JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

התמיינות תאי גזע לתאי איון מספקת פתרון חלופי לטיפול קונבנציונלי בסוכרת ולמידול מחלות. אנו מתארים פרוטוקול מפורט של תרבית תאי גזע המשלב ערכת התמיינות מסחרית עם שיטה שאושרה בעבר כדי לסייע בייצור איים מפרישי אינסולין שמקורם בתאי גזע בצלחת.

Abstract

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) לתאי בטא מפרישי אינסולין מספקת חומר לחקר תפקוד תאי בטא וטיפול בסוכרת. עם זאת, נותרו אתגרים בהשגת תאי בטא שמקורם בתאי גזע המחקים כראוי תאי בטא אנושיים מקומיים. בהתבסס על מחקרים קודמים, תאי איון שמקורם ב-hPSC נוצרו כדי ליצור פרוטוקול עם תוצאות התמיינות ועקביות משופרות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בערכת אב לבלב בשלבים 1-4, ואחריה פרוטוקול שונה ממאמר שפורסם בעבר בשנת 2014 (להלן "פרוטוקול R") במהלך שלבים 5-7. נהלים מפורטים לשימוש בערכת אב הלבלב ולוחות מיקרווול בקוטר 400 מיקרומטר ליצירת אשכולות אב לבלב, פרוטוקול R להתמיינות אנדוקרינית בפורמט תרחיף סטטי של 96 בארות, ואפיון חוץ גופי והערכה תפקודית של איים שמקורם ב- hPSC, כלולים. הפרוטוקול המלא לוקח שבוע אחד להרחבה ראשונית של hPSC ואחריו ~ 5 שבועות להשגת איים hPSC מייצרי אינסולין. אנשי צוות עם טכניקות בסיסיות של תרבית תאי גזע והכשרה בבדיקות ביולוגיות יכולים לשחזר פרוטוקול זה.

Introduction

תאי בטא בלבלב מפרישים אינסולין המגיב לעלייה ברמות הגלוקוז בדם. חולים ללא ייצור אינסולין מספיק עקב הרס אוטואימוני של תאי בטא בסוכרת מסוג 1 (T1D)1, או עקב תפקוד לקוי של תאי בטא בסוכרת מסוג 2 (T2D)2, מטופלים בדרך כלל במתן אינסולין אקסוגני. למרות טיפול מציל חיים זה, הוא אינו יכול להתאים במדויק לשליטה המעודנת ברמת הגלוקוז בדם כפי שהיא מושגת על ידי הפרשת אינסולין דינמית מתאי בטא בתום לב. ככאלה, חולים סובלים לעתים קרובות מההשלכות של אירועי היפוגליקמיה מסכני חיים וסיבוכים אחרים הנובעים מטיולים היפרגליקמיים כרוניים. השתלת איים גוותיים אנושיים משחזרת בהצלחה שליטה גליקמית הדוקה בחולי סוכרת סוג 1, אך מוגבלת על ידי זמינותם של תורמי איים וקשיים בטיהור איים בריאים להשתלה 3,4. אתגר זה יכול, באופן עקרוני, להיפתר על ידי שימוש ב-hPSCs כחומר מוצא חלופי.

האסטרטגיות הנוכחיות ליצירת איים מפרישי אינסולין מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) במבחנה שואפות לעתים קרובות לחקות את תהליך התפתחות הלבלב העוברי in vivo 5,6. זה דורש ידע של מסלולי איתות אחראי והוספה מתוזמנת של גורמים מסיסים מתאימים כדי לחקות שלבים קריטיים של הלבלב העוברי המתפתח. תוכנית הלבלב מתחילה עם המחויבות לאנדודרם סופי, המסומן על ידי גורמי שעתוק תיבת מזלג A2 (FOXA2) ואזור קביעת מין Y-box 17 (SOX17)7. התמיינות רצופה של אנדודרם סופי כרוכה בהיווצרות של צינור מעיים פרימיטיבי, היוצר תבנית למעי קדמי אחורי המבטא את ההומיאובוקס 1 של הלבלב והתריסריון 1 (PDX1)7,8,9, והתרחבות אפיתל לאבות לבלב המבטאים יחד PDX1 ו- NK6 הומיאובוקס 1 (NKX6.1)10,11.

מחויבות נוספת לתאי איון אנדוקריני מלווה בביטוי ארעי של רגולטור ראשי פרו-אנדוקריני נוירוגנין-3 (NGN3)12 ואינדוקציה יציבה של גורמי שעתוק מרכזיים התמיינות עצבית 1 (NEUROD1) ו- NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. התאים העיקריים המבטאים הורמונים, כגון תאי בטא מייצרי אינסולין, תאי אלפא מייצרי גלוקגון, תאי דלתא מייצרי סומטוסטטין ותאי PPY מייצרי פוליפפטיד בלבלב, מתוכנתים לאחר מכן. עם הידע הזה, כמו גם תגליות ממחקרי סינון תרופות נרחבים ובעלי תפוקה גבוהה, ההתקדמות האחרונה אפשרה יצירת תאי hPSC עם תאים הדומים לתאי בטא המסוגלים להפריש אינסולין 14,15,16,17,18,19.

פרוטוקולים הדרגתיים דווחו לייצור תאי בטא מגיבים לגלוקוז 6,14,18,19. הפרוטוקול הנוכחי, המבוסס על מחקרים אלה, כולל שימוש בערכת אב לבלב ליצירת תאי אב לבלב PDX1+/NKX6.1+ בתרבית מישורית, ולאחר מכן צבירת לוחות מיקרווול לצבירים בגודל אחיד והתמיינות נוספת לעבר איי hPSC מפרישי אינסולין עם פרוטוקול R בתרבית תרחיף תלת-ממדית סטטית. ניתוחי בקרת איכות, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוסטיין והערכה תפקודית, מבוצעים לאפיון קפדני של התאים המתמיינים. מאמר זה מספק תיאור מפורט של כל שלב של הבידול המכוון ומתאר את גישות האפיון במבחנה.

Protocol

פרוטוקול זה מבוסס על עבודה עם קווי hPSC, כולל H1, HUES4 PDXeG ו-Mel1 INSGFP/W, בתנאים נטולי הזנה. הליך שלב אחר שלב מפורט בסעיף זה, עם נתונים תומכים מההבחנה של Mel1 INSGFP/W בסעיף התוצאות המייצגות. אנו ממליצים כי יש צורך במיטוב נוסף בעת עבודה עם קווי hPSC אחרים שאינם מצוינים כאן. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל הריאגנטים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת מדיה בידול ופתרונות

הערה: ראה טבלה 1 עבור כל הפתרונות שיש להכין וטבלה 2 עבור מדיית הבידול.

  1. הכינו את כל המדיה והריאגנטים לתרבית תאים בארון בטיחות ביולוגית סטרילי. יש לחמם לזמן קצר תמיסות הקשורות לתרבית תאים ומדיה בסיסית ל-37°C באמבטיה לפני השימוש.
    הערה: כמתואר להלן, הכינו מדיית בידול טרייה מדי יום על ידי הוספת תוספים והשתמשו בהם באותו היום. לחילופין, ערכת האב ללבלב מספקת את האפשרות להכין מראש נפח גדול יותר שניתן להשתמש בו במשך מספר ימים בהתאם לפרוטוקול היצרן. שתי השיטות להכנת מדיה מוכיחות את עצמן כעובדות היטב. שימו לב שלא מומלץ להשאיר את המדיה לזמן ממושך באמבט המים. בעת הכנת מדיה טרייה בכל יום, מומלץ aliquot תוספי כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.

2. התמיינות של hPSCs לתאי אב של הלבלב

  1. יש לשמור על hPSCs בלתי מובחנים על כלים מצופים מטריג'ל במדיום mTeSR1 מלא ולבצע שינויים בינוניים מדי יום. במהלך תרבית תחזוקה, עוברים hPSCs כל 3-4 ימים כאשר התאים מגיעים למפגש ~70% באמצעות מגיב הדיסוציאציה התאית בהתאם לפרוטוקול היצרן. כדי ליזום התמיינות, נתקו את התאים לתאים בודדים וזרעו אותם על צלחות מטופלות בתרבית רקמות של 6 או 12 בארות (עם נפחי מדיה של 2 מ"ל או 1 מ"ל לבאר, בהתאמה).
    הערה: ראה טבלה 1 להוראות הקשורות לאחסון התווך הבסיסי של אנדודרם והאליציטוטים שלו.
  2. בארות תרבית Precoat עם Matrigel מוסמך hESC (מדולל ב-DMEM/F12 קר כקרח לפי המלצת פרוטוקול היצרן) ומניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 למשך 30 דקות.
  3. מעבירים את הצלחת המצופה במטריג'ל לטמפרטורת החדר (יש להשתמש תוך 3 שעות).
  4. שאפו את המדיום המושקע מתרבית hPSC ושטפו פעם אחת עם DPBS. נתקו תרבית hPSC לתאים בודדים עם אנזים דיסוציאציה של תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 3-5 דקות. שטפו את התאים על ידי הוספת מדיום DMEM/F12 חם, העבירו לצינור חרוטי של 15 מ"ל או 50 מ"ל, והסתובבו ב-300 × גרם במשך 5 דקות.
  5. השהה מחדש את גלולת התא עם תא גזע שלם בינוני בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 ובצע ספירת תאים חיים (טריפאן כחול שלילי) עם המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. לשאוף מטריגל מדולל ומיד לזרוע תאים חיים בצפיפות של 1.60-1.80 × 10 5/cm 2 על בארות מצופות Matrigel ולדגור ב 37 ° C לח,5% CO2 אינקובטור במשך 24 שעות. המשך לשלב 1.
    הערה: התוצאה תהיה ~95% התחלת מפגש ליזום בידול. על פי פרוטוקול היצרן, מומלצת צפיפות זריעה של 2.6 × 105/cm2 . מומלץ לבדוק צפיפויות זריעה שונות כדי לקבוע את הערך האופטימלי לקו תאים ולבדוק את כדאיות התא. אם הכדאיות היא מתחת 80%, לא להמשיך עם בידול. כדאיות תאים נמוכה יכולה להיות תוצאה של עיכול יתר או טריטורציה יתר במהלך הקציר או השארת תאים לזמן ממושך בתווך DMEM/F12 לפני הזריעה.
  6. בשלב 1 יום 1, יש לחמם לזמן קצר את האנדודרם הבסיסי בינוני ל-37°C באמבטיה ולהפשיר תוסף MR ו-CJ. הכן את מדיום שלב 1A על ידי הוספת תוספת MR ו- CJ למדיום הבסיסי של האנדודרם . מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  7. לשאוף את המדיום בילה מבארות, להוסיף שלב 1A מדיום לדגור ב 37 ° C לח, 5% CO2 אינקובטור במשך 24 שעות.
    הערה: שלבי הכביסה אינם נחוצים. הסר תאים שאינם מחוברים מהתרבית על ידי ניעור עדין של צלחת התרבית לפני חילופי המדיום. הימנעו מהפרעה לשכבה החד-שכבתית על ידי אי נגיעה בקצה הפיפטה בתחתית הבאר במהלך הסרה בינונית ובאמצעות תוספת בינונית עדינה.
  8. בשלב 1 יום 2, לחמם בקצרה את המדיום הבסיסי של אנדודרם באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר תוסף CJ. הכן את מדיום שלב 1B על ידי הוספת תוספת CJ למדיום הבסיסי של האנדודרם . מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  9. שאפו את המדיום המשומש מהבארות, הוסיפו מדיום שלב 1B, ודגרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
  10. בשלב 1 יום 3, חזור על שלבים 2.8-2.9. המשך לשלב 2.
  11. בשלב 2 יום 1, לבלב חם שלב 2-4 מדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס והפשירו את תוספת 2A ו-2B. הכינו את שלב 2A בינוני על ידי הוספת תוספת 2A ו-2B למדיום הבסיסי שלב 2-4 של הלבלב. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  12. לשאוף את המדיום המשומש מבארות, להוסיף מדיום שלב 2A, ולדגור בחממה לח 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 24 שעות.
  13. בשלב 2 יום 2, לבלב חם שלב 2-4 מדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס והפשיר תוספת 2B. הכינו את שלב 2B בינוני על ידי הוספת תוספת 2B ללבלב שלב 2-4 מדיום בסיסי. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  14. לשאוף את המדיום המשומש מבארות, להוסיף מדיום שלב 2B, ולדגור בחממה לח 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 24 שעות.
  15. בשלב 2 יום 3, חזור על שלבים 2.13-2.14. המשך לשלב 3.
  16. בשלב 3 יום 1, לבלב חם שלב 2-4 מדיום בסיסי באמבטיה 37 מעלות צלזיוס והפשרה תוספת 3. הכינו את שלב 3 בינוני על ידי הוספת תוספת 3 למדיום הבסיסי שלב 2-4 של הלבלב. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  17. שאפו את המדיום המשומש מבארות, הוסיפו מדיום שלב 3, ודגרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
  18. בשלב 3 יום 2 ויום 3, חזור על שלבים 2.16-2.17. המשך לשלב 4.
  19. בשלב 4 יום 1, לבלב חם שלב 2-4 מדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס והפשרה תוספת 4. הכינו את שלב 4 בינוני על ידי הוספת תוספת 4 למדיום הבסיסי שלב 2-4 של הלבלב. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  20. שאפו את המדיום המשומש מבארות, הוסיפו מדיום שלב 4, ודגרו באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
  21. בשלב 4 יום 2 עד יום 4, חזור על שלבים 2.19-2.20. המשך לשלבי הצבירה.

3. צבירה לצברי אבות לבלב באמצעות לוחות מיקרווול בקוטר 400 מיקרומטר

  1. בשלב 4 יום 5, טפלו במיקרו-בארות (למשל, פורמט צלחת 24 בארות) עם 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לכל באר.
  2. הכינו צלחת איזון וצנטריפוגה את צלחת המיקרווול במשקל של 1,300 × גרם למשך 5 דקות.
    הערה: בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שלא נותרו בועות במיקרו-בארות. צנטריפוגה שוב למשך 5 דקות נוספות אם הבועות נשארות לכודות במיקרו-בארות כלשהן.
  3. יש לשאוף את תמיסת השטיפה נגד היצמדות מהבארות ולשטוף פעם אחת ב-1 מ"ל DPBS. שאפו את ה-DPBS מהבארות והוסיפו 1 מ"ל של מדיום צבירה לכל באר.
  4. הסר את המדיום בילה מן תרביות אב הלבלב ולשטוף פעם אחת עם DPBS. נתק את התרביות לתאים בודדים עם מגיב דיסוציאציה ב 37 ° C למשך 10-12 דקות. שטפו את התאים עם DMEM/F12 חם, העבירו אותם לצינור וסובבו ב-300 × גרם במשך 5 דקות.
  5. השהה מחדש את גלולת התא בתווך הצבירה ובצע ספירת תאים חיים. זרעו 2.4-3.6 מיליון תאים בסך הכל לבאר (כלומר, 2,000-3,000 תאים למיקרו-באר) והוסיפו מדיום צבירה לכל באר כדי להגיע לנפח סופי של 2 מ"ל לבאר.
  6. טפטו בעדינות את התאים מעלה ומטה מספר פעמים עם קצה פיפטה P1000 כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים ברחבי הבאר. אין להכניס בועות לתוך microwells. צנטריפוגה את צלחת microwell ב 300 × גרם במשך 5 דקות כדי ללכוד את התאים microwells. דוגרים על צלחת המיקרווול באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לצבירה של 24 שעות וממשיכים להתמיינות שלבים 5-7.
    הערה: היזהר לא להפריע לצלחת בזמן הצבירה. ייתכן שיהיה צורך בעד 48 שעות של זמן דגירה להיווצרות אגרגטים אופטימלית.

4. הבחנה של אשכולות אבות לבלב שמקורם בערכה לאיי hPSC

  1. בשלב 5 יום 1, יש לחמם את שלב 5-7 במדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר תוספים (ראה טבלה 1 וטבלה 2). הכינו את מדיום שלב 5 על ידי הוספת תוספים (לריכוזי העבודה הסופיים) למדיום הבסיסי שלב 5-7. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  2. לאחר היווצרות הצבירה, טפטו בעדינות את הצברים מעלה ומטה מספר פעמים עם קצה פיפטה P1000 כדי לצוף תאים שאינם מצטברים. אפשרו לצברים לשקוע על ידי כוח הכבידה (חכו ~ 1 דקה). הסר בעדינות את התווך המשומש (המכיל את התאים הצפים שאינם מצטברים) מהבאר ככל האפשר תוך הימנעות משאיפה.
  3. יש לפזר מדיום שלב 5 טרי במרץ על פני השטח של צלחת המיקרווול כדי לעקור אגרגטים מהמיקרו-בארות. העברת אגרגטים לחיבור נמוך במיוחד (ULA) 6-בארות. יש לשטוף פעם אחת בתווך שלב 5 כדי לאחזר לחלוטין אגרגטים מהמיקרו-בארות.
  4. לאסוף את כל האגרגטים בבארות ULA 6, להשהות מחדש אגרגטים בשלב 5 בינוני, ולהתאים את הצפיפות ל -20 אשכולות לכל 100 μL (למשל, ~ 1,200 אשכולות צפויים להיות משוחזרים מכל באר. השהיה מחדש של 1,200 אשכולות ב-6 מ"ל של מדיום שלב 5). השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לפזר 50 μL של מדיום שלב 5 לתוך כל באר של צלחת תחתית שטוחה 96 באר ULA. מלא את בארות הפינה והקצה עם 200 μL של DPBS.
    הערה: הימנע משימוש בבארות הקצה לגידול אגרגטים מכיוון שהם נוטים להתאדות יותר; אחרת, השתמשו בצלחת בת 96 בארות שנועדה למזער את האידוי לאורך הקצוות (למשל, לוחות של 96 בארות עם תעלות מובנות) או הניחו את צלחת התרבית באינקובטור תרבית תאי מיקרו אקלים עם לחות גבוהה.
  5. הוסף 100 μL של מתלה אשכול לתוך כל באר של צלחת 96 באר תחתית שטוחה ULA, וכתוצאה מכך סך של 150 μL מדיום תרבית המכיל ממוצע של 20 אשכולות לכל באר.
    הערה: ערבבו בעדינות את מתלה המקבץ בכל פעם לפני הניפוק ל-96 בארות.
  6. הניחו את לוחות התרבית על משטח ישר באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 למשך 24 שעות.
  7. בשלב 5 יום 2, הכינו את שלב 5 מדיום לאחר שלב 4.1.
  8. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר ~ 90 μL של המדיום בילה מכל באר, ורענן עם 100 μL של מדיום שלב 5.
  9. בשלב 5 יום 3, חזור על שלבים 4.7-4.8. המשך לשלב 6.
  10. בשלב 6 יום 1, יש לחמם את שלב 5-7 במדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר תוספים (ראו טבלה 1 וטבלה 2). הכינו את מדיום שלב 6 על ידי הוספת תוספים (לריכוזי העבודה הסופיים) למדיום הבסיסי שלב 5-7. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  11. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר ~ 90 μL של המדיום בילה ורענן עם 100 μL של שלב 6 בינוני לכל באר.
  12. בשלב 6 יום 2 עד יום 8, חזור על שלבים 4.10-4.11. המשך לשלב 7.
  13. בשלב 7 יום 1, יש לחמם את שלב 5-7 במדיום בסיסי באמבטיה של 37 מעלות צלזיוס ולהפשיר תוספים (ראו טבלה 1 וטבלה 2). הכינו את המדיום שלב 7 על ידי הוספת תוספים (לריכוזי העבודה הסופיים) למדיום הבסיסי שלב 5-7. מערבבים היטב ומשתמשים מיד.
  14. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר ~ 90 μL של המדיום בילה ורענן עם 100 μL של שלב 7 בינוני לכל באר.
  15. בשלב 7 יום 2 עד יום 12, חזור על שלבים 4.13-4.14. המשך לאפיון חוץ גופי .

5. ניתוח ציטומטרי זרימה

  1. הסר את חומרי התרבות ושטוף פעם אחת עם DPBS. נתקו את התרביות (תאי אב מישוריים או צבירי התמיינות לתאים בודדים עם מגיב דיסוציאציה על ידי דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-12 דקות. יש לשטוף עם חיץ FACS ולסובב ב-300 × גרם במשך 5 דקות.
  2. השהה מחדש את גלולת התא במאגר FACS ובצע ספירת תאים. סובב תאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות. יש להשהות תאים בודדים ב-500 μL של חיץ Fix/Perm למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: יש להביא את מאגר Fix/Perm לטמפרטורת החדר לפני השימוש. מאגר Fix/Perm מכיל paraformaldehyde (PFA). יש לטפל בזהירות ב-PFA במכסה אדים ולסלק בהתאם להנחיות המוסדיות.
  3. יש לסחוט ב-500 × גרם למשך 3 דקות, לשטוף פעמיים עם 500 μL של 1x Perm/Wash buffer, ולהשהות מחדש ב-300 μL של 1x Perm/Wash buffer. העבר 100 μL של תרחיף חד-תאי (כל אחד מכיל 2.5-3 × 105 תאים) לשלוש מבחנות מיקרופוגה לבקרה לא מוכתמת, בקרת איזוטיפ וצביעת נוגדנים (ראה טבלת חומרים למידע על נוגדנים ודילול דגימה). דוגרים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ומכסים בנייר כסף.
  4. מסתובבים ב 500 × גרם במשך 3 דקות. יש לכבס פעמיים עם 500 μL של 1x Perm/Wash buffer. השהה מחדש את הדגימות במאגר FACS של 100 μL ונתח את התאים המוכתמים (ראה טבלת חומרים לצביעה תוך-תאית של סמנים בשלבים ספציפיים) באמצעות ציטומטר זרימה ותוכנה (לדוגמה, FlowJo).
    הערה: אם הדגימות אינן נבדקות מיד, אחסן אותן בטמפרטורה של 4°C המוגנות מפני אור. עבור אסטרטגיית gating, נתוני הזרימה מגודרים תחילה על ידי תכונות פיזור (FSC-A ו- SSC-A) כדי להסיר פסולת תאית קטנה, ולאחר מכן תכונות רוחב FSC-A ו- FSC כדי לזהות סינגלטים. גטינג חיובי ושלילי נקבע על ידי בקרות תאי גזע ו / או בקרות איזוטיפ לא מוכתמות.

6. הר שלם immunostaining

  1. לאסוף אשכולות בצינור microfuge. ליישב אשכולות על ידי כוח הכבידה. לשאוף את המדיום בילה ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS (עם סידן ומגנזיום). תקנו את האשכולות עם 1 מ"ל של 4% PFA ב-4°C למשך הלילה.
  2. יש לשטוף פעם אחת עם PBST ולהחדיר 20-30 אשכולות עם 500 μL של 0.3% TritonX-100 בצינור מיקרופוגה בטמפרטורת הסביבה למשך 6 שעות לפחות על שייקר הטיה.
    הערה: זמן חלחול ארוך יותר (עד 24 שעות) נדרש עבור אשכולות גדולים.
  3. יש לדגור על הצבירים ב-100 מיקרוליטר של חיץ חוסם בטמפרטורת הסביבה למשך שעה אחת על שייקר הטיה. הסר את המאגר החוסם ודגור על הצבירים עם 100 μL של נוגדנים ראשוניים המדוללים במאגר דילול נוגדנים בטמפרטורת הסביבה למשך הלילה על שייקר הטיה.
    הערה: אם הרקע חזק במהלך ההדמיה, יש לדגור עם נוגדנים ראשוניים בטמפרטורה של 4°C.
  4. יש לשטוף ביסודיות 3 x 30 דקות עם 500 מיקרוליטר PBST על שייקר הטיה (זווית ההטיה נקבעה על 8, מהירות מוגדרת על 20).
  5. יש לדגור על הצבירים עם 100 μL של נוגדנים משניים במאגר דילול נוגדנים בטמפרטורת הסביבה למשך הלילה על שייקר הטיה. מכסים את הצינורות בנייר כסף.
    הערה: אם הרקע חזק במהלך ההדמיה, יש לדגור עם נוגדנים משניים בטמפרטורה של 4°C.
  6. יש לשטוף פעם אחת עם 500 מיקרוליטר PBST. הוסף 100 μL של תמיסת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBST) והכתים בטמפרטורת הסביבה למשך 10-15 דקות. מכסים בנייר כסף ומגנים מפני אור.
  7. יש לשטוף ביסודיות 3 x 30 דקות עם 500 מיקרוליטר PBST על שייקר הטיה. כסו את הצינורות בנייר כסף במהלך שלב הכביסה.
  8. יש לחבר את האשכולות לשקופיות של תאי הדמיה (ראה טבלת חומרים) מצופות מראש בדבק רקמות בהתאם לפרוטוקול היצרן ולפרוטוקולים20,21 שפורסמו.
  9. הרכבה עם מדיום ניקוי רקמות (80% גליצרול בתמיסת PBS) וכיסוי בכיסויי זכוכית. יש להגן מפני אור עד להדמיה קונפוקלית.
    הערה: אם הדגימות אינן מצולמות מיד, אחסן אותן בטמפרטורה של 4°C המוגנות מפני אור.

7. בדיקת GSIS סטטית

  1. חיץ ביקרבונט רינגר של Kreb (3.3G KRB) חם עם גלוקוז נמוך, מאגר KRB עם גלוקוז גבוה (16.7G) וחיץ KRB KCl של 30 mM באמבט של 37°C.
  2. בחרו ביד אשכולות תואמי גודל ושטפו עם 2 מ"ל של חיץ KRB חם של 3.3 גרם. מעבירים את האשכולות לצלחת 6 בארות שאינה מטופלת בתרבית רקמה ומאוזנים בחיץ חם של 3.3 גרם KRB למשך שעה אחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .
  3. לאחר שיווי משקל, מלא את תא הבדיקה (ראה טבלת חומרים) ב- 100 μL של חיץ KRB חם של 3.3G. בחרו ידנית חמישה אשכולות והעבירו אותם למרכז תא הבדיקה. יש לדגור במשך 30 דקות באינקובטור לח של 37°C, 5% CO2 .
    הערה: השתמש בקצוות פיפטה של 10 μL להעברת אשכולות בנפח בינוני מינימלי.
  4. אספו בזהירות ~100 μL של הסופרנאטנט ואחסנו אותו בטמפרטורה של -30°C עד למדידת הפרשת האינסולין הבסיסי (ראו שלב 7.9). אין לייבש או לאבד אשכולות בשלב זה. הוסף מיד 100 μL של חיץ KRB חם 16.7G לתוך תא הבדיקה ודגור על אותם אשכולות במשך 30 דקות באינקובטור לח 37 ° C, 5% CO2 .
  5. אספו בזהירות ~100 μL של הסופרנאטנט ואחסנו אותו בטמפרטורה של -30°C עד למדידת הפרשת האינסולין המגורה על ידי גלוקוז (ראו שלב 7.9). הוסף מיד 100 μL של חיץ KCl KRB חם 30 mM לתוך תא הבדיקה ודגר על אותם אשכולות במשך 30 דקות באינקובטור לח של 37 ° C, 5% CO2 .
  6. יש לאסוף בזהירות ~100 μL של הסופרנאטנט ולאחסן בטמפרטורה של -30°C עד למדידת הפרשת האינסולין המגורה על ידי KCl (ראה שלב 7.9). הוסף מיד 100 μL של חיץ RIPA lysis לתוך תא הבדיקה ולהעביר את חיץ הליזיס המכיל את כל חמשת הצבירים לתוך צינור microfuge.
  7. אופציונלי) שברו את האשכולות באופן ידני על ידי טריטורציה נמרצת עם קצה פיפטה P200. מערבולת במשך 30 שניות ודגרה על קרח במשך 30 דקות ואחריה עוד 30 שניות של מערבולת.
    הערה: להבטיח ליזה מלאה על ידי מערבולות וזמן מספיק של דגירה על קרח.
  8. יש לסחור במהירות של 8,000 × גרם למשך דקה. יש לאסוף את הסופרנאטנט ולאחסן בטמפרטורה של -30°C עד למדידת תכולת האינסולין הכוללת (ראה שלב 7.9).
  9. למדוד אינסולין אנושי בדגימות supernatant באמצעות ערכת אינסולין אנושי ELISA על פי פרוטוקול היצרן ופרוטוקוליםשפורסמו 20,22.
    הערה: יש להימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות של דגימות סופרנטנט. אין לבדוק דגימות עם יותר משלושה מחזורי הקפאה והפשרה.

תוצאות

פיתחנו אסטרטגיה היברידית להתמיין תאי גזע לאיונים hPSC מפרישי אינסולין בשבעה שלבים, אשר משתמשת בערכת אב לבלב עבור ארבעת השלבים הראשונים בתרבית מישורית, ולאחר מכן פרוטוקול שונה הבנוי על שיטה6 שדווחה בעבר בתרבית תרחיף סטטי עבור שלושת השלבים האחרונים (איור 1). באמצע...

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול היברידי בן שבעה שלבים המאפשר יצירת איים hPSC המסוגלים להפריש אינסולין על אתגר גלוקוז תוך 40 יום מהתרבית במבחנה. בין השלבים המרובים הללו, אינדוקציה יעילה של אנדודרם סופי נחשבת כנקודת התחלה חשובה לתוצאות הבידול הסופיות18,27,28

Disclosures

טימותי ג 'יי קיפר היה עובד של ViaCyte במהלך הכנת כתב היד הזה. המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים בהכרת תודה על התמיכה של STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות. ג'יה ג'או ושנגהווי ליאנג הם מקבלי פרס מייקל סמית 'מחקר בריאות BC Trainee Award. מיטשל ג'.ס. בראם זכה במלגת Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima הוא חתן מלגת אלכסנדר גרהם בל קנדה בוגר ואת CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. אנו מודים מקרב לב לד"ר אדואר ג. סטנלי מ-MCRI ומאוניברסיטת מונאש על שיתוף קו Mel1 INS GFP/W ועל ליבת Islet Core של מכון אלברטה לסוכרת על בידוד והפצה של איים אנושיים. אנו מודים גם על התמיכה ממתקני הדמיה וציטומטריית זרימה של המכון למדעי החיים באוניברסיטת קולומביה הבריטית. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397Thyroid hormone
4% PFA solutionSanta Cruz Biotechnologysc-281692Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottomCorning Costar (VWR)CLS3474Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 platesSTEMCELL Technologies34415400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 platesSTEMCELL Technologies34815800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)R&D SystemsIC2400G1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR&D SystemsIC108G1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR&D SystemsIC0041G1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010Microwell Rinsing Solution
Assay chamberCellvisD35-10-1-NFor static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100For immunostaining procedure
CK19 antibodyDAKOM08881:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucoseSigmaG8769Medium supplement
DAPISigmaD9542For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in whole mount immunofluorescence
DPBSSigmaD8537Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, humanAlpco80-INSHU-E01.1For human insulin measurement
Fatty acid-free BSAProliant68700Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution KitBD Sciences554714Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies7174For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibodySigmaG26541:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibodyThermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-glutamine supplement
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4For tissue clearing and mounting
GSi XXSigma Millipore565789Notch inhibitor
HeparinSigmaH3149Medium supplement
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP antagonist
MAFA antibodyAbcamab264051:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualifiedThermo Fisher Scientific08-774-552Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 mediumLife technologies10372019Base medium
mTeSR1 Complete KitSTEMCELL Technologies85850stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3SigmaS6297Medium supplement
NEUROD1 antibodyR&D SystemsAF27461:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibodyDSHBF55A12-c1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibodyR&D SystemsAF62971:200 in whole mount immunofluorescence
PBSSigmaD8662With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibodyAbcamab472671:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)BD Sciences5630231:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BD Sciences5621611:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5546801:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)BD Sciences5645631:200 in flow cytometry
R428 Cayman Chemicals21523AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-transSigmaR2625Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10xSigma20-188For hormone extraction
SANT-1SigmaS4572SHH inhibitor
SLC18A1 antibodySigmaHPA0637971:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibodySigmaHPA0194721:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor KitSTEMCELL Technologies05120Basal media and supplements included
Synaptophysin antibodyNovusNB120-166591:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100SigmaX100For permeabilization
Trolox Sigma Millipore648471Vitamin E analog
TrypLE Enzyme ExpressLife technologies12604-021cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibodyR&D SystemsAF35861:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK inhibitor
Zinc sulfateSigmaZ0251Medium supplement

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196R96HPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved