Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines en amas d’îlots pancréatiques producteurs d’insuline

Résumé

La différenciation des cellules souches en cellules d’îlots pancréatiques offre une solution alternative au traitement conventionnel du diabète et à la modélisation de la maladie. Nous décrivons un protocole détaillé de culture de cellules souches qui combine un kit de différenciation commercial avec une méthode préalablement validée pour aider à produire des îlots dérivés de cellules souches sécrétrices d’insuline dans une boîte.

Résumé

La différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) en cellules bêta sécrétrices d’insuline fournit du matériel pour étudier la fonction des cellules bêta et le traitement du diabète. Cependant, il reste des défis à relever pour obtenir des cellules bêta dérivées de cellules souches qui imitent adéquatement les cellules bêta humaines natives. S’appuyant sur des études antérieures, des cellules d’îlots pancréatiques dérivées de CSPh ont été générées pour créer un protocole avec des résultats de différenciation et une cohérence améliorés. Le protocole décrit ici utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pendant les stades 1 à 4, suivi d’un protocole modifié à partir d’un article précédemment publié en 2014 (appelé « protocole R » ci-après) au cours des stades 5 à 7. Des procédures détaillées pour l’utilisation du kit de progéniteurs pancréatiques et de plaques de micropuits de 400 μm de diamètre pour générer des grappes de progéniteurs pancréatiques, le protocole R pour la différenciation endocrinienne dans un format de suspension statique à 96 puits, ainsi que la caractérisation in vitro et l’évaluation fonctionnelle des îlots dérivés des CSPh, sont inclus. Le protocole complet prend 1 semaine pour l’expansion initiale des CSPh, suivie de ~5 semaines pour obtenir des îlots de CSPh productrices d’insuline. Le personnel possédant des techniques de culture de cellules souches de base et une formation en essais biologiques peut reproduire ce protocole.

Introduction

Les cellules bêta pancréatiques sécrètent de l’insuline en réponse à l’augmentation de la glycémie. Les patients qui ne produisent pas suffisamment d’insuline en raison de la destruction auto-immune des cellules bêta dans le diabète de type 1 (DT1)¹, ou en raison d’un dysfonctionnement des cellules bêta dans le diabète de type 2 (DT2)², sont généralement traités par l’administration d’insuline exogène. Malgré cette thérapie qui sauve des vies, elle ne peut pas égaler avec précision le contrôle exquis de la glycémie obtenu par la sécrétion dynamique d’insuline à partir de cellules bêta authentiques. En tant que tels, les patients souffrent souvent des conséquences d’épisodes hypoglycémiques potentiellement mortels et d’autres complications résultant d’excursions hyperglycémiques chroniques. La transplantation d’îlots cadavériques humains rétablit avec succès un contrôle glycémique strict chez les patients atteints de DT1, mais elle est limitée par la disponibilité de donneurs d’îlots et les difficultés à purifier les îlots sains pour la transplantation ^3,4. Ce défi peut, en principe, être résolu en utilisant les hPSC comme matériau de départ alternatif.

Les stratégies actuelles de génération d’îlots sécréteurs d’insuline à partir de CSPh in vitro visent souvent à imiter le processus de développement du pancréas embryonnaire in vivo ^5,6. Cela nécessite de connaître les voies de signalisation responsables et d’ajouter au moment opportun les facteurs solubles correspondants pour imiter les étapes critiques du développement du pancréas embryonnaire. Le programme pancréatique commence par l’engagement dans l’endoderme définitif, qui est marqué par les facteurs de transcription forkhead box A2 (FOXA2) et la région déterminant le sexe Y-box 17 (SOX17)⁷. La différenciation successive de l’endoderme définitif implique la formation d’un tube intestinal primitif, formant un intestin antérieur postérieur qui exprime l’homéobox pancréatique et duodénal 1 (PDX1)^7,8,9, et l’expansion épithéliale en progéniteurs pancréatiques qui co-expriment PDX1 et NK6 homéobox 1 (NKX6.1)^10,11.

Un engagement supplémentaire dans les cellules des îlots endocriniens s’accompagne de l’expression transitoire de la neurogénine-3 (NGN3)12 et de l’induction stable des facteurs de transcription clés de la différenciation neuronale 1 (NEUROD1) et de l’homéobox 2 NK2 (NKX2.2)¹³. Les principales cellules exprimant des hormones, telles que les cellules bêta productrices d’insuline, les cellules alpha productrices de glucagon, les cellules delta productrices de somatostatine et les cellules PPY productrices de polypeptides pancréatiques, sont ensuite programmées. Grâce à ces connaissances, ainsi qu’aux découvertes issues d’études approfondies de criblage de médicaments à haut débit, les progrès récents ont permis de générer des îlots hPSC avec des cellules ressemblant à des cellules bêta capables de sécréter de l’insuline 14,15,16,17,18,19.

Des protocoles par étapes ont été rapportés pour générer des cellules bêta sensibles au glucose 6,14,18,19. Basé sur ces études, le présent protocole implique l’utilisation d’un kit de progéniteurs pancréatiques pour générer des cellules progénitrices pancréatiques PDX1+/NKX6.1⁺ dans une culture planaire, suivie d’une agrégation de plaques de micropuits en grappes de taille uniforme et d’une différenciation supplémentaire vers des îlots hPSC sécrétrices d’insuline avec le protocole R dans une culture statique en suspension 3D. Des analyses de contrôle de la qualité, y compris la cytométrie en flux, l’immunomarquage et l’évaluation fonctionnelle, sont effectuées pour une caractérisation rigoureuse des cellules en voie de différenciation. Cet article fournit une description détaillée de chaque étape de la différenciation dirigée et décrit les approches de caractérisation in vitro.

Protocole

Ce protocole est basé sur le travail avec des lignées hPSC, y compris H1, HUES4 PDXeG et Mel1 INS^GFP/W, dans des conditions sans feeder. Une procédure étape par étape est détaillée dans cette section, avec des données à l’appui de la différenciation de Mel1 INS^GFP/W dans la section des résultats représentatifs. Nous recommandons qu’une optimisation supplémentaire soit nécessaire lorsque vous travaillez avec d’autres lignes hPSC qui ne sont pas indiquées ici. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les réactifs et solutions utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des milieux et solutions de différenciation

REMARQUE : Voir le tableau 1 pour toutes les solutions à préparer et le tableau 2 pour les milieux de différenciation.

1. Préparez tous les milieux et réactifs pour la culture cellulaire dans une enceinte de sécurité biologique stérile. Réchauffer brièvement les solutions liées à la culture cellulaire et les milieux basaux à 37 °C dans un bain avant utilisation.
   REMARQUE : Comme décrit ci-dessous, préparez quotidiennement de nouveaux supports de différenciation en ajoutant des suppléments et utilisez-les le même jour. Alternativement, le kit de progéniteur pancréatique offre la possibilité de préparer à l’avance un volume plus important qui peut être utilisé sur plusieurs jours en suivant le protocole du fabricant. Les deux méthodes de préparation des milieux s’avèrent bien fonctionner. Notez qu’il n’est pas recommandé de laisser le support pendant une période prolongée dans le bain-marie. Lors de la préparation quotidienne de substrats frais, il est recommandé d’aliquoter des suppléments afin d’éviter les cycles répétés de gel-dégel.

2. Différenciation des CSPh en cellules progénitrices pancréatiques

1. Maintenir des CSPh indifférenciées sur les vaisseaux enrobés de Matrigel dans le milieu complet mTeSR1 et effectuer des changements de milieu quotidiennement. Pendant la culture d’entretien, les CSPh passent tous les 3 à 4 jours lorsque les cellules atteignent ~70 % de confluence en utilisant le réactif de dissociation cellulaire en suivant le protocole du fabricant. Pour amorcer la différenciation, dissociez les cellules en cellules individuelles et ensemencez-les sur des plaques traitées par culture tissulaire à 6 ou 12 puits (avec des volumes de milieu de 2 mL ou 1 mL par puits, respectivement).
   REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les instructions relatives à l’entreposage du milieu basal de l’endoderme et de ses aliquotes.
2. Pré-enrober les puits de culture avec du Matrigel qualifié hESC (dilué dans du DMEM/F12 glacé comme recommandé par le protocole du fabricant) et placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 30 min.
3. Déplacez la plaque enduite de Matrigel à température ambiante (à utiliser dans les 3 h).
4. Aspirez le milieu usé de la culture hPSC et rincez une fois avec du DPBS. Dissocier la culture de hPSC en cellules individuelles avec une enzyme de dissociation cellulaire à 37 °C pendant 3 à 5 minutes. Rincez les cellules en ajoutant du milieu DMEM/F12 chaud, transférez-les dans un tube conique de 15 ml ou 50 ml et essorez-les à 300 × g pendant 5 minutes.
5. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un milieu complet de cellules souches plus 10 μM Y-27632 et effectuer un comptage de cellules vivantes (bleu trypan négatif) à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. Aspirer le Matrigel dilué et semer immédiatement les cellules vivantes à une densité de 1,60-1,80 × 10⁵/cm 2 sur des puits recouverts de Matrigel et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO² pendant 24 h. Passez à l’étape 1.
   REMARQUE : Cela se traduira par une confluence de départ de ~95% pour initier la différenciation. Selon le protocole du fabricant, une densité de semis de 2,6 × 10⁵/cm² est recommandée. Il est recommandé de tester différentes densités de semis pour déterminer la valeur optimale d’une lignée cellulaire et pour vérifier la viabilité des cellules. Si la viabilité est inférieure à 80 %, ne procédez pas à la différenciation. Une faible viabilité cellulaire peut être le résultat d’une surdigestion ou d’une surtrituration pendant la récolte ou du fait de laisser les cellules pendant une période prolongée dans un milieu DMEM/F12 avant le semis.
6. Au stade 1 jour 1, réchauffer brièvement le milieu basal de l’endoderme à 37 °C dans un bain et décongeler le supplément MR et CJ. Préparez le milieu de stade 1A en ajoutant le supplément MR et CJ au milieu basal de l’endoderme. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
7. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 1A et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   REMARQUE : Les étapes de lavage ne sont pas nécessaires. Retirez toutes les cellules non attachées de la culture en secouant doucement la plaque de culture avant l’échange du milieu. Évitez de perturber la monocouche en ne touchant pas l’embout de la pipette au fond du puits lors du retrait du fluide et en ajoutant doucement du milieu.
8. À l’étape 1 jour 2, réchauffez brièvement le milieu basal de l’endoderme dans un bain à 37 °C et décongelez le supplément CJ. Préparez le milieu de stade 1B en ajoutant le supplément CJ au milieu basal de l’endoderme. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
9. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 1B et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
10. À l’étape 1 jour 3, répétez les étapes 2.8 à 2.9. Passez à l’étape 2.
11. Au stade 2 jour 1, réchauffez le milieu basal pancréatique de stade 2 à 4 dans un bain à 37 °C et décongelez les suppléments 2A et 2B. Préparez le milieu de stade 2A en ajoutant les suppléments 2A et 2B au milieu basal pancréatique de stade 2 à 4. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
12. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 2A et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
13. Au stade 2 jour 2, réchauffer le milieu basal pancréatique de stade 2 à 4 dans un bain à 37 °C et décongeler le supplément 2B. Préparer le milieu de stade 2B en ajoutant le supplément 2B au milieu basal pancréatique de stade 2 à 4. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
14. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 2B et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et à 5 % de CO₂ pendant 24 h.
15. À l’étape 2 jour 3, répétez les étapes 2.13 à 2.14. Passez à l’étape 3.
16. Au stade 3 jour 1, réchauffer le milieu basal pancréatique de stade 2-4 dans un bain à 37 °C et décongeler le supplément 3. Préparez le milieu de stade 3 en ajoutant le supplément 3 au milieu basal pancréatique de stade 2 à 4. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
17. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 3 et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
18. À l’étape 3 jour 2 et jour 3, répétez les étapes 2.16-2.17. Passez à l’étape 4.
19. Au stade 4 jour 1, réchauffer le milieu basal pancréatique de stade 2-4 dans un bain à 37 °C et décongeler le supplément 4. Préparez le milieu de stade 4 en ajoutant le supplément 4 au milieu basal pancréatique de stade 2 à 4. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
20. Aspirer le milieu usé des puits, ajouter le milieu de l’étape 4 et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
21. De l’étape 4 du jour 2 au jour 4, répétez les étapes 2.19-2.20. Passez aux étapes d’agrégation.

3. Agrégation en grappes de progéniteurs pancréatiques à l’aide de plaques de micropuits de 400 μm de diamètre

1. À l’étape 4 jour 5, prétraiter les micropuits (p. ex., format plaque à 24 puits) avec 500 μL de solution de rinçage anti-adhérence par puits.
2. Préparez une plaque d’équilibre et centrifugez la plaque de micropuits à 1 300 × g pendant 5 min.
   REMARQUE : Vérifiez la plaque au microscope pour vous assurer qu’il ne reste pas de bulles dans les micropuits. Centrifugez à nouveau pendant 5 minutes supplémentaires si des bulles restent piégées dans des micropuits.
3. Aspirer la solution de rinçage anti-adhérence des puits et rincer une fois avec 1 mL de DPBS. Aspirer le DPBS des puits et ajouter 1 mL de milieu d’agrégation dans chaque puits.
4. Retirez le milieu épuisé des cultures de progéniteurs pancréatiques et lavez-les une fois avec du DPBS. Dissocier les cultures en cellules individuelles avec un réactif de dissociation à 37 °C pendant 10 à 12 min. Rincez les cellules avec du DMEM/F12 chaud, transférez-les dans un tube et essorez-les à 300 × g pendant 5 min.
5. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu d’agrégation et effectuer le comptage des cellules vivantes. Ensemencer un total de 2,4 à 3,6 millions de cellules par puits (c.-à-d. 2 000 à 3 000 cellules par micropuits) et ajouter un milieu d’agrégation à chaque puits pour obtenir un volume final de 2 ml par puits.
6. Pipetez doucement les cellules de haut en bas plusieurs fois avec une pointe de pipette P1000 pour assurer une répartition uniforme des cellules dans tout le puits. N’introduisez pas de bulles dans les micropuits. Centrifuger la plaque de micropuits à 300 × g pendant 5 min pour capturer les cellules dans les micropuits. Incuber la plaque de micropuits dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h d’agrégation et procéder à la différenciation des étapes 5 à 7.
   REMARQUE : Veillez à ne pas déranger la plaque pendant le temps d’agrégation. Jusqu’à 48 h de temps d’incubation peuvent être nécessaires pour une formation optimale des agrégats.

4. Différenciation des groupes de progéniteurs pancréatiques dérivés de kits en îlots hPSC

1. Au stade 5 jour 1, réchauffer le milieu de base des stades 5 à 7 dans un bain à 37 °C et décongeler les suppléments (voir les tableaux 1 et 2). Préparer le milieu de l’étape 5 en ajoutant des suppléments (aux concentrations finales de travail) au milieu basal de l’étape 5-7. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
2. Après la formation des agrégats, pipetez doucement les agrégats de haut en bas plusieurs fois avec une pointe de pipette P1000 pour faire flotter les cellules non agrégées. Laisser les agrégats se déposer par gravité (attendre ~1 min). Retirer délicatement le milieu usé (contenant les cellules flottantes non agrégées) du puits autant que possible tout en évitant d’aspirer des agrégats.
3. Distribuer vigoureusement le milieu frais de l’étape 5 sur la surface de la plaque de micropuits pour déloger les agrégats des micropuits. Transvaser les agrégats dans des puits à 6 puits. Rincez une fois avec le milieu de l’étape 5 pour récupérer complètement les agrégats des micropuits.
4. Recueillir tous les agrégats dans les 6 puits ULA, remettre en suspension les agrégats dans le milieu de l’étape 5 et ajuster la densité à 20 grappes par 100 μL (p. ex., ~1 200 grappes devraient être extraites de chaque puits. Remettre en suspension 1 200 grappes dans 6 mL de milieu de stade 5). À l’aide d’une pipette multicanaux, distribuer 50 μL de milieu de l’étape 5 dans chaque puits d’une plaque ULA à fond plat de 96 puits. Remplissez les puits d’angle et de bord avec 200 μL de DPBS.
   REMARQUE : Évitez d’utiliser les puits de bord pour la culture des agrégats, car ils sont sujets à une plus grande évaporation ; Sinon, utilisez une plaque à 96 puits conçue pour minimiser l’évaporation le long des bords (par exemple, des plaques à 96 puits avec des douves intégrées) ou placez la plaque de culture dans un incubateur de culture cellulaire à microclimat très humide.
5. Ajouter 100 μL de la resuspension en grappes dans chaque puits de la plaque ULA à fond plat de 96 puits, ce qui donne un milieu de culture total de 150 μL contenant en moyenne 20 grappes par puits.
   REMARQUE : Mélangez doucement la remise en suspension de la grappe à chaque fois avant de la distribuer dans 96 puits.
6. Placer les plaques de culture sur une surface plane dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
7. À l’étape 5 jour 2, préparez l’étape 5 moyenne en suivant l’étape 4.1.
8. Utilisez une pipette multicanal pour éliminer ~90 μL du milieu usé de chaque puits, puis rafraîchissez avec 100 μL de milieu de l’étape 5.
9. À l’étape 5 jour 3, répétez les étapes 4.7 à 4.8. Passez à l’étape 6.
10. Au stade 6 jour 1, réchauffer le milieu basal des stades 5 à 7 dans un bain à 37 °C et décongeler les suppléments (voir les tableaux 1 et 2). Préparer le milieu de l’étape 6 en ajoutant des suppléments (aux concentrations finales de travail) au milieu de base de l’étape 5-7. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
11. Utilisez une pipette multicanal pour éliminer ~90 μL du milieu usé et rafraîchir avec 100 μL de milieu de l’étape 6 par puits.
12. De l’étape 6 du jour 2 au jour 8, répétez les étapes 4.10 à 4.11. Passez à l’étape 7.
13. Au stade 7 jour 1, réchauffer le milieu basal des stades 5 à 7 dans un bain à 37 °C et décongeler les suppléments (voir les tableaux 1 et 2). Préparer le milieu de l’étape 7 en ajoutant des suppléments (aux concentrations finales de travail) au milieu de base de l’étape 5-7. Bien mélanger et utiliser immédiatement.
14. Utilisez une pipette multicanal pour éliminer ~90 μL du milieu usé et rafraîchir avec 100 μL de milieu de l’étape 7 par puits.
15. De l’étape 7 du jour 2 au jour 12, répétez les étapes 4.13 à 4.14. Procéder à la caractérisation in vitro .

5. Analyse par cytométrie en flux

1. Retirez le milieu de culture et lavez-le une fois avec du DPBS. Dissocier les cultures (cellules progénitrices planes ou amas de différenciation) en cellules individuelles avec réactif de dissociation en incubant à 37 °C pendant 10 à 12 min. Rincer avec le tampon FACS et essorer à 300 × g pendant 5 min.
2. Remettez en suspension la pastille de cellule dans le tampon FACS et effectuez le comptage des cellules. Faire tourner les cellules à 300 × g pendant 5 min. Remettre en suspension des cellules individuelles dans 500 μL de tampon Fix/Perm pendant 10 min à température ambiante.
   REMARQUE : Amenez le tampon Fix/Perm à température ambiante avant utilisation. Le tampon Fix/Perm contient du paraformaldéhyde (PFA). Manipulez soigneusement les PFA dans une hotte et éliminez-les conformément aux directives de l’établissement.
3. Essorer à 500 × g pendant 3 min, laver deux fois avec 500 μL de 1x tampon Perm/Wash et remettre en suspension dans 300 μL de 1x tampon Perm/Wash. Transférez 100 μL de resuspension unicellulaire (contenant chacun 2,5-3 × 10⁵ cellules) dans trois tubes de micro-fuges pour le contrôle non coloré, le contrôle des isotypes et la coloration des anticorps (voir le tableau des matériaux pour obtenir des informations sur les échantillons d’anticorps et la dilution). Incuber pendant 45 min à température ambiante et couvrir de papier d’aluminium.
4. Essorer à 500 × g pendant 3 min. Laver deux fois avec 500 μL de tampon 1x Perm/Wash. Remettre les échantillons en suspension dans 100 μL de tampon FACS et analyser les cellules colorées (voir le tableau des matériaux pour la coloration intracellulaire des marqueurs à des stades spécifiques) à l’aide d’un cytomètre en flux et d’un logiciel (p. ex., FlowJo).
   REMARQUE : Si les échantillons ne sont pas analysés immédiatement, conservez-les à 4°C à l’abri de la lumière. Pour la stratégie de déclenchement, les données d’écoulement sont d’abord contrôlées par des propriétés de diffusion (FSC-A et SSC-A) pour éliminer les petits débris cellulaires, puis par des propriétés FSC-A et FSC-width pour identifier les singulets. Les contrôles positifs et négatifs sont déterminés par des témoins à base de cellules souches et/ou des témoins isotypes non colorés.

6. Immunomarquage de l’ensemble du montage

1. Recueillir les grappes dans un tube de microfuge. Colonisez les grappes par gravité. Aspirer le milieu épuisé et rincer une fois avec 1 mL de PBS (avec calcium et magnésium). Fixez les grappes avec 1 mL de PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit.
2. Rincer une fois avec du PBST et perméabiliser 20 à 30 grappes avec 500 μL de TritonX-100 à 0,3 % dans un tube de microfuge à température ambiante pendant au moins 6 h sur un agitateur inclinable.
   REMARQUE : Un temps de perméabilisation plus long (jusqu’à 24 h) est nécessaire pour les grandes grappes.
3. Incuber les grappes dans 100 μL de tampon bloquant à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur inclinable. Retirez le tampon bloquant et incubez les grappes avec 100 μL d’anticorps primaires dilués dans un tampon de dilution d’anticorps à température ambiante pendant la nuit sur un agitateur inclinable.
   REMARQUE : Si le bruit de fond est fort pendant l’imagerie, incuber avec des anticorps primaires à 4 °C.
4. Laver soigneusement 3 x 30 min avec 500 μL de PBST sur un agitateur inclinable (angle d’inclinaison réglé à 8, vitesse réglée à 20).
5. Incuber les grappes avec 100 μL d’anticorps secondaires dans un tampon de dilution d’anticorps à température ambiante pendant la nuit sur un agitateur inclinable. Recouvrez les tubes de papier d’aluminium.
   REMARQUE : Si le bruit de fond est fort pendant l’imagerie, incuber avec des anticorps secondaires à 4 °C.
6. Rincer une fois avec 500 μL de PBST. Ajouter 100 μL de solution de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (10 μg/mL dans le PBST) et colorer à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Couvrir d’une feuille d’aluminium et protéger de la lumière.
7. Laver soigneusement 3 x 30 min avec 500 μL de PBST sur un agitateur inclinable. Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pendant l’étape de lavage.
8. Fixer les grappes sur des lames de chambre d’imagerie (voir le tableau des matériaux) préenduites d’adhésif tissulaire conformément au protocole du fabricant et aux protocoles publiés^20,21.
9. Monter avec un milieu de nettoyage des tissus (80% de glycérol dans une solution de PBS) et couvrir avec des lamelles en verre. Protéger de la lumière jusqu’à l’imagerie confocale.
   REMARQUE : Si les échantillons ne sont pas photographiés immédiatement, conservez-les à 4 °C à l’abri de la lumière.

7. Essai statique GSIS

1. Réchauffez le tampon de bicarbonate Kreb’s Ringer à faible teneur en glucose (3,3 G KRB), le tampon KRB à haute teneur en glucose (16,7 G) et le tampon KCl KRB de 30 mM dans un bain à 37 °C.
2. Cueillez à la main des grappes de taille assortie et rincez-les avec 2 ml de tampon KRB chaud de 3,3 G. Transférer les grappes dans une plaque à 6 puits non traitée pour culture tissulaire et les équilibrer dans un tampon KRB de 3,3 G chaud de 2 ml ou chaud pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 °C et à 5 % de CO₂ .
3. Après équilibration, remplir la chambre d’essai (voir le tableau des matériaux) avec 100 μL de tampon KRB chaud de 3,3 G. Cueillez à la main cinq grappes et transférez-les au centre de la chambre d’essai. Incuber pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5% CO₂ .
   REMARQUE : Utilisez des pointes de pipette de 10 μL pour transférer des grappes avec un volume moyen minimal.
4. Prélever soigneusement ~100 μL de surnageant et le conserver à -30 °C jusqu’à mesure de la sécrétion basale d’insuline (voir étape 7.9). Ne séchez pas et ne perdez pas de grappes à cette étape. Ajouter immédiatement 100 μL de tampon KRB chaud de 16,7 G dans la chambre d’essai et incuber les mêmes grappes pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO₂ .
5. Recueillir soigneusement ~100 μL de surnageant et le conserver à -30 °C jusqu’à mesure de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (voir étape 7.9). Ajouter immédiatement 100 μL de tampon KCl KRB chaud de 30 mM dans la chambre d’essai et incuber les mêmes grappes pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂ .
6. Prélever soigneusement ~100 μL de surnageant et conserver à -30 °C jusqu’à mesure de la sécrétion d’insuline stimulée par le KCl (voir étape 7.9). Ajouter immédiatement 100 μL de tampon de lyse RIPA dans la chambre d’essai et transférer le tampon de lyse contenant les cinq grappes dans un tube de microfuge.
7. Facultatif) Cassez les grappes manuellement par trituration vigoureuse avec une pointe de pipette P200. Tourbillonner pendant 30 s et incuber sur de la glace pendant 30 minutes, suivi de 30 autres secondes de vortex.
   REMARQUE : Assurer une lyse complète par vortex et un temps d’incubation suffisant sur la glace.
8. Essorer à 8 000 × g pendant 1 min. Prélever le surnageant et le conserver à -30 °C jusqu’à mesure de la teneur totale en insuline (voir étape 7.9).
9. Mesurer l’insuline humaine dans les échantillons surnageants à l’aide d’une trousse ELISA pour l’insuline humaine conformément au protocole du fabricant et aux protocoles publiés^20,22.
   REMARQUE : Éviter la congélation et la décongélation répétées d’échantillons surnageants. Les échantillons comportant plus de trois cycles de congélation et de décongélation ne doivent pas être analysés.

Résultats

Nous avons développé une stratégie hybride pour différencier les cellules souches en îlots hPSC sécréteurs d’insuline en sept étapes, qui utilise un kit de progéniteurs pancréatiques pour les quatre premières étapes de la culture planaire, suivi d’un protocole modifié basé sur une méthode⁶ précédemment rapportée dans une culture en suspension statique pour les trois dernières étapes (Figure 1). Avec ce protocole, il est essentiel d’assurer un...

Discussion

Cet article décrit un protocole hybride en sept étapes qui permet de générer des îlots hPSC capables de sécréter de l’insuline lors d’une provocation au glucose dans les 40 jours suivant la culture in vitro. Parmi ces multiples étapes, l’induction efficace de l’endoderme définitif est considérée comme un point de départ important pour les résultats finaux de différenciation^18,27,28. Selon le protoc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma	T6397	Thyroid hormone
4% PFA solution	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom	Corning Costar (VWR)	CLS3474	Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates	STEMCELL Technologies	34415	400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates	STEMCELL Technologies	34815	800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)	R&D Systems	IC2400G	1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control	R&D Systems	IC108G	1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)	BD Sciences	566032	1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control	R&D Systems	IC0041G	1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)	BD Pharmingen	565831	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565689	1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	563338	1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	562594	1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	557714	1:50 in flow cytometry
ALK5i II	Cayman Chemicals	14794	TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Microwell Rinsing Solution
Assay chamber	Cellvis	D35-10-1-N	For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	BP1600-100	For immunostaining procedure
CK19 antibody	DAKO	M0888	1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose	Sigma	G8769	Medium supplement
DAPI	Sigma	D9542	For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330032	Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555	Life technologies	A21432	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647	Life technologies	A21447	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555	Life technologies	A31570	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Life technologies	A31571	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555	Life technologies	A31572	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647	Life technologies	A31573	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647	Life technologies	A21448	1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS	Sigma	D8537	Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human	Alpco	80-INSHU-E01.1	For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA	Proliant	68700	Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit	BD Sciences	554714	Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody	Sigma	G2654	1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA1-37782	1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)	Gibco	35050061	L-glutamine supplement
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-4	For tissue clearing and mounting
GSi XX	Sigma Millipore	565789	Notch inhibitor
Heparin	Sigma	H3149	Medium supplement
ITS-X (100x)	Thermo Fisher Scientific	51500056	Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189	STEMCELL Technologies	72147	BMP antagonist
MAFA antibody	Abcam	ab26405	1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium	Life technologies	10372019	Base medium
mTeSR1 Complete Kit	STEMCELL Technologies	85850	stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)	Sigma	A9165	Antioxidant
NaHCO3	Sigma	S6297	Medium supplement
NEUROD1 antibody	R&D Systems	AF2746	1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody	DSHB	F55A12-c	1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody	R&D Systems	AF6297	1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS	Sigma	D8662	With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody	Abcam	ab47267	1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565860	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	563023	1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	562161	1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	554680	1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)	BD Sciences	564563	1:200 in flow cytometry
R428	Cayman Chemicals	21523	AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans	Sigma	R2625	Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x	Sigma	20-188	For hormone extraction
SANT-1	Sigma	S4572	SHH inhibitor
SLC18A1 antibody	Sigma	HPA063797	1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody	Sigma	HPA019472	1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit	STEMCELL Technologies	05120	Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody	Novus	NB120-16659	1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100	Sigma	X100	For permeabilization
Trolox	Sigma Millipore	648471	Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express	Life technologies	12604-021	cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody	R&D Systems	AF3586	1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304	ROCK inhibitor
Zinc sulfate	Sigma	Z0251	Medium supplement