalışırken daha fazla optimizasyon gerektiğini öneririz. Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler ve çözeltilerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Farklılaştırma ortamı ve çözümlerinin hazırlanması

NOT: Hazırlanacak tüm çözümler için Tablo 1'e ve farklılaşma ortamı için Tablo 2'ye bakınız.

  1. Steril bir biyogüvenlik kabininde hücre kültürü için tüm ortamları ve reaktifleri hazırlayın. Kullanmadan önce hücre kültürü ile ilgili solüsyonları ve bazal ortamı banyoda 37 °C'ye kadar kısaca ısıtın.
    NOT: Aşağıda açıklandığı gibi, takviyeler ekleyerek günlük olarak taze farklılaşma ortamı yapın ve bunları aynı gün kullanın. Alternatif olarak, pankreas progenitör kiti, üreticinin protokolünü takiben birkaç gün boyunca kullanılabilecek daha büyük bir hacmi önceden hazırlama seçeneği sunar. Medya hazırlığı için her iki yöntem de işe yaradığını kanıtlıyor. Medyanın su banyosunda uzun süre bırakılmasının tavsiye edilmediğini unutmayın. Her gün taze ortam hazırlarken, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için takviyelerin kesilmesi önerilir.

2. hPSC'lerin pankreas progenitör hücrelerine farklılaşması

  1. Matrigel kaplı kaplarda farklılaşmamış hPSC'leri mTeSR1 tam ortamında tutun ve günlük olarak ortam değişiklikleri gerçekleştirin. Bakım kültürü sırasında, üreticinin protokolünü izleyerek hücre ayrışma reaktifini kullanarak hücreler ~%70 birleşmeye ulaştığında her 3-4 günde bir hPSC'leri geçindirin. Farklılaşmayı başlatmak için, hücreleri tek hücrelere ayırın ve bunları 6 oyuklu veya 12 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş plakalara (sırasıyla kuyucuk başına 2 mL veya 1 mL'lik ortam hacimleri ile) tohumlayın.
    NOT: Endoderm bazal ortamının ve alikotlarının depolanması ile ilgili talimatlar için Tablo 1'e bakın.
  2. Kültür kuyucuklarını hESC nitelikli Matrigel (üreticinin protokolü tarafından önerildiği şekilde buz gibi soğuk DMEM/F12 ile seyreltilmiş) ile ön kaplama yapın ve plakayı 30 dakika boyunca nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatöre yerleştirin.
  3. Matrigel kaplı plakayı oda sıcaklığına getirin (3 saat içinde kullanın).
  4. Harcanan ortamı hPSC kültüründen aspire edin ve DPBS ile bir kez durulayın. hPSC kültürünü 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca hücre ayrışma enzimi ile tek hücrelere ayırın. Sıcak DMEM / F12 ortamı ekleyerek hücreleri durulayın, 15 mL veya 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.
  5. Hücre peletini kök hücre tam ortamı artı 10 μM Y-27632 ile yeniden süspanse edin ve bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile canlı hücre (tripan mavisi negatif) sayımı gerçekleştirin. Seyreltilmiş Matrigel'i aspire edin ve Matrigel kaplı kuyucuklarda 1.60-1.80 × 10 5 /cm2 yoğunlukta canlı hücreleri hemen tohumlayın ve nemlendirilmiş 37 ° C,%5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin. Aşama 1'e geçin.
    NOT: Bu, farklılaşmayı başlatmak için ~%95 başlangıç izdihamı ile sonuçlanacaktır. Üreticinin protokolüne göre, 2,6 × 105/cm2 tohumlama yoğunluğu önerilir. Bir hücre hattı için en uygun değeri belirlemek ve hücre canlılığını kontrol etmek için çeşitli tohumlama yoğunluklarının test edilmesi önerilir. Canlılık% 80'in altındaysa, farklılaşmaya devam etmeyin. Düşük hücre canlılığı, hasat sırasında aşırı sindirim veya aşırı tritürasyonun veya tohumlamadan önce hücrelerin DMEM / F12 ortamında uzun süre bırakılmasının bir sonucu olabilir.
  6. Aşama 1 gün 1'de, endoderm bazal ortamını bir banyoda 37 ° C'ye kadar kısaca ısıtın ve MR ve CJ takviyesini çözün. Endoderm bazal ortamına Ek MR ve CJ ekleyerek Aşama 1A ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  7. Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 1A ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
    NOT: Yıkama adımları gereksizdir. Ortam değişiminden önce kültür plakasını hafifçe sallayarak bağlanmamış hücreleri kültürden çıkarın. Orta boy çıkarma sırasında pipet ucunu kuyu dibine değdirmeyerek ve nazik orta madde ilavesi yaparak tek tabakayı bozmaktan kaçının.
  8. Aşama 1 gün 2'de, endoderm bazal ortamını 37 ° C'lik bir banyoda kısaca ısıtın ve Supplement CJ'yi çözün. Endoderm bazal ortamına Ek CJ ekleyerek Aşama 1B ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  9. Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 1B ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
  10. Aşama 1 gün 3'te, 2.8-2.9 adımlarını tekrarlayın. Aşama 2'ye geçin.
  11. Aşama 2 gün 1'de, pankreas Evre 2-4 Bazal Ortamını 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve Ek 2A ve 2B'yi çözün. Pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamına Ek 2A ve 2B ekleyerek Aşama 2A ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  12. Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 2A ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
  13. Aşama 2 gün 2'de, pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve Ek 2B'yi çözün. Pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamına Ek 2B ekleyerek Aşama 2B ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  14. Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 2B ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
  15. Aşama 2 gün 3'te 2.13-2.14 adımlarını tekrarlayın. Aşama 3'e geçin.
  16. Aşama 3 gün 1'de, pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve Ek 3'ü çözün. Pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamına Ek 3 ekleyerek Aşama 3 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  17. Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 3 ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
  18. Aşama 3 gün 2 ve gün 3'te 2.16-2.17 adımlarını tekrarlayın. Aşama 4'e geçin.
  19. Aşama 4 gün 1'de, pankreas Aşama 2-4 Bazal Ortamını 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve Ek 4'ü çözdürün. Pankreas Evre 2-4 Bazal Ortamına Ek 4 ekleyerek Aşama 4 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  20. Harcanan ortamı kuyulardan aspire edin, Aşama 4 ortamı ekleyin ve nemlendirilmiş 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin.
  21. Aşama 4'te 2. günden 4. güne kadar 2.19-2.20 arasındaki adımları tekrarlayın. Toplama adımlarına geçin.

3. 400 μm çaplı mikrokuyu plakaları kullanılarak pankreas progenitör kümelerine agregasyon

  1. Aşama 4 gün 5'te, mikro kuyucuklara (örn. 24 oyuklu plaka formatı) oyuk başına 500 μL Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu ile ön işleme tabi tutun.
  2. Bir denge plakası hazırlayın ve mikrokuyu plakasını 1.300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Mikro kuyucuklarda kabarcık kalmadığından emin olmak için plakayı mikroskop altında kontrol edin. Kabarcıklar herhangi bir mikro kuyuda sıkışmış kalırsa 5 dakika daha santrifüjleyin.
  3. Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonunu kuyulardan aspire edin ve 1 mL DPBS ile bir kez durulayın. DPBS'yi kuyulardan aspire edin ve her kuyucuğa 1 mL Agregasyon ortamı ekleyin.
  4. Harcanan ortamı pankreas progenitör kültürlerinden çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkayın. Kültürleri ayrışma reaktifi ile 37 °C'de 10-12 dakika boyunca tek hücrelere ayırın. Hücreleri ılık DMEM / F12 ile durulayın, bir tüpe aktarın ve 300 × g'da 5 dakika döndürün.
  5. Hücre peletini Agregasyon ortamında yeniden süspanse edin ve canlı hücre sayımı gerçekleştirin. Oyuk başına 2.4-3.6 milyon toplam hücreyi tohumlayın (yani, mikrokuyu başına 2.000-3.000 hücre) ve oyuk başına 2 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için her bir oyuğa Agregasyon ortamı ekleyin.
  6. Hücrelerin kuyu boyunca eşit dağılımını sağlamak için hücreleri bir P1000 pipet ucuyla birkaç kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Mikro kuyulara kabarcık sokmayın. Mikrokuyucuklardaki hücreleri yakalamak için mikrokuyucuk plakasını 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Mikrokuyucuk plakasını 24 saat agregasyon için nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatörde inkübe edin ve Aşama 5-7 farklılaşmasına geçin.
    NOT: Toplama sırasında plakayı rahatsız etmemeye dikkat edin. Optimum agrega oluşumu için 48 saate kadar inkübasyon süresi gerekebilir.

4. Kit kaynaklı pankreas progenitör kümelerinin hPSC adacıklarına farklılaşması

  1. Aşama 5 gün 1'de, Aşama 5-7 bazal ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve takviyeleri çözdürün (bkz. Tablo 1 ve Tablo 2). Aşama 5-7 bazal ortama takviyeler (son çalışma konsantrasyonlarına) ekleyerek Aşama 5 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  2. Agrega oluşumundan sonra, agrega olmayan hücreleri yüzdürmek için agregaları bir P1000 pipet ucuyla birkaç kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Agregaların yerçekimi ile çökmesine izin verin (~1 dakika bekleyin). Aspire eden agregalardan kaçınırken, harcanan ortamı (yüzen toplanmamış hücreleri içeren) kuyudan mümkün olduğunca nazikçe çıkarın.
  3. Agregaları mikro kuyulardan çıkarmak için taze Aşama 5 ortamını mikro kuyu plakasının yüzeyine kuvvetlice dağıtın. Agregaları ultra düşük ataşman (ULA) 6 kuyucuğuna aktarın. Agregaları mikro kuyulardan tamamen almak için Aşama 5 ortamı ile bir kez durulayın.
  4. ULA 6 kuyularındaki tüm agregaları toplayın, agregaları Aşama 5 ortamında yeniden süspanse edin ve yoğunluğu 100 μL başına 20 kümeye ayarlayın (örneğin, her kuyudan ~1.200 kümenin alınması beklenir. 1,200 kümeyi 6 mL Aşama 5 ortamında yeniden süspanse edin). ULA düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL Aşama 5 ortamı dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Köşe ve kenar kuyularını 200 μL DPBS ile doldurun.
    NOT: Daha fazla buharlaşmaya eğilimli olduklarından, agregaları kültürlemek için kenar kuyularını kullanmaktan kaçının; Aksi takdirde, kenarlar boyunca buharlaşmayı en aza indirmek için tasarlanmış 96 oyuklu bir plaka kullanın (örneğin, yerleşik hendeklere sahip 96 oyuklu plakalar) veya kültür plakasını yüksek nemli bir mikro iklimlendirme hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
  5. ULA düz tabanlı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 100 μL küme yeniden süspansiyonu ekleyin, bu da oyuk başına ortalama 20 küme içeren toplam 150 μL kültür ortamı ile sonuçlanır.
    NOT: 96 kuyucuğa dağıtmadan önce her seferinde küme yeniden süspansiyonunu yavaşça karıştırın.
  6. Kültür plakalarını nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatörde 24 saat boyunca düz bir yüzeye yerleştirin.
  7. Aşama 5 gün 2'de, adım 4.1'i izleyerek Aşama 5 ortamını hazırlayın.
  8. Her bir oyuktan harcanan ortamın ~90 μL'sini çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve 100 μL Aşama 5 ortamı ile yenileyin.
  9. Aşama 5 3. günde, 4.7-4.8 adımlarını tekrarlayın. Aşama 6'ya geçin.
  10. Aşama 6 gün 1'de, Aşama 5-7 bazal ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve takviyeleri çözdürün (bkz. Tablo 1 ve Tablo 2). Aşama 5-7 bazal ortama takviyeler (son çalışma konsantrasyonlarına) ekleyerek Aşama 6 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  11. Harcanan ortamın ~ 90 μL'sini çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve oyuk başına 100 μL Aşama 6 ortamı ile yenileyin.
  12. Aşama 6 2. günden 8. güne kadar 4.10-4.11 adımlarını tekrarlayın. Aşama 7'ye geçin.
  13. Aşama 7 gün 1'de, Aşama 5-7 bazal ortamı 37 ° C'lik bir banyoda ısıtın ve takviyeleri çözdürün (bkz. Tablo 1 ve Tablo 2). Aşama 5-7 bazal ortamına takviyeler (son çalışma konsantrasyonlarına) ekleyerek Aşama 7 ortamını hazırlayın. İyice karıştırın ve hemen kullanın.
  14. Harcanan ortamın ~90 μL'sini çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve oyuk başına 100 μL Aşama 7 ortamı ile yenileyin.
  15. Aşama 7 2. günden 12. güne kadar 4.13-4.14 arasındaki adımları tekrarlayın. İn vitro karakterizasyona geçin.

5. Akış sitometrik analizi

  1. Kültür ortamını çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkayın. Kültürleri (düzlemsel progenitör hücreler veya farklılaşan kümeler) 37 °C'de 10-12 dakika inkübe ederek ayrışma reaktifi ile tek hücrelere ayırın. FACS tamponu ile durulayın ve 300 × g'da 5 dakika döndürün.
  2. Hücre peletini FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücre sayımı yapın. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Tek hücreleri 500 μL Fix / Perm tamponunda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca yeniden süspanse edin.
    NOT: Kullanmadan önce Fix/Perma tamponunu oda sıcaklığına getirin. Fix/Perm tamponu paraformaldehit (PFA) içerir. PFA'yı bir çeker ocakta dikkatlice kullanın ve kurumsal yönergelere göre atın.
  3. 500 × g'da 3 dakika döndürün, 500 μL 1x Perm/Yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve 300 μL 1x Perm/Yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. 100 μL tek hücreli resüspansiyonu (her biri 2.5-3 × 105 hücre içeren) boyanmamış kontrol, izotip kontrolü ve antikor boyama için üç mikrofüj tüpüne aktarın (numune antikoru ve seyreltme bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın). Oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin ve folyo ile örtün.
  4. 500 × g'da 3 dakika döndürün. 500 μL 1x Perma/Yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Numuneleri 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve boyanmış hücreleri bir akış sitometresi ve yazılımı (örneğin, FlowJo) ile analiz edin (belirli aşamalarda belirteçlerin hücre içi boyanması için Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: Numuneler hemen test edilmezse, ışıktan koruyarak 4°C'de saklayın. Geçit stratejisi için, akış verileri önce küçük hücresel kalıntıları gidermek için saçılma özellikleri (FSC-A ve SSC-A) ile geçitlenir, ardından singlet'leri tanımlamak için FSC-A ve FSC genişlik özellikleri gelir. Pozitif ve negatif geçitleme, kök hücre kontrolleri ve/veya boyanmamış, izotip kontrolleri ile belirlenir.

6. Tüm montaj immün boyama

  1. Kümeleri bir mikrofüj tüpünde toplayın. Kümeleri yerçekimi ile yerleştirin. Harcanan ortamı aspire edin ve bir kez 1 mL PBS (kalsiyum ve magnezyum ile) ile durulayın. Kümeleri gece boyunca 1°C'de 4 mL %4 PFA ile sabitleyin.
  2. PBST ile bir kez durulayın ve 20-30 kümeyi 500 μL %0.3 TritonX-100 ile bir mikrofüj tüpünde ortam sıcaklığında en az 6 saat eğimli çalkalayıcı üzerinde geçirgenleştirin.
    NOT: Büyük kümeler için daha uzun bir geçirgenlik süresi (24 saate kadar) gereklidir.
  3. Kümeleri, bir eğimli çalkalayıcı üzerinde ortam sıcaklığında 100 μL bloke edici tamponda 1 saat inkübe edin. Bloke edici tamponu çıkarın ve kümeleri, bir tilt çalkalayıcı üzerinde gece boyunca ortam sıcaklığında antikor seyreltme tamponunda seyreltilmiş 100 μL birincil antikor ile inkübe edin.
    NOT: Görüntüleme sırasında arka plan güçlüyse, 4 °C'de primer antikorlarla inkübe edin.
  4. 3 x 30 dakika 500 μL PBST ile eğimli bir çalkalayıcıda iyice yıkayın (eğim açısı 8'e ayarlanmış, hız 20'ye ayarlanmıştır).
  5. Kümeleri, bir tilt çalkalayıcı üzerinde gece boyunca ortam sıcaklığında antikor seyreltme tamponunda 100 μL ikincil antikor ile inkübe edin. Tüpleri folyo ile örtün.
    NOT: Görüntüleme sırasında arka plan güçlüyse, 4 °C'de ikincil antikorlarla inkübe edin.
  6. 500 μL PBST ile bir kez durulayın. 100 μL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) çözeltisi (PBST'de 10 μg/mL) ekleyin ve ortam sıcaklığında 10-15 dakika boyayın. Folyo ile örtün ve ışıktan koruyun.
  7. 3 x 30 dakika 500 μL PBST ile eğimli bir çalkalayıcıda iyice yıkayın. Yıkama aşamasında tüpleri folyo ile örtün.
  8. Kümeleri, üreticinin protokolüne ve yayınlanmış protokollere göre doku yapıştırıcısı ile önceden kaplanmış görüntüleme odası slaytlarına (Malzeme Tablosuna bakın)yapıştırın 20,21.
  9. Doku temizleme ortamı (PBS çözeltisinde% 80 gliserol) ile monte edin ve cam lameller ile örtün. Konfokal görüntülemeye kadar ışıktan koruyunuz.
    NOT: Numuneler hemen görüntülenmezse, bunları ışıktan koruyarak 4 °C'de saklayın.

7. Statik GSIS testi

  1. 37 °C'lik bir banyoda sıcak düşük glikozlu Kreb's Ringer bikarbonat (3.3G KRB) tamponu, yüksek glikozlu (16.7G) KRB tamponu ve 30 mM KCl KRB tamponu.
  2. Boyuta uygun kümeleri elle seçin ve 2 mL sıcak 3.3G KRB tamponu ile durulayın. Kümeleri doku kültürü ile muamele edilmemiş 6 oyuklu plakaya aktarın ve nemlendirilmiş 37 °C,% 5 CO 2 inkübatörde 1 saat boyunca2 mL veya ılık 3.3G KRB tamponunda dengeleyin.
  3. Dengelemeden sonra, tahlil odasını ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 μL sıcak 3.3G KRB tamponu ile doldurun. Beş kümeyi elle seçin ve bunları test odasının merkezine aktarın. Nemlendirilmiş 37 °C, %5CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
    NOT: Minimum orta hacimli kümeleri aktarmak için 10 μL pipet uçları kullanın.
  4. Süpernatanın ~ 100 μL'sini dikkatlice toplayın ve bazal insülin sekresyonunun ölçümüne kadar -30 ° C'de saklayın (bkz. adım 7.9). Bu adımda herhangi bir kümeyi kurutmayın veya kaybetmeyin. Hemen tahlil odasına 100 μL ılık 16.7G KRB tamponu ekleyin ve aynı kümeleri nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
  5. Süpernatantın ~ 100 μL'sini dikkatlice toplayın ve glikozla uyarılan insülin sekresyonunun ölçümüne kadar -30 ° C'de saklayın (bkz. adım 7.9). Hemen tahlil odasına 100 μL ılık 30 mM KCl KRB tamponu ekleyin ve aynı kümeleri nemlendirilmiş 37 °C,% 5CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
  6. Süpernatanın ~ 100 μL'sini dikkatlice toplayın ve KCl ile uyarılan insülin sekresyonunun ölçümüne kadar -30 ° C'de saklayın (bkz. adım 7.9). Hemen tahlil odasına 100 μL RIPA lizis tamponu ekleyin ve beş kümenin tümünü içeren lizis tamponunu bir mikrofüj tüpüne aktarın.
  7. İsteğe bağlı) Bir P200 pipet ucuyla kuvvetli bir şekilde öğüterek kümeleri manuel olarak kırın. 30 saniye boyunca girdap yapın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, ardından 30 saniye daha girdap yapın.
    NOT: Girdap ve buz üzerinde yeterli inkübasyon süresi ile tam liziz sağlayın.
  8. 8.000 × g'da 1 dakika döndürün. Süpernatanı toplayın ve toplam insülin içeriği ölçülene kadar -30 °C'de saklayın (bkz. adım 7.9).
  9. Üreticinin protokolüne ve yayınlanmış protokollere göre bir İnsan İnsülin ELISA Kiti kullanarak süpernatan numunelerde insan insülinini ölçün20,22.
    NOT: Süpernatan numunelerin tekrar tekrar dondurulmasını ve çözülmesini önleyin. Üçten fazla donma ve çözülme döngüsüne sahip numuneler test edilmemelidir.

Sonuçlar

Kök hücreleri yedi adımda insülin salgılayan hPSC adacıklarına farklılaştırmak için hibrit bir strateji geliştirdik, bu da düzlemsel kültürde ilk dört aşama için bir pankreas progenitör kiti kullanıyor, ardından son üç aşama için statik bir süspansiyon kültüründe daha önce bildirilen bir yöntem6 üzerine inşa edilmiş değiştirilmiş bir protokol kullandık (Şekil 1). Bu protokolle, hücre tohumlamadan (Aşama 0) 24 saat sonra yakın ...

Tartışmalar

Bu makale, in vitro kültürden sonraki 40 gün içinde glikoz tehdidi üzerine insülin salgılayabilen hPSC adacıklarının üretilmesine izin veren yedi aşamalı bir hibrit protokolü açıklamaktadır. Bu çoklu adımlar arasında, kesin endodermin etkin indüksiyonunun, nihai farklılaşma sonuçlarıiçin önemli bir başlangıç noktası oluşturduğuna inanılmaktadır 18,27,28. Üreticinin protokolünde, fark...

Açıklamalar

Timothy J. Kieffer, bu makalenin hazırlanması sırasında ViaCyte'ın bir çalışanıydı. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nin desteğini minnetle kabul ediyoruz. Jia Zhao ve Shenghui Liang, Michael Smith Sağlık Araştırmaları BC Stajyer Ödülü'nün sahipleridir. Mitchell J.S. Braam, Mitacs Hızlandırma Bursu'nun bir alıcısıdır. Diepiriye G. Iworima, Alexander Graham Bell Kanada Yüksek Lisans Bursu ve CFUW 1989 Ecole Polytechnique Hatıra Ödülü sahibidir. MCRI ve Monash Üniversitesi'nden Dr. Edouard G. Stanley'e Mel1 INS GFP/W hattını ve Alberta Diyabet Enstitüsü Adacık Çekirdeği'ni insan adacıklarını izole ettiği ve dağıttığı için içtenlikle teşekkür ederiz. Ayrıca British Columbia Üniversitesi'ndeki Yaşam Bilimleri Enstitüsü Görüntüleme ve Akış Sitometrisi tesislerinin desteğini de kabul ediyoruz. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397Thyroid hormone
4% PFA solutionSanta Cruz Biotechnologysc-281692Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottomCorning Costar (VWR)CLS3474Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 platesSTEMCELL Technologies34415400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 platesSTEMCELL Technologies34815800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)R&D SystemsIC2400G1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR&D SystemsIC108G1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR&D SystemsIC0041G1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010Microwell Rinsing Solution
Assay chamberCellvisD35-10-1-NFor static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100For immunostaining procedure
CK19 antibodyDAKOM08881:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucoseSigmaG8769Medium supplement
DAPISigmaD9542For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in whole mount immunofluorescence
DPBSSigmaD8537Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, humanAlpco80-INSHU-E01.1For human insulin measurement
Fatty acid-free BSAProliant68700Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution KitBD Sciences554714Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies7174For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibodySigmaG26541:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibodyThermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-glutamine supplement
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4For tissue clearing and mounting
GSi XXSigma Millipore565789Notch inhibitor
HeparinSigmaH3149Medium supplement
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP antagonist
MAFA antibodyAbcamab264051:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualifiedThermo Fisher Scientific08-774-552Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 mediumLife technologies10372019Base medium
mTeSR1 Complete KitSTEMCELL Technologies85850stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3SigmaS6297Medium supplement
NEUROD1 antibodyR&D SystemsAF27461:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibodyDSHBF55A12-c1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibodyR&D SystemsAF62971:200 in whole mount immunofluorescence
PBSSigmaD8662With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibodyAbcamab472671:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)BD Sciences5630231:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BD Sciences5621611:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5546801:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)BD Sciences5645631:200 in flow cytometry
R428 Cayman Chemicals21523AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-transSigmaR2625Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10xSigma20-188For hormone extraction
SANT-1SigmaS4572SHH inhibitor
SLC18A1 antibodySigmaHPA0637971:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibodySigmaHPA0194721:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor KitSTEMCELL Technologies05120Basal media and supplements included
Synaptophysin antibodyNovusNB120-166591:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100SigmaX100For permeabilization
Trolox Sigma Millipore648471Vitamin E analog
TrypLE Enzyme ExpressLife technologies12604-021cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibodyR&D SystemsAF35861:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK inhibitor
Zinc sulfateSigmaZ0251Medium supplement

Referanslar

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 196ns lin retenAdac k K meleriBeta H creleriDiyabet TedavisiProtokolPankreatik Progenit r KitiR protokolMikrokuyu PlaklarEndokrin Farkl la mas96 oyuklu Statik S spansiyon Formatn Vitro KarakterizasyonFonksiyonel De erlendirmeHPSC Kaynakl Adac klarK k H cre K lt r TeknikleriBiyolojik Deneyler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır