Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Humanas em Aglomerados de Ilhotas Produtoras de Insulina

Resumo

A diferenciação de células-tronco em ilhotas fornece uma solução alternativa ao tratamento convencional do diabetes e à modelagem da doença. Descrevemos um protocolo detalhado de cultura de células-tronco que combina um kit de diferenciação comercial com um método previamente validado para auxiliar na produção de ilhotas derivadas de células-tronco secretoras de insulina em um prato.

Resumo

A diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em células beta secretoras de insulina fornece material para investigar a função das células beta e o tratamento do diabetes. No entanto, permanecem desafios na obtenção de células beta derivadas de células-tronco que mimetizem adequadamente as células beta humanas nativas. Com base em estudos anteriores, células de ilhotas derivadas de hPSC foram geradas para criar um protocolo com melhores resultados de diferenciação e consistência. O protocolo aqui descrito utiliza um kit progenitor pancreático durante os estágios 1-4, seguido por um protocolo modificado de um artigo publicado anteriormente em 2014 (doravante denominado "protocolo R") durante os estágios 5-7. Procedimentos detalhados para o uso do kit de progenitores pancreáticos e placas de micropoços de 400 μm de diâmetro para gerar clusters de progenitores pancreáticos, protocolo R para diferenciação endócrina em um formato de suspensão estática de 96 poços e caracterização in vitro e avaliação funcional de ilhotas derivadas de hPSC são incluídos. O protocolo completo leva 1 semana para a expansão inicial da hPSC seguida por ~5 semanas para obter ilhotas hPSC produtoras de insulina. Pessoal com técnicas básicas de cultura de células-tronco e treinamento em ensaios biológicos pode reproduzir esse protocolo.

Introdução

As células beta pancreáticas secretam insulina respondendo a aumentos nos níveis de glicose no sangue. Pacientes sem produção suficiente de insulina devido à destruição autoimune das células beta no diabetes tipo 1 (DM1)¹, ou devido à disfunção das células beta no diabetes tipo 2 (DM2)², são tipicamente tratados com a administração de insulina exógena. Apesar dessa terapia que salva vidas, ela não pode corresponder precisamente ao controle requintado da glicose no sangue, como alcançado pela secreção dinâmica de insulina das células beta de boa-fé. Como tal, os pacientes frequentemente sofrem as consequências de episódios hipoglicêmicos com risco de vida e outras complicações resultantes de excursões hiperglicêmicas crônicas. O transplante de ilhotas de cadáveres humanos restaura com sucesso o controle glicêmico rigoroso em pacientes com DM1, mas é limitado pela disponibilidade de ilhotas doadoras e dificuldades na purificação de ilhotas saudáveis para transplante ^3,4. Este desafio pode, em princípio, ser resolvido com o uso de hPSCs como material de partida alternativo.

As estratégias atuais de geração de ilhotas secretoras de insulina a partir de hPSCs in vitro frequentemente visam mimetizar o processo de desenvolvimento do pâncreas embrionário in vivo ^5,6. Isso requer conhecimento das vias de sinalização responsáveis e adição cronometrada de fatores solúveis correspondentes para mimetizar estágios críticos do pâncreas embrionário em desenvolvimento. O programa pancreático inicia-se com o comprometimento na endoderme definitiva, que é marcada pelos fatores de transcrição forkhead box A2 (FOXA2) e região determinante do sexo Y-box 17 (SOX17)⁷. A diferenciação sucessiva da endoderme definitiva envolve a formação de um tubo intestinal primitivo, padronizado em um intestino anterior posterior que expressa a homeocaixa 1 pancreática e duodenal (PDX1)^7,8,9, e expansão epitelial em progenitores pancreáticos que co-expressam PDX1 e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)^10,11.

Um maior comprometimento com as células das ilhotas endócrinas é acompanhado pela expressão transitória do regulador mestre pró-endócrino neurogenina-3 (NGN3)12 e indução estável dos principais fatores de transcrição diferenciação neuronal 1 (NEUROD1) e NK2 homeobox 2 (^NKX2.2)¹³. As principais células que expressam hormônios, como células beta produtoras de insulina, células alfa produtoras de glucagon, células delta produtoras de somatostatina e células PPY produtoras de polipeptídeos pancreáticos, são subsequentemente programadas. Com esse conhecimento, bem como descobertas de extensos estudos de triagem de drogas em alto rendimento, avanços recentes têm possibilitado a geração de ilhotas hPSC com células semelhantes às células beta capazes de secreção de insulina 14,15,16,17,18,19.

Protocolos step-wise têm sido relatados para gerar células beta responsivas à glicose 6,14,18,19. Com base nesses estudos, o presente protocolo envolve o uso de um kit de progenitores pancreáticos para gerar células progenitoras pancreáticas PDX1+/NKX6.1⁺ em uma cultura plana, seguido pela agregação da placa de micropoços em agrupamentos de tamanho uniforme e diferenciação adicional para ilhotas hPSC secretoras de insulina com o protocolo R em uma cultura de suspensão 3D estática. Análises de controle de qualidade, incluindo citometria de fluxo, imunomarcação e avaliação funcional, são realizadas para caracterização rigorosa das células diferenciadoras. Este trabalho fornece uma descrição detalhada de cada etapa da diferenciação dirigida e delineia as abordagens de caracterização in vitro.

Protocolo

Este protocolo é baseado no trabalho com linhagens hPSC, incluindo H1, HUES4 PDXeG e Mel1 INS^GFP/W, em condições livres de alimentadores. Um procedimento passo a passo é detalhado nesta seção, com dados de apoio da diferenciação de Mel1 INS^GFP/W na seção de resultados representativos. Recomendamos que seja necessária uma otimização adicional ao trabalhar com outras linhas hPSC que não são indicadas aqui. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os reagentes e soluções usados neste protocolo.

1. Preparação de meios e soluções de diferenciação

NOTA: Consulte a Tabela 1 para todas as soluções a serem preparadas e a Tabela 2 para os meios de diferenciação.

1. Preparar todos os meios e reagentes para cultura celular em gabinete estéril de biossegurança. Aquecer brevemente as soluções relacionadas com cultura celular e o meio basal a 37 °C num banho antes da utilização.
   NOTA: Conforme descrito abaixo, faça novos meios de diferenciação diariamente, adicionando suplementos e use-os no mesmo dia. Alternativamente, o kit progenitor pancreático oferece a opção de preparar um volume maior com antecedência que pode ser usado durante vários dias seguindo o protocolo do fabricante. Ambos os métodos de preparação de mídia provam funcionar bem. Note que não é recomendado deixar a mídia por um tempo prolongado no banho-maria. Ao preparar meios frescos todos os dias, recomenda-se aliquotar suplementos para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.

2. Diferenciação de hPSCs em células progenitoras pancreáticas

1. Manter hPSCs indiferenciadas em vasos revestidos com Matrigel em meio completo mTeSR1 e realizar trocas de meio diariamente. Durante a cultura de manutenção, as hPSCs de passagem a cada 3-4 dias quando as células atingem ~70% de confluência usando o reagente de dissociação celular seguindo o protocolo do fabricante. Para iniciar a diferenciação, dissociar as células em células únicas e semeá-las em placas tratadas com cultura de tecidos de 6 ou 12 poços (com volumes médios de 2 mL ou 1 mL por poço, respectivamente).
   NOTA: Consulte a Tabela 1 para instruções relacionadas ao armazenamento do meio basal da endoderme e suas alíquotas.
2. Poços de cultura pré-revestidos com Matrigel qualificado para hESC (diluído em DMEM/F12 gelado conforme recomendado pelo protocolo do fabricante) e colocar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ por 30 min.
3. Mova a placa revestida com Matrigel para a temperatura ambiente (utilizar no prazo de 3 h).
4. Aspirar o meio gasto da cultura hPSC e enxaguar uma vez com DPBS. Dissociar a cultura de hPSC em células únicas com enzima de dissociação celular a 37 °C por 3-5 min. Enxaguar as células adicionando meio DMEM/F12 quente, transferir para um tubo cônico de 15 mL ou 50 mL e girar a 300 × g por 5 min.
5. Ressuspender o pellet celular com meio completo de células-tronco mais 10 μM Y-27632 e realizar contagem de células vivas (azul de tripano negativo) com hemocitômetro ou contador automático de células. Aspirar Matrigel diluído e semear imediatamente células vivas a uma densidade de 1,60-1,80 × 10⁵/^cm2 em poços revestidos com Matrigel e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h. Prossiga para o Estágio 1.
   NOTA: Isso resultará em ~95% de confluência inicial para iniciar a diferenciação. De acordo com o protocolo do fabricante, recomenda-se uma densidade de semeadura de 2,6 × 10⁵/cm² . Recomenda-se testar várias densidades de semeadura para determinar o valor ideal para uma linhagem celular e verificar a viabilidade celular. Se a viabilidade for inferior a 80%, não proceda à diferenciação. A baixa viabilidade celular pode ser resultado de superdigestão ou supertrituração durante a colheita ou deixar as células por um tempo prolongado em meio DMEM/F12 antes da semeadura.
6. Na Fase 1 dia 1, aquecer brevemente a endoderme basal a 37 °C em banho e descongelar o Suplemento MR e CJ. Preparar o meio Estágio 1A adicionando Suplemento MR e CJ ao meio basal endodérmico. Misture bem e use imediatamente.
7. Aspirar o meio irradiado dos poços, adicionar o meio Estágio 1A e incubar em estufa umidificada a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h.
   NOTA: As etapas de lavagem são desnecessárias. Remova as células soltas da cultura agitando suavemente a placa de cultura antes da troca do meio. Evite interromper a monocamada não tocando a ponta da pipeta no fundo do poço durante a remoção do meio e através da adição suave do meio.
8. Na Fase 1 dia 2, aquecer brevemente o meio basal endodérmico em banho a 37 °C e descongelar o Suplemento CJ. Prepare o meio Estágio 1B adicionando Suplemento CJ ao meio basal endodérmico. Misture bem e use imediatamente.
9. Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 1B e incubar em estufa umidificada a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h.
10. No Estágio 1 dia 3, repita as etapas 2.8-2.9. Prossiga para o Estágio 2.
11. No Estágio 2 dia 1, quente pancreático Estágio 2-4 Meio Basal em um banho de 37 °C e descongelar Suplemento 2A e 2B. Preparar o meio Estágio 2A adicionando Suplemento 2A e 2B ao Estágio pancreático 2-4 Meio Basal. Misture bem e use imediatamente.
12. Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 2A e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h.
13. No Estágio 2 dia 2, quente pancreático Estágio 2-4 Meio Basal em um banho de 37 °C e descongelar Suplemento 2B. Preparar o meio Estágio 2B adicionando Suplemento 2B ao Estágio pancreático 2-4 Meio Basal. Misture bem e use imediatamente.
14. Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 2B e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h.
15. No Estágio 2 dia 3, repita as etapas 2.13-2.14. Prossiga para o Estágio 3.
16. No Estágio 3 dia 1, pancreático quente Estágio 2-4 Meio Basal em um banho de 37 °C e descongelar Suplemento 3. Prepare o meio do estágio 3 adicionando o suplemento 3 ao meio basal do estágio pancreático 2-4. Misture bem e use imediatamente.
17. Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 3 e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h.
18. Na fase 3 dia 2 e dia 3, repita os passos 2.16-2.17. Prossiga para o Estágio 4.
19. No Estágio 4 dia 1, pancreático quente Estágio 2-4 Meio Basal em um banho de 37 °C e descongelar Suplemento 4. Prepare o meio do estágio 4 adicionando o suplemento 4 ao meio basal do estágio pancreático 2-4. Misture bem e use imediatamente.
20. Aspirar o meio gasto dos poços, adicionar o meio Estágio 4 e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h.
21. No Estágio 4 do dia 2 ao dia 4, repita as etapas 2.19-2.20. Prossiga para as etapas de agregação.

3. Agregação em grupos de progenitores pancreáticos utilizando placas de micropoços de 400 μm de diâmetro

1. No Estágio 4 dia 5, pré-trate os micropoços (por exemplo, formato de placa de 24 poços) com 500 μL de Solução de Enxágue Antiaderente por poço.
2. Prepare uma placa de equilíbrio e centrifugar a placa de micropoço a 1.300 × g por 5 min.
   NOTA: Verifique a placa sob um microscópio para garantir que não restem bolhas nos micropoços. Centrifugar novamente por mais 5 minutos se as bolhas permanecerem presas em qualquer micropoço.
3. Aspirar a Solução de Enxágue Antiaderente dos poços e enxaguar uma vez com 1 mL de DPBS. Aspirar a DPBS dos poços e adicionar 1 mL de meio de agregação a cada poço.
4. Retire o meio gasto das culturas progenitoras pancreáticas e lave uma vez com DPBS. Dissociar as culturas em células únicas com reagente de dissociação a 37 °C por 10-12 min. Enxaguar as células com DMEM/F12 quente, transferi-las para um tubo e girar a 300 × g por 5 min.
5. Ressuspenda a pastilha de células no meio de agregação e execute a contagem de células vivas. Semeando 2,4-3,6 milhões de células totais por poço (ou seja, 2.000-3.000 células por micropoço) e adicionando meio de agregação a cada poço para atingir um volume final de 2 mL por poço.
6. Pipetar suavemente as células para cima e para baixo várias vezes com uma ponta de pipeta P1000 para garantir uma distribuição uniforme das células por todo o poço. Não introduza bolhas em micropoços. Centrifugar a placa do micropoço a 300 × g por 5 min para capturar as células nos micropoços. Incubar a placa de micropoço em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ para agregação de 24 h e prosseguir para os estágios 5-7 de diferenciação.
   OBS: Cuidado para não atrapalhar a placa durante o tempo de agregação. Até 48 h de tempo de incubação podem ser necessários para a formação ideal de agregados.

4. Diferenciação de grupos de progenitores pancreáticos derivados de kits em ilhotas hPSC

1. No Estágio 5 dia 1, aquecer o meio basal do Estágio 5-7 em um banho de 37 °C e descongelar suplementos (ver Tabela 1 e Tabela 2). Prepare o meio do Estágio 5 adicionando suplementos (às concentrações finais de trabalho) ao meio basal do Estágio 5-7. Misture bem e use imediatamente.
2. Após a formação do agregado, pipetar suavemente os agregados para cima e para baixo várias vezes com uma ponta de pipeta P1000 para flutuar quaisquer células não agregadas. Deixe os agregados se acomodarem por gravidade (aguarde ~1 min). Remova suavemente o meio gasto (contendo as células flutuantes não agregadas) do poço tanto quanto possível, evitando aspirar agregados.
3. Dispense o meio fresco do Estágio 5 vigorosamente na superfície da placa do micropoço para desalojar os agregados dos micropoços. Transfira agregados para 6 poços de fixação ultrabaixa (ULA). Enxaguar uma vez com meio Estágio 5 para recuperar completamente os agregados dos micropoços.
4. Coletar todos os agregados nos poços ULA 6, ressuspender agregados em meio de Estágio 5 e ajustar a densidade para 20 clusters por 100 μL (por exemplo, espera-se que ~1.200 clusters sejam recuperados de cada poço. Ressuspender 1.200 cachos em 6 mL do meio Estágio 5). Use uma pipeta multicanal para distribuir 50 μL de meio Estágio 5 em cada poço de uma placa ULA de fundo plano de 96 poços. Preencha os poços de canto e borda com 200 μL de DPBS.
   OBS: Evite utilizar os poços de borda para cultivo de agregados, pois eles são propensos a maior evaporação; caso contrário, use uma placa de 96 poços projetada para minimizar a evaporação ao longo das bordas (por exemplo, placas de 96 poços com fossos embutidos) ou coloque a placa de cultura em uma incubadora de cultura de células de microclima de alta umidade.
5. Adicionar 100 μL da ressuspensão de cluster em cada poço da placa de fundo plano de 96 poços da ULA, resultando em um total de 150 μL de meio de cultura contendo uma média de 20 cachos por poço.
   NOTA: Misture suavemente a ressuspensão do cluster todas as vezes antes de distribuir em 96 poços.
6. Colocar as placas de cultura numa superfície plana numa incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO₂ durante 24 horas.
7. No Estágio 5 dia 2, prepare o Estágio 5 médio seguindo o passo 4.1.
8. Use uma pipeta multicanal para remover ~90 μL do meio gasto de cada poço e atualize com 100 μL do meio Estágio 5.
9. No Estágio 5 dia 3, repita as etapas 4.7-4.8. Prossiga para o Estágio 6.
10. No Estágio 6 dia 1, aquecer o meio basal do Estágio 5-7 em um banho de 37 °C e descongelar suplementos (ver Tabela 1 e Tabela 2). Prepare o meio do Estágio 6 adicionando suplementos (às concentrações finais de trabalho) ao meio basal do Estágio 5-7. Misture bem e use imediatamente.
11. Use uma pipeta multicanal para remover ~90 μL do meio gasto e atualizar com 100 μL de meio Estágio 6 por poço.
12. No Estágio 6 do dia 2 ao dia 8, repita as etapas 4.10-4.11. Prossiga para o Estágio 7.
13. No Estágio 7 dia 1, aquecer o meio basal do Estágio 5-7 em um banho de 37 °C e descongelar suplementos (ver Tabela 1 e Tabela 2). Prepare o meio do Estágio 7 adicionando suplementos (às concentrações finais de trabalho) ao meio basal do Estágio 5-7. Misture bem e use imediatamente.
14. Use uma pipeta multicanal para remover ~90 μL do meio gasto e atualizar com 100 μL de meio Estágio 7 por poço.
15. No Estágio 7 do dia 2 ao dia 12, repita os passos 4.13-4.14. Proceder à caracterização in vitro .

5. Análise por citometria de fluxo

1. Retire os meios de cultura e lave uma vez com DPBS. Dissociar as culturas (células progenitoras planas ou clusters diferenciadores) em células únicas com reagente de dissociação, incubando a 37 °C por 10-12 min. Enxaguar com tampão FACS e girar a 300 × g por 5 min.
2. Ressuspenda a pastilha de célula no buffer FACS e execute a contagem de células. Spin cells a 300 × g por 5 min. Ressuspender células individuais em 500 μL de tampão Fix/Perm por 10 min à temperatura ambiente.
   NOTA: Leve o buffer Fix/Perm à temperatura ambiente antes de usar. O buffer Fix/Perm contém paraformaldeído (PFA). Manusear cuidadosamente o PFA em uma capela de fumaça e descartar de acordo com as diretrizes institucionais.
3. Gire a 500 × g por 3 min, lave duas vezes com 500 μL de 1x Perm/Wash buffer e ressuspenda em 300 μL de 1x Perm/Wash buffer. Transferir 100 μL de ressuspensão de célula única (cada uma contendo 2,5-3 × 10⁵ células) para três tubos de microfuga para controle não corado, controle de isotipos e coloração de anticorpos (consulte Tabela de materiais para obter informações sobre anticorpos e diluição de amostras). Incubar durante 45 min à temperatura ambiente e cobrir com papel alumínio.
4. Gire a 500 × g por 3 min. Lavar duas vezes com 500 μL de 1x Perm/Wash buffer. Ressuspender as amostras em 100 μL de tampão FACS e analisar as células coradas (ver Tabela de Materiais para coloração intracelular de marcadores em estágios específicos) com um citômetro de fluxo e software (por exemplo, FlowJo).
   NOTA: Se as amostras não forem imediatamente ensaiadas, armazená-las a 4°C protegidas da luz. Para a estratégia de limitação, os dados de fluxo são primeiramente limitados por propriedades de dispersão (FSC-A e SSC-A) para remover pequenos detritos celulares, seguidas pelas propriedades FSC-A e FSC-width para identificar singlets. O confinamento positivo e negativo é determinado por controles de células-tronco e/ou controles isotípicos não corados.

6. Imunomarcação de montagem inteira

1. Colete cachos em um tubo de microfuga. Estabeleça aglomerados por gravidade. Aspirar o meio gasto e enxaguar uma vez com 1 mL de PBS (com cálcio e magnésio). Fixar os cachos com 1 mL de PFA a 4% a 4°C durante a noite.
2. Enxaguar uma vez com PBST e permeabilizar 20-30 cachos com 500 μL de TritonX-100 a 0,3% em um tubo de microfuga à temperatura ambiente por pelo menos 6 h em um agitador de inclinação.
   NOTA: Um tempo de permeabilização mais longo (até 24 h) é necessário para grandes clusters.
3. Incubar os cachos em 100 μL de tampão de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h num agitador de inclinação. Remova o tampão de bloqueio e incube os aglomerados com 100 μL de anticorpos primários diluídos em tampão de diluição de anticorpos à temperatura ambiente durante a noite em um agitador de inclinação.
   NOTA: Se o fundo for forte durante a aquisição de imagens, incubar com anticorpos primários a 4 °C.
4. Lave 3 x 30 min com 500 μL de PBST completamente em um agitador de inclinação (ângulo de inclinação definido em 8, velocidade definida em 20).
5. Incubar os clusters com 100 μL de anticorpos secundários em tampão de diluição de anticorpos à temperatura ambiente durante a noite em um agitador de inclinação. Cubra os tubos com papel alumínio.
   NOTA: Se o fundo for forte durante a aquisição de imagens, incubar com anticorpos secundários a 4 °C.
6. Enxaguar uma vez com 500 μL de PBST. Adicionar 100 μL da solução de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (10 μg/mL em PBST) e corar à temperatura ambiente por 10-15 min. Cubra com papel alumínio e proteja da luz.
7. Lave 3 x 30 min com 500 μL de PBST completamente em um agitador basculante. Cubra os tubos com papel alumínio durante a etapa de lavagem.
8. Fixar os agrupamentos em lâminas de câmara de imagem (ver Tabela de Materiais) pré-revestidas com adesivo tecidual de acordo com o protocolo do fabricante e protocolos publicados^20,21.
9. Monte com meio de limpeza de tecido (glicerol 80% em solução de PBS) e cubra com lamínulas de vidro. Proteger da luz até imagens confocais.
   NOTA: Se as amostras não forem fotografadas imediatamente, armazene-as a 4 °C protegidas da luz.

7. Ensaio GSIS estático

1. Tampão de bicarbonato de Ringer (3,3G KRB) de baixa glicose quente de Kreb, tampão de alta glicose (16,7G) de KRB e tampão de KCl KRB de 30 mM em banho de 37 °C.
2. Escolha manualmente os cachos de tamanho compatível e enxágue com 2 mL de tampão KRB 3,3G quente. Transfira os aglomerados para uma placa de 6 poços não tratada com cultura de tecidos e equilibre em 2 mL de tampão 3,3G KRB aquecido por 1 h em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ .
3. Após o equilíbrio, encha a câmara de ensaio (ver Tabela de Materiais) com 100 μL de tampão 3,3G KRB quente. Escolha manualmente cinco clusters e transfira-os para o centro da câmara de ensaio. Incubar por 30 min em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ .
   NOTA: Use pontas de pipeta de 10 μL para transferir clusters com volume médio mínimo.
4. Recolher cuidadosamente ~100 μL do sobrenadante e armazená-lo a -30 °C até à medição da secreção basal de insulina (ver passo 7.9). Não seque nem perca cachos nesta etapa. Adicionar imediatamente 100 μL de tampão 16,7G KRB quente na câmara de ensaio e incubar os mesmos cachos por 30 min em uma incubadora umidificada a 37 °C, 5% CO₂ .
5. Recolher cuidadosamente ~100 μL do sobrenadante e armazená-lo a -30 °C até à medição da secreção de insulina estimulada por glicose (ver passo 7.9). Adicionar imediatamente 100 μL de tampão KCl KRB 30 mM quente na câmara de ensaio e incubar os mesmos cachos durante 30 min numa incubadora humidificada a 37 °C, 5% CO₂ .
6. Recolher cuidadosamente ~100 μL do sobrenadante e armazenar a -30 °C até à medição da secreção de insulina estimulada por KCl (ver passo 7.9). Adicionar imediatamente 100 μL de tampão de lise RIPA na câmara de ensaio e transferir o tampão de lise contendo todos os cinco clusters para um tubo de microfuga.
7. Opcional) Quebre os cachos manualmente por trituração vigorosa com uma ponteira de pipeta P200. Vórtice por 30 s e incube no gelo por 30 min seguido por mais 30 s de vórtice.
   NOTA: Garantir a lise completa por vórtice e tempo suficiente de incubação no gelo.
8. Gire a 8.000 × g por 1 min. Recolher o sobrenadante e conservar a -30 °C até à medição do teor total de insulina (ver passo 7.9).
9. Dosagem de insulina humana nas amostras sobrenadantes utilizando um Kit ELISA de Insulina Humana de acordo com o protocolo do fabricante e protocolos publicados^20,22.
   NOTA: Evitar o congelamento e descongelamento repetidos de amostras sobrenadantes. Amostras com mais de três ciclos de congelamento e descongelamento não devem ser ensaiadas.

Resultados

Desenvolvemos uma estratégia híbrida para diferenciar células-tronco em ilhotas hPSC secretoras de insulina em sete etapas, que utiliza um kit de progenitores pancreáticos para os quatro primeiros estágios em cultura plana, seguido por um protocolo modificado baseado em um método previamente relatado⁶ em uma cultura de suspensão estática para os últimos três estágios (Figura 1). Com esse protocolo, garantir uma cultura de quase confluência (90%-100%) em 24...

Discussão

Este trabalho descreve um protocolo híbrido de sete estágios que permite a geração de ilhotas hPSC capazes de secretar insulina após desafio glicêmico dentro de 40 dias de cultura in vitro. Dentre essas múltiplas etapas, acredita-se que a indução eficiente da endoderme definitiva seja um importante ponto de partida para os resultados finais de^{diferenciação18,27,28}. No protocolo do fabricante, uma densidade de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma	T6397	Thyroid hormone
4% PFA solution	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom	Corning Costar (VWR)	CLS3474	Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates	STEMCELL Technologies	34415	400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates	STEMCELL Technologies	34815	800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)	R&D Systems	IC2400G	1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control	R&D Systems	IC108G	1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)	BD Sciences	566032	1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control	R&D Systems	IC0041G	1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)	BD Pharmingen	565831	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565689	1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	563338	1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	562594	1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	557714	1:50 in flow cytometry
ALK5i II	Cayman Chemicals	14794	TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Microwell Rinsing Solution
Assay chamber	Cellvis	D35-10-1-N	For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	BP1600-100	For immunostaining procedure
CK19 antibody	DAKO	M0888	1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose	Sigma	G8769	Medium supplement
DAPI	Sigma	D9542	For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330032	Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555	Life technologies	A21432	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647	Life technologies	A21447	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555	Life technologies	A31570	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Life technologies	A31571	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555	Life technologies	A31572	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647	Life technologies	A31573	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647	Life technologies	A21448	1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS	Sigma	D8537	Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human	Alpco	80-INSHU-E01.1	For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA	Proliant	68700	Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit	BD Sciences	554714	Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody	Sigma	G2654	1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA1-37782	1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)	Gibco	35050061	L-glutamine supplement
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-4	For tissue clearing and mounting
GSi XX	Sigma Millipore	565789	Notch inhibitor
Heparin	Sigma	H3149	Medium supplement
ITS-X (100x)	Thermo Fisher Scientific	51500056	Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189	STEMCELL Technologies	72147	BMP antagonist
MAFA antibody	Abcam	ab26405	1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium	Life technologies	10372019	Base medium
mTeSR1 Complete Kit	STEMCELL Technologies	85850	stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)	Sigma	A9165	Antioxidant
NaHCO3	Sigma	S6297	Medium supplement
NEUROD1 antibody	R&D Systems	AF2746	1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody	DSHB	F55A12-c	1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody	R&D Systems	AF6297	1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS	Sigma	D8662	With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody	Abcam	ab47267	1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565860	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	563023	1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	562161	1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	554680	1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)	BD Sciences	564563	1:200 in flow cytometry
R428	Cayman Chemicals	21523	AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans	Sigma	R2625	Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x	Sigma	20-188	For hormone extraction
SANT-1	Sigma	S4572	SHH inhibitor
SLC18A1 antibody	Sigma	HPA063797	1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody	Sigma	HPA019472	1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit	STEMCELL Technologies	05120	Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody	Novus	NB120-16659	1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100	Sigma	X100	For permeabilization
Trolox	Sigma Millipore	648471	Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express	Life technologies	12604-021	cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody	R&D Systems	AF3586	1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304	ROCK inhibitor
Zinc sulfate	Sigma	Z0251	Medium supplement